Name: Análisis de metilación de ADN completo usando un método de captura de dominio de unión a metil-CpG en pacientes con leucemia linfocítica crónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Aprende a analizar metilación de ADN completo usando secuenciación de dominio MBD en pacientes con leucemia linfocítica crónica. Este método identifica regiones diferencialmente metiladas sin sesgo ni PCR.

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Este estudio fue apoyado por el Consejo Sueco de Investigación, la Sociedad de Cáncer de Suecia, Knut y la Fundación Alice Wallenberg (KAW), y FoU VästraGötalandsregionen.

La aprobación ética para la recolección de muestras CLL es del 2007-05-21, con el siguiente número de registro: EPN Gbg dnr 239/07. Todos los pacientes con CLL fueron diagnosticados de acuerdo con criterios recientemente revisados 8 , y las muestras fueron recolectadas en el momento del diagnóstico. Los pacientes en el estudio se incluyeron de diferentes departamentos de hematología en la parte occidental de Suecia, después de haber obtenido el consentimiento por escrito. Sólo se seleccionaron en este estudio muestras de células mononucleares de sangre periférica de CLL (PBMC) con un porcentaje tumoral de células leucémicas ≥ 70%. 1. Preparaciones <ol><li> Aísle las PBMCs para extracciones de ADN de CLL y muestras normales de sangre periférica sanas usando un kit de aislamiento comercial (consulte la Tabla de Materiales ), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Autoclave tubos de 1,5 ml. Descongelar todos los reactivos en el kit de unión al ADN metilado (véase la tabla de materiales ). &lt;Li <li> Utilice agua libre de DNasa para preparar 10 mL de tampón de lavado de 1x bead del tampón de lavado de reserva 5x proporcionado por el kit para lavar perlas y diluir la proteína MBD proporcionada por el kit. </li><li> Obtener o preparar los siguientes elementos de antemano: acetato de sodio 3 M, etanol absoluto y etanol al 70% para la precipitación del ADN ( tabla de materiales ). </li></ol> 2. Extracción y Sonicación de ADN Genómico <ol><li> Utilizar un kit de extracción de ADN comercialmente disponible ( Tabla de Materiales ) para aislar ADN genómico de muestras de PBMC normales y de pacientes de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuantificar el ADN genómico utilizando un espectrofotómetro a 260 nm. NOTA: La capacidad de la columna de extracción de ADN es de 5-6 millones de células, máximo; Por lo tanto, es importante utilizar más de una columna para muestras con más de 5 millones de células. Eluir el ADN dos veces en volúmenes iguales totalizando 100 μl de tampón Tris EDTA (TE) 10 mM. La proteína MBD-biotina utilizada en el metilMinero para la secuenciación MBD no se unirá a ADN de una sola hebra. Por lo tanto, es muy importante mantener el ADN eluido ya sea congelado o a 4ºC para preservar su naturaleza de doble hebra. </li><li> Diluir 5 μg de ADN genómico de cada muestra hasta un total de 200 μL usando tampón TE (pH 8), dando una concentración final de 25 ng / μl. </li><li> Realizar la sonicación en tubos especialmente diseñados usando un sonicador ( Tabla de Materiales ) para un total de 30 ciclos (30 s en y 30 s apagado por ciclo, después de cada 5 ciclos, centrifugar brevemente los tubos para recoger las muestras a la parte inferior). NOTA: Esto producirá ADN fragmentado que oscila entre 150 pb y 300 pb, lo cual es óptimo para este protocolo. </li><li> Compruebe el rango de sonicación de todas las muestras antes de continuar con el siguiente paso de MBD secuenciación mediante la ejecución de 1 μ l de las muestras de ADN fragmentado y una escala de ADN en un comercialmente disponible, pre-molde 2% de gel de agarosa utilizando ADN electroforesis equipo de imagen. VisualizarUtilizando un transiluminador UV estándar. </li></ol> 3. Preparación del cordón antes de la unión con la proteína MBD-biotina <ol><li> Resuspender las bolas de estreptavidina magnética del tubo de reserva proporcionado por el kit, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión homogénea. No vórtice las perlas ni permita que se sequen. </li><li> Coloque 50 μl de perlas (por cada 5 μg de muestra de ADN fragmentada) en tubos separados, limpios y marcados de 1,5 mL. Añadir 50 μl de tampón de lavado de perlas 1x para alcanzar el volumen final de 100 μl. NOTA: Cuando se usan pequeñas bandas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) de 0,5 ml para lavar perlas, se usan alrededor de 150-200 μl de tampón de lavado por tubo, como se menciona en el protocolo del kit. Sin embargo, en el caso de tubos de 1,5 ml, añada al menos 250 μL a 300 μl de tampón de lavado por tubo para el lavado con perlas. </li><li> Coloque los tubos sobre un soporte magnético durante un minuto para permitir que todas las bolas magnéticas se concentren en la pared interna del tuboFrente al imán. Retire el líquido, sin tocar las perlas, usando una pipeta de 200 μl. </li><li> Retire los tubos del soporte magnético, agregue 250 μl de tampón de lavado de 1x bead y mezcle las perlas suavemente con una pipeta. </li><li> Repita los pasos 3.3 y 3.4 al menos 4-5 veces para todas las muestras y finalmente resuspender en 250 μl de tampón de lavado de 1x bead. Mantenerlos en hielo. </li></ol> 4. Vinculación de la proteína MBD-biotina a los granos lavados <ol><li> Añadir 35 μL de la proteína MBD (7 μL para 1 μg de muestra de ADN) a tubos separados y llevar el volumen total hasta 250 μL utilizando un tampón de lavado de 1x bead. </li><li> Añadir 250 μl de la proteína MBD diluida a 250 μL de perlas lavadas y dejarlas en rotación de extremo a extremo a temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Después de mezclar las perlas y la proteína durante 1 h, lavar la proteína MBD biotina unida con perlas de estreptavidina magnética. <ol><li> Coloque los tubos en el soporte magnético durante 1 minuto yÉl líquido sin tocar las cuentas usando una pipeta. Añadir 250 μl de tampón de lavado de 1x perlas y colocar los tubos en un mezclador de rotación durante 5 min a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Repita el paso 4.3.1 dos veces más y finalmente resuspenda las perlas de MBD-biotina lavadas en 200 μl de tampón de lavado de perlas 1x, haciendo las perlas listas para la captura de ADN metilado. NOTA: El lavado 2-3 veces de esta manera elimina todas las perlas de proteína de MBD no unidas de fondo y mejora la unión eficaz de las perlas acopladas a proteína MBD con ADN genómico fragmentado. </li></ol> 5. Encuadernación de perlas de MBD-biotina con ADN genómico fragmentado <ol><li> En un tubo limpio de 1,5 ml sin DNasa, añadir 100 μl de tampón de lavado de 5x cuentas y 180 μL del ADN genómico fragmentado (paso 2.3). Llevar el volumen final a 500 μL usando agua libre de DNasa. </li><li> Añadir 380 μL de agua libre de DNasa a los 20 μL restantes del ADN genómico fragmentado y congelarlos. Utilice estas muestras como entrada DNA controla y precipita más tarde junto con las muestras de ADN metilado eluidas finales (véase el paso 7.1). </li><li> Colocar los tubos que contienen MBD-biotina lavada perlas (paso 4.4) en un soporte magnético durante 1 min y retirar el líquido sin perturbar las perlas. Añadir 500 μl de ADN genómico fragmentado diluido en tampón de lavado de perlas. </li><li> Sellar todos los tubos firmemente con película de parafina y dejarlos durante la noche a 4 ° C en un soporte de rotación de extremo a extremo a 8-10 rpm. NOTA: El ADN y la reacción de unión a perlas de biotina pueden hacerse durante 1 hora a temperatura ambiente, pero dejarla a 4ºC durante la noche puede mejorar la recuperación del ADN metilado final. </li></ol> 6. Eliminación del ADN no unido y elución del ADN metilado de las perlas <ol><li> Después de la reacción de unión de ADN y MBD-perla, colocar los tubos en el estante magnético durante 1 minuto para concentrar todas las perlas en la pared interior del tubo. </li><li> Retire el líquido sobrenadante con una pipeta sin tocarloLas perlas y guardar esta fracción de la muestra de ADN no unido en el hielo. </li><li> Añadir 200 μl de tampón de lavado de 1x perlas a las perlas y colocar los tubos en el soporte giratorio durante 3 minutos a temperatura ambiente. Coloque los tubos en el soporte magnético y retire el líquido. Repita el lavado dos veces más para eliminar el ADN residual no unido. </li><li> Después del lavado final, añadir 200 μl de tampón de elución con alto contenido de sal (NaCl 2000 mM), proporcionado en el kit para eluir el ADN. </li><li> Colocar los tubos en el soporte giratorio durante 15 minutos a temperatura ambiente. Colóquelos en el soporte magnético durante 1 minuto y utilice una pipeta para transferir cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo limpio de 1,5 ml. </li><li> Añadir 200 μl de tampón de elución con alto contenido de sal y repetir la elución haciendo girar los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos. Añadir el segundo eluido al mismo tubo que contiene los 200 μl del primer eluido. NOTA: Los 400 μL finales de ADN eluído total están ahora listos para la precipitación con etanol para extraer la solución purificadaADN adecuado para la próxima generación de secuenciación. </li></ol> 7. Precipitación de etanol y el enriquecimiento de ADN metilado <ol><li> Añadir 1 μl de glucógeno (20 μg / μl, incluido en el kit); 40 μl de acetato sódico 3 M, pH 5,2; Y 800 μl de etanol absoluto helado a 400 μl de ADN eluido y también a 400 μl de muestras de ADN de entrada preparadas en el paso 5.2. </li><li> Mezclar bien los tubos por vórtex e incubarlos a -80 ° C durante la noche. </li><li> Centrifugar los tubos a 12.000 xg (velocidad máxima) y 4 ° C. Deseche el sobrenadante con cuidado, sin alterar el pellet, agregue 500 μl de etanol al 70%, y agite los tubos. </li><li> Centrifugar nuevamente a velocidad máxima durante 15 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante cuidadosamente usando una pipeta. Centrifugar los tubos a velocidad máxima durante 1 min a temperatura ambiente y eliminar el etanol residual completamente usando una punta de pipeta. </li><li> Secar al aire el pellet durante 5 min a temperatura ambienteRature Añadir 10 μL de agua exenta de DNasa a la pastilla de ADN. Proceder a la cuantificación del ADN metilado (etapa 7.6), la secuenciación de MBD (etapa 7.7) y el análisis (secciones 8 y 9). </li><li> Cuantificar las muestras de ADN metilado recuperadas finales utilizando un kit de cuantificación fluorométrica comercialmente disponible (véase la Tabla de Materiales ), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Nota: Usando este protocolo, se recuperaron 30-50 ng de ADN final de cada muestra. Las muestras de ADN están listas para enviar en hielo seco para la construcción de la biblioteca posterior y la secuenciación MBD de alto rendimiento </li><li> Realizar la construcción de la biblioteca de ADN y la secuenciación MBD de alto rendimiento utilizando una plataforma comercial ( Tabla de Materiales ), como se describe en la referencia 9 . NOTA: Para el control de calidad inicial del ADN metilado final, realice preparaciones de la biblioteca usando secuenciación de 50 pares de pares de extremo para todas las muestras. Procesar los datos sin procesar para el control de calidad posterior a la secuenciación.S elaborado en el paso 8.1, y procesarlo posteriormente utilizando enfoques bioinformáticos y métodos estadísticos, como se describe a continuación (pasos 8.2-9.6). </li></ol> 8. Análisis de la bioinformática Método 1: Identificación de las regiones diferenciadamente metiladas asociadas a CLL (cllDMR) <ol><li> Limpie las lecturas obtenidas de 49 pb (formato FASTQ) para adaptadores utilizando herramientas de control de calidad disponibles, como Trimmomatic 10 o Cutadapt. Revise la calidad de las lecturas recortadas usando el kit de herramientas FastQC: Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adaptadores.fasta: 2: 30: 10 </li><li> Alinee los archivos FASTQ limpios con Bowtie de alineación del genoma de lectura corta con un genoma de referencia 11 . Especifique los parámetros como a continuación: <ol><li> Permitir hasta dos desajustes (parámetro Bowtie: -v 2). </li><li> Limitar el informe a las seis mejores alineaciones por lectura (parámetro Bowtie: -m 6) para controlarPara leer varias cartas. Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq&gt; SAMPLE.sam NOTA: Convierta los archivos SAM generados para muestras individuales después de la alineación en BAM utilizando SAMtools. Samtools vista -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam </li></ol></li><li> Utilizar el análisis basado en modelos de ChIP-Seq (MACS) pico de llamadas en muestras alineadas (BAM) para predecir enriquecido / metilado regiones de la CLL subgrupos [ 12] . NOTA: Comparación I: Utilice la muestra de entrada como grupo de control y las muestras de pacientes normales y CLL como grupos de tratamiento. Este paso es recoger todos los picos negativos (picos enriquecidos en entrada / fondo). Comparación II: Utilice el grupo de muestra Normal como el grupo de control y el grupo de muestra de CLL como grupo de tratamiento. Los picos positivos obtenidos son regiones hipermetiladas de CLL, y los picos negativos son regiones hipometiladas de CLL sobre regiones normales o diferenciadamente metiladas (DMRs). Macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --formato BAM -g hs </li><li> Quitar los picos de fondo de la Comparación I de las regiones diferenciadamente metiladas (DMR) usando BEDtools 13 . Bedtools subtract -a &lt;CLL_enriched_regions&gt; -b &lt;Input_enriched_regions&gt; </li><li> Predecir el porcentaje de elementos repetidos (SINE-Alu, LINE, etc. ) enriquecidos en DMRs. <ol><li> Utilice fastacmd para extraer la secuencia FASTA de DMRs por las coordenadas cromosómicas del genoma de referencia HG19. Fastacmd -d HG19_genome.fa -s Cromosoma -L Inicio, Fin -l 50000&gt; DMRs.fasta </li><li> Utilice la herramienta de línea de comandos de RepeatMasker para predecir el porcentaje de elementos de repetición presentes en la secuencia FASTA de DMR. RepeatMasker -gc -gccalc -s -species human -html DMRs.fasta </li></ol></li><li> Anotar los DMR pronosticados usando Homer &quot;annotatePeaks.pl&quot; con el Ensembl disponible [PMC4919035] oR Gencode [PMID 22955987] transcripción anotación (codificación de proteínas y transcripciones no codificantes). AnnotatePeaks.pl DMRs.bed &lt;GENOME&gt; -gtf &lt;Ensembl o Gencode GTF&gt; NOTA: Esto proporciona información sobre la distribución de picos en diferentes regiones genicas ( es decir, promotor, exón, intrón, UTRs 3 &#39;y UTR 5&#39;) y regiones intergénicas. Los transcritos o genes asociados con DMRs se llaman genes diferenciadamente metilados (DMGs). </li><li> Utilice la herramienta de enriquecimiento con la base de datos actualizada o funcional actual para encontrar las funciones enriquecidas por CLL DMGs (sólo los genes de codificación de proteínas) [ 14] . NOTA: Gene Set Clustering basado en Anotaciones Funcionales (GeneSCF) 14 es una herramienta en tiempo real para el análisis de enriquecimiento funcional que utiliza KEGG actualizado y Gene Ontología como una base de datos de referencia. </li></ol> 9. Análisis de Bioinformática Método 2: Identificación de CLL asociada significativamente DiffRegiones altamente metiladas (cll sigDMR&#39;s) <ol><li> Siga los pasos 8.1-8.5 del método I (sección 8) y utilice el análisis de enriquecimiento diferencial basado en lectura-recuento utilizando las herramientas disponibles, como se explica en los pasos 9.2-9.6, para agregar un nivel más de estadísticas a la tubería de análisis. </li><li> Cuantifique el número de lecturas asignadas a picos individuales o DMRs en muestras de pacientes normales y CLL usando &quot;featureCounts&quot; del paquete &quot;Subread&quot; 15 . Subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam NOTA: Se puede introducir un filtro de calidad de mapeo para evitar cuantificar lecturas de mala calidad ( por ejemplo, -Q 30). Para este paso, prepare archivos SAF para los DMR obtenidos. Para obtener más información sobre el formato de archivo SAF, utilice este enlace http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/. </li><li> Utilice una tabla RAW de lectura-conteo que contenga el número de lecturas para los picos individuales en Normal yD CLL grupo de muestra de pacientes en edgeR como la entrada 16 . NOTA: Compare los grupos de muestra de pacientes normales versus CLL para encontrar sigDMRs. Para el análisis de enriquecimiento diferencial, siga la guía de edgeR para instrucciones detalladas paso a paso (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). </li><li> Filtrar los sigDMRs utilizando la tasa de descubrimiento falso (FDR) y el cambio de log-fold predicho por edgeR 16 . </li><li> Anote los pronosticados sigDMR usando Homer &quot;annotatePeaks.pl&quot; con la anotación de transcripción Ensembl o Gencode disponible (codificación de proteínas y transcripciones no codificantes). AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf &lt;Ensembl o Gencode GTF&gt; -CpG NOTA: Esto proporciona información sobre la distribución de picos en diferentes regiones genicas ( es decir, promotor, exón, intrón, UTRs 3 &#39;y UTR 5&#39;) y regiones intergénicas. Transcripciones o genes asociados con siLos gDMR se llaman sigDMGs. </li><li> Use una herramienta de enriquecimiento con la base de datos funcional actual o actualizada para encontrar funciones enriquecidas por CLL sigDMGs (sólo los genes codificadores de proteínas) [ 14] . NOTA: GeneSCF, una de las herramientas en tiempo real para el análisis de enriquecimiento funcional, usa KEGG y Gene Ontology como bases de datos de referencia. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

MBD-seq es una técnica rentable basada en inmunoprecipitación que se puede utilizar para estudiar los patrones de metilación con una cobertura completa del genoma. Tanto MeDIP seq (inmunoprecipitación de ADN metilado seguido de secuenciación) como MBD-seq resultan en el enriquecimiento de ADN metilado rico en CpG. Sin embargo, MBD-seq muestra más afinidad hacia la unión a regiones altamente ricas en CpG cuando se compara con MeDIP seq 19 . Usando un kit de enriquecimiento de unión a metilo, se pu...

El uso de técnicas de secuenciación de próxima generación para analizar los perfiles globales de metilación del ADN ha sido cada vez más popular en los últimos años. Se desarrollaron ensayos de metilación en todo el genoma, incluyendo métodos basados ​​en microarrays y no microarrays, basados ​​en lo siguiente: la conversión de bisulfito de ADN genómico, digesiones de enzimas de restricción sensibles a la metilación y la inmunoprecipitación de ADN metilado usando anticuerpos específicos de metil CpG . La metilación aberrante del ADN es una de las características de la leucemia y de los linfomas, incluida la leucemia linfocítica crónica (CLL). Anteriormente, varios grupos, incluidos los nuestros, caracterizaron los perfiles de metilación del ADN de diferentes subgrupos de pronóstico CLL y controles de células B normales y sanos utilizando la conversión de bisulfito de ADN genómico, seguido de métodos basados ​​en micro-matriz o secuenciación de todo el genoma 1 , 2 , 3 , &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 4. La conversión de bisulfito de ADN genómico conduce a la desaminación de citosinas no modificadas a uracilo, dejando las citosinas metiladas modificadas en el genoma. Una vez convertido, el estado de metilación del ADN puede determinarse mediante amplificación y secuenciación por PCR utilizando diferentes métodos cuantitativos o cualitativos, tales como la secuenciación de bisulfito de todo el genoma o de micro-matriz o WGBS. Aunque los métodos basados ​​en conversión de bisulfito tienen muchas ventajas y se usan ampliamente en diferentes tipos de cáncer para analizar los niveles de metilación del ADN, hay algunos inconvenientes asociados con esta técnica. La secuenciación WGBS permite una resolución de un par de bases con menores cantidades de ADN y es la mejor opción para analizar un gran número de muestras. Sin embargo, este método no logra diferenciar las modificaciones entre los niveles de 5 mC y 5 hmC en el genoma 5 , 6 . Además, los métodos basados ​​en microarrays no ofrecen completas cExceso del genoma. En un estudio reciente de nuestro laboratorio 7 , los métodos basados ​​en la inmunoprecipitación, en lugar de la conversión de bisulfito, se utilizaron para identificar regiones altamente metiladas, ricas en CpG, a escala global en pacientes con CLL y controles sanos normales. Inmetil-CpG-dominio de unión (MBD) de próxima generación de secuenciación (MBD-seq), el enriquecimiento de doble hilado de ADN fragmentado depende del grado de metilación CpG. Este método puede superar los inconvenientes del método de conversión de bisulfito y también puede proporcionar cobertura genómica de la metilación de CpG de una manera imparcial y independiente de la PCR. Además, a diferencia de los métodos de microarrays basados ​​en conversión de bisulfito, MBD-seq se puede utilizar para analizar el estado de metilación de elementos repetitivos, tales como elementos nucleares intercalados largos (LINEs), elementos nucleares intercalados cortos (SINEs), repeticiones terminales largas (LTRS) Etc. Sin embargo, en comparación con los métodos de conversión de bisulfito,Un protocolo MBD-seq requiere una cantidad relativamente grande de ADN de entrada. Además, la calidad de las lecturas de secuenciación y los datos dependen de la especificidad, afinidad y calidad de los anticuerpos utilizados. El presente estudio explica un detallado MBD-seq protocolo para enriquecer el ADN metilado para la próxima generación de secuenciación. Utiliza un kit comercial de enriquecimiento de ADN metilado (listado en la Tabla de Materiales ), así como un oleoducto computacional para visualizar e interpretar los datos de secuenciación de metilación para identificar regiones hiper y hipometiladas específicas de CLL en comparación con los controles sanos normales. Básicamente, este método hace uso de la capacidad de la MBD de la interacción de la proteína MBD2 humana con CpGs metiladas para extraer el ADN enriquecido con CpGs metiladas, y esto es seguido por la secuenciación de alto rendimiento del ADN metilado.

<table><tbody><tr><td>Dneasy Kit de sangre y tejidos</td><td>Qaigen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Solución linfoprescrita</td><td>A X I S-S H I E L D</td><td></td><td></td></tr> 1114544 <tr><td>Nano drop 2000</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE tampón pH 8</td><td>Sigma aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor dispositivo de sonicación estándar</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>TPX tubos bioruptor 1.5 mL</td><td>Diagenode</td><td>C30010010-300</td><td></td></tr><tr><td>3 M Acetato de sodio</td><td>Diagenode</td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>E-gel Kit combinado de imágenes seguras iBase</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G6465EU</td><td></td></tr><tr><td>E-gel 2% Geles de agarosa</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G441002</td><td></td></tr><tr><td>Methylminer Kit de enriquecimiento de ADN metilado</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>ME10025</td><td></td></tr><tr><td>Labquake Agitador/Rotadores de tubos</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>415110</td><td></td></tr><tr><td>Dynal MPC-S</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>VWR</td><td>12620-848</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanool</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de ADN</td><td>Milli Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precipitante de ADN (acetato de sodio 3M)</td><td>Diagenode</td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>Sello seguro Tubos Eppendorf de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensayo</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Tubos de 0,5 mL</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Illumina Hiseq2000 Plataforma</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water&nbsp; Baño</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotador de tubo</td><td>Labquake</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de metilación de adn completo usando un método de captura de dominio de unión a metil-cpg en pacientes con leucemia linfocítica crónica

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

El papel de los ARNs no codificantes largos (lncRNAs) en el cáncer está llegando a la vanguardia debido al interés creciente en la comprensión de sus funciones mecánicas durante el desarrollo y la progresión del cáncer. A pesar de ello, la regulación epigenética global de lncRNAs y secuencias repetitivas en el cáncer no ha sido bien investigado, en particular en la leucemia linfocítica crónica (CLL). Este estudio se centra en un enfoque único: la inmunoprecipitación de captura de doble hundidos, metilado ADN fragmentos utilizando metil-binding domain (MBD) proteínas, seguido por la próxima generación de secuenciación (MBD-seq). CLL muestras de pacientes pertenecientes a dos subgrupos de pronóstico (5 IGVH mutado muestras + 5 IGVH unmutated muestras) se utilizaron en este estudio. El análisis reveló 5.800 genes hipermetilados y 12.570 hipometilados CLL específicos diferencialmente metilados (cllDMGs) en comparación con los controles sanos normales. Es importante destacar que estos resultados identificaron varios LncRNA específicos CLL, diferencialmente metilados, reY los genes codificadores de proteínas con un posible valor pronóstico. Este trabajo esboza un protocolo detallado para un MBD seq y bioinformática pipeline desarrollado para el análisis exhaustivo de la metilación global perfiles en altamente CpG regiones ricas utilizando CLL muestras de pacientes. Por último, un gen de codificación de proteínas y un lncRNA fueron validados mediante pirosequencing, que es un método altamente cuantitativo para analizar los niveles de metilación CpG para corroborar aún más los hallazgos del protocolo MBD-seq.

MBD-seq se realizó recientemente en CLL pacientes y controles igualados, normales, sanos para identificar CLL específicos hipertensos y hypomethylated genes [ 7] . La tubería experimental y bioinformática utilizados para analizar los datos generados a partir de CLL y muestras sanas normales se muestran en la Figura 1A y 1B . Estos análisis identificaron varias regiones diferenciadamente metiladas CLL-específicas (cllD...

Este trabajo describe un optimizado metil-CpG vinculante dominio de secuenciación de protocolo y una tubería computacional para identificar diferencial metilado CpG-ricos en regiones crónicas linfocítica leucemia (CLL) pacientes.

Análisis de metilación de ADN completo usando un método de captura de dominio de unión a metil-CpG en pacientes con leucemia linfocítica crónica

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el perfilado global de metilación e identificar regiones ricas en CpG diferencialmente metiladas en pacientes con leucemia linfocítica crónica mediante secuenciación de nueva generación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética, como la identificación de genes firmas específicos potenciales del CLL, la patogénesis de la enfermedad y el pronóstico. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una cobertura completa y de todo el genoma de la metilación de CpG de manera imparcial e independiente de la PCR.Para comenzar, utilice un kit comercial disponible para la extracción de ADN con el fin de aíslar el ADN genómico de las muestras de pacientes y de células mononucleares de sangre periférica normales, según el protocolo del fabricante. Después de cuantificar el ADN genómico como se describe en el protocolo escrito, diluya 5 microgramos de ADN genómico de cada muestra hasta un volumen total de 200 microlitros usando tampón TE, obteniendo una concentración final de 25 nanogramos por microlitro. A continuación, realice la sonicación en tubos especialmente diseñados, utilizando un sonicador, durante un total de 30 ciclos de 30 segundos encendido y 30 segundos apagado.Después de cada cinco ciclos, centrifugar brevemente los tubos para recoger las muestras en el fondo. Verificar el rango de sonicación de todas las muestras mediante electroforesis de ADN, como se describe en el protocolo del texto. Para preparar las perlas magnéticas de estreptavidina, primero volver a suspenderlas desde el tubo de stock proporcionado por el kit.Pipetee suavemente las perlas hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión homogénea. Por cada cinco microgramos de muestra de ADN fragmentado, coloque 50 microlitros de las perlas en tubos separados, limpios y etiquetados de 1,5 mililitros. Añada 50 microlitros de tampón de lavado de perlas 1X para alcanzar un volumen final de 100 microlitros.Coloque los tubos en un soporte magnético durante un minuto para permitir que todas las perlas magnéticas se concentren en la pared interna del tubo frente al imán. Retire el líquido sin tocar las perlas, utilizando una pipeta de 200 microlitros. A continuación, retire los tubos del soporte magnético, agregue 250 microlitros de tampón de lavado de perlas 1X y mezcle suavemente las perlas con una pipeta.Después de repetir estos pasos al menos cuatro veces para todas las muestras, finalmente resuspenda las muestras en 250 microlitros de tampón de lavado de perlas 1X. Mantenga las muestras en hielo. Para unir la proteína MBD-biotina a las perlas lavadas, primero agregue 35 microlitros de proteína a tubos separados y complete el volumen hasta 250 microlitros utilizando tampón de lavado de perlas 1X.Añada 250 microlitros de proteína MBD diluida a los 250 microlitros de perlas lavadas y déjelos en rotación de extremo a extremo a temperatura ambiente. Después de mezclar las perlas con la proteína durante una hora, lave las perlas magnéticas de estreptavidina unidas a la proteína colocando los tubos en el soporte magnético durante un minuto. Retire el líquido sin tocar las perlas utilizando una pipeta.A continuación, agregue 250 microlitros de tampón de lavado de perlas 1X y coloque los tubos en un mezclador rotatorio durante cinco minutos a temperatura ambiente. Repita el paso de lavado otras dos veces antes de resuspender las perlas de MBD-biotina lavadas en 200 microlitros de tampón de lavado de perlas 1X, preparando así las perlas para la captura de ADN metilado. En un tubo limpio de 1,5 mililitros libre de DNasa, agregue 100 microlitros por mililitro de tampón de lavado de perlas y 180 microlitros del ADN genómico fragmentado.Lleve el volumen final a 500 microlitros utilizando agua libre de DNasa. Añada 380 microlitros de agua libre de DNasa al resto de 20 litros de ADN genómico fragmentado. Congele las muestras para procesarlas posteriormente y utilizarlas como controles de ADN de entrada.Coloque los tubos que contienen las perlas MBD-biotina lavadas en un soporte magnético durante un minuto y retire el líquido sin perturbar las perlas. A continuación, agregue 500 microlitros de ADN genómico fragmentado diluido en tampón de lavado de perlas. Selle todos los tubos firmemente con película de parafina y déjelos toda la noche a 4 grados Celsius en un agitador rotatorio de extremo a extremo a 8-10 rotaciones por minuto.Después de la reacción de unión del ADN y las perlas MBD, coloque los tubos en el soporte magnético durante un minuto para concentrar todas las perlas en la pared interna del tubo. Retire el líquido sobrenadante con una pipeta sin tocar las perlas y guarde esta fracción de muestra de ADN no unido en hielo. A continuación, agregue 200 microlitros de tampón de lavado de perlas 1X a las perlas y coloque los tubos en el agitador rotatorio durante tres minutos a temperatura ambiente.Después de eliminar el líquido utilizando el soporte magnético, repita el lavado otras dos veces para eliminar el ADN no unido residual. Después del lavado final, agregue 200 microlitros de tampón de elución de alta salinidad proporcionado en el kit para eluir el ADN. Luego, coloque los tubos en el soporte rotatorio durante 15 minutos a temperatura ambiente.Tras la incubación, colóquelos en el soporte magnético durante un minuto y utilice una pipeta para transferir cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo limpio de 1,5 mililitros. A continuación, agregue 200 microlitros de tampón de elución de alta salinidad a las perlas y repita la elución rotando los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos adicionales. Añada el segundo eluido al mismo tubo que contiene los 200 microlitros del primer eluido.Para precipitar el ADN, agregue un microlitro de glicógeno, 40 microlitros de acetato de sodio tres molar, pH 5,2, y 800 microlitros de etanol absoluto frío a 400 microlitros de ADN eluido. También agregue los reactivos a las muestras de control de ADN de entrada previamente congeladas de 400 microlitros. Mezcle bien los tubos mediante vortex antes de incubarlos a menos 80 grados Celsius durante la noche.Al día siguiente, centrifugue los tubos a 12 000 × g y 4 grados Celsius durante 30 minutos. Deseche cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el precipitado. Luego, agregue 500 microlitros de etanol al 70 % y vortexee los tubos.Después de centrifugar nuevamente los tubos usando las mismas condiciones pero durante 15 minutos, retire el sobrenadante cuidadosamente utilizando una pipeta. Luego, centrifugue los tubos a velocidad máxima durante un minuto a temperatura ambiente y elimine completamente el etanol residual usando la punta de una pipeta. Seque el precipitado al aire durante cinco minutos a temperatura ambiente.Finalmente, agregue 10 microlitros de agua libre de DNasa al pellet de ADN antes de proceder a la cuantificación de ADN metilado, secuenciación MBD y análisis según se describe en el protocolo del texto. El análisis identificó varias regiones hiper e hipometiladas diferencialmente enriquecidas en muestras de LLC en comparación con controles normales. Estas regiones metiladas diferencialmente se asignaron a diferentes clases de genes codificantes y no codificantes de proteínas.Finalmente, el análisis de los datos mostró una superposición significativa entre las regiones diferencialmente metiladas asociadas a la LLC obtenidas a partir de dos comparaciones diferentes con controles normales. Aquí, todos los sitios CpG ubicados en regiones diana de dos genes diferencialmente metilados fueron validados en un gran número de muestras de LLC mediante pirosecuenciación. Se ilustra aquí el rango óptimo de sonicación requerido para este método.Este rango de ADN fragmentado es ideal y más adecuado para fines de secuenciación de nueva generación. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos días si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, los factores cruciales que afectan la recuperación final del ADN son la calidad y la cantidad del ADN de entrada utilizado, así como el rango del ADN fragmentado tras la sonicación.Decidimos utilizar este método porque es el primer estudio global de metilación en LLC basado en la inmunoprecipitación para enriquecer el ADN metilado que cubre todas las regiones metiladas a lo largo del genoma. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el pronóstico o la terapia, ya que los genes firmas de metilación diferencial identificados podrían servir como biomarcadores normales globales y como dianas epigenéticas para el tratamiento. Tras seguir este procedimiento, el ADN metilado enriquecido puede utilizarse en otras aplicaciones posteriores, como hibridación o microarreglos, para comparar fácilmente los metilomas entre dos muestras o entidades patológicas utilizando un conjunto fijo de sitios CpG presentes en los arreglos.Finalmente, esta es una técnica rentable para analizar un gran número de muestras de pacientes en busca de secuencias metiladas a lo largo del genoma, incluyendo secuencias anotadas que abarcan genes codificadores de proteínas, así como secuencias no anotadas que abarcan elementos repetitivos y ARN largos no codificantes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

El estándar de oro para el análisis de metilación del ADN es la secuencia del genoma de ADN de bisulfito de convertir. Este método tiene la ventaja de la mayor sensibilidad de la citosina en comparación con el 5-metilcitosina (5-MEC) de bisulfito de desaminación en condiciones ácidas. Citosinas no metiladas se puede distinguir de citosinas metiladas después de la amplificación por PCR del DNA genómico de destino.

La metilación del ADN: Bisulfito de modificación y análisis

Este video demuestra la técnica de reacción en cadena de la polimerasa por gotas multiplex para la cuantificación simultánea de regiones de ADN metiladas en diferentes poblaciones de glóbulos blancos como biomarcador temprano para el diagnóstico clínico y el pronóstico.

Reacción en cadena de la polimerasa por gotas multiplex para detectar la metilación del ADN en leucocitos

Secuenciación de bisulfito de representación reducida mejorada es un método para la preparación de bibliotecas de secuenciación para el análisis de metilación del ADN basado en la digestión de enzimas de restricción combinada con la conversión de bisulfito de citosina. Este protocolo requiere 50 ng de material de partida y produce datos de resolución de pares de bases en regiones genómicas ricas en GC.

Enhanced reducido Representación bisulfito secuenciación para la Evaluación de la metilación del ADN en la Resolución Base Par

La secuenciación de amplicones de bisulfito (BSAS) es un método para cuantificar la metilación de citosina en regiones genómicas específicas de interés. Este método utiliza la conversión de bisulfito emparejada con la amplificación por PCR de las regiones objetivo antes de la secuenciación de próxima generación para producir una cuantificación absoluta de la metilación del ADN a un nivel específico de base.

Dirigida análisis de metilación del ADN mediante secuenciación de próxima generación

Aquí se presenta un protocolo para investigar la metilación del ADN del genoma de ancho en estudios de cribado de pacientes clínicos a gran escala utilizando la secuenciación Metil-unión de captura de ADN (SEC-MBDCap o MBD-ss) la tecnología y el análisis de tuberías bioinformática posteriores.

Secuenciación de captura de ADN de unión a metil-para tejidos del paciente

Recién descubierto formas oxidadas de la 5-METILCITOSINA (oxi-mCs), 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (fC 5) y 5-carboxylcytosine (5caC) puede representar distintas modificaciones de ADN con papeles funcionales únicas. Aquí se describe un flujo de trabajo semi cuantitativa para la visualización de la distribución espacial de la oxi-mCs, perfiles de intensidad de señal y colocalización.

Immunostaining para modificaciones de ADN: análisis computacional de imágenes confocales

Aquí se describe el uso de un método de amplificación de sonda específico para metilación para analizar los niveles de metilación de los elementos LINE-1 en células madre mesenquimales tratadas con vesículas extracelulares derivadas de osteosarcoma. También se demuestra la ultracentrifugación, un procedimiento popular para separar vesículas extracelulares del suero bovino fetal.

ANÁLISis de metilación de LINE-1 en células madre mesenquimales tratadas con vesículas extracelulares derivadas de osteosarcoma

Aquí, describimos un procedimiento para el análisis del genoma de la metilación del ADN en cánceres gastrointestinales. El procedimiento es relevante para los estudios que investigan las relaciones entre los patrones de metilación de los genes y los factores que contribuyen a la carcinogénesis en los cánceres gastrointestinales.

Análisis del genoma en general de la metilación del ADN en el cáncer gastrointestinal

Los marcadores epigenéticos se utilizan para la subtipificación de glóbulos blancos (CMB) mediante la cuantificación de los patrones de metilación del ADN. Este protocolo presenta un método de reacción en cadena de la polimerasa de gotas múltiples (mdPCR) utilizando un dispositivo microfluídico basado en elastómero termoplástico (TPE) para la generación de gotas que permite la cuantificación objetivo precisa y múltiplex específica de metilación de los recuentos diferenciales del CMB.

Metilización Específica Multiplex Droplet PCR usando el Dispositivo Generador de Gotas de Polímero para Diagnóstico Hematológico

El presente estudio describe el flujo de trabajo para gestionar los datos de metilación del ADN obtenidos por las tecnologías de microarrays. El protocolo muestra pasos desde la preparación de la muestra hasta el análisis de datos. Todos los procedimientos se describen en detalle, y el video muestra los pasos significativos.

Preparación de muestras para el análisis bioinformático de la metilación del ADN: estrategia de asociación para la obesidad y estudios de rasgos relacionados

Aprende a analizar metilación de ADN completo usando secuenciación de dominio MBD en pacientes con leucemia linfocítica crónica. Este método identifica regiones diferencialmente metiladas sin sesgo ni PCR.

Análisis de metilación de ADN completo usando un método de captura de dominio de unión a metil-CpG en pacientes con leucemia linfocítica crónica (Video) | JoVE Journal

Análisis de metilación de ADN completo usando un método de captura de dominio de unión a metil-CpG en pacientes con leucemia linfocítica crónica

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