Análisis de metilación de ADN completo usando un método de captura de dominio de unión a metil-CpG en pacientes con leucemia linfocítica crónica

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el perfil global de metilación e identificar regiones ricas en CpG metiladas diferencialmente en pacientes con leucemia linfocítica crónica mediante secuenciación de próxima generación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética, como la identificación de los posibles genes característicos específicos de la LLC, la patogénesis de la enfermedad y el pronóstico. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una cobertura completa de todo el genoma de la metilación de CpG de forma insesgada e independiente de la PCR.

Para empezar, utilice un kit de extracción de ADN disponible en el mercado para aislar el ADN genómico del paciente y de las muestras normales de células mononucleares de sangre periférica de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de cuantificar el ADN genómico como se describe en el protocolo de texto, diluya 5 microgramos de ADN genómico de cada muestra, hasta un total de 200 microlitros utilizando tampón TE, dando una concentración final de 25 nanogramos por microlitro. A continuación, realice la sonicación en tubos especialmente diseñados, utilizando un sonicador, durante un total de 30 ciclos de 30 segundos de encendido y 30 segundos de apagado.

Después de cada cinco ciclos, gire brevemente los tubos para recoger las muestras hasta el fondo. Compruebe el rango de sonicación de todas las muestras mediante electroforesis de ADN, tal y como se describe en el protocolo de texto. Para preparar las perlas magnéticas de estreptavidina, primero vuelva a suspenderlas del tubo original proporcionado por el kit.

Pipetear suavemente las perlas hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión homogénea. Por cada cinco microgramos de muestra de ADN fragmentado, coloque 50 microlitros de las perlas en tubos de 1,5 mililitros separados, limpios y etiquetados. Agregue 50 microlitros de tampón de lavado de perlas 1X para alcanzar un volumen final de 100 microlitros.

Coloque los tubos en un soporte magnético durante un minuto para permitir que todas las perlas magnéticas se concentren en la pared interna del tubo frente al imán. Retire el líquido sin tocar las perlas, utilizando una pipeta de 200 microlitros. A continuación, retire los tubos del soporte magnético, añada 250 microlitros de tampón de lavado de perlas 1X y mezcle las perlas suavemente con una pipeta.

Después de repetir estos pasos al menos cuatro veces para todas las muestras, finalmente vuelva a suspender las muestras en 250 microlitros de tampón de lavado de perlas 1X. Mantenga las muestras en hielo. Para unir la proteína de biotina MBD a las perlas lavadas, primero agregue 35 microlitros de proteína a tubos separados y aumente el volumen total a 250 microlitros usando un tampón de lavado de perlas 1X.

Agregue 250 microlitros de proteína MBD diluida a los 250 microlitros de perlas lavadas y déjelas en rotación de extremo a extremo a temperatura ambiente. Después de mezclar las perlas en proteína durante una hora, lave las perlas de estreptavidina magnética unidas a proteínas colocando los tubos en el soporte magnético durante un minuto. Retire el líquido sin tocar las perlas con una pipeta.

Luego, agregue 250 microlitros de tampón de lavado de perlas 1X y coloque los tubos en un mezclador giratorio durante cinco minutos a temperatura ambiente. Repita el paso de lavado dos veces más antes de volver a suspender las perlas de biotina MBD lavadas en 200 microlitros de tampón de lavado de perlas 1X, preparando las perlas para la captura de ADN metilado. En un tubo limpio de 1,5 mililitros sin DNasa, agregue 100 microlitros de tampón de lavado de perlas de mililitros y 180 microlitros de ADN genómico fragmentado.

Llevar el volumen final a 500 microlitros utilizando agua libre de DNasa. Agregue 380 microlitros de agua libre de DNasa a los 20 litros restantes del ADN genómico fragmentado. Congele las muestras para luego procesarlas y usarlas como controles de ADN de entrada.

Coloque los tubos que contienen perlas de biotina MBD lavadas en un soporte magnético durante un minuto y retire el líquido sin alterar las perlas. A continuación, añada 500 microlitros de ADN genómico fragmentado diluido en tampón de lavado de perlas. Selle herméticamente todos los tubos con una película de parafina y déjelos toda la noche a 4 grados centígrados en un soporte de rotación de extremo a extremo de 8 a 10 rotaciones por minuto.

Después de la reacción de unión de perlas de ADN y MBD, coloque los tubos en la rejilla magnética durante un minuto para concentrar todas las perlas en la pared interna del tubo. Retire el líquido sobrenadante con una pipeta sin tocar las perlas y guarde esta fracción de muestra de ADN no unida en hielo. A continuación, añada 200 microlitros de tampón de lavado de perlas 1X a las perlas y coloque los tubos en el soporte giratorio durante tres minutos a temperatura ambiente.

Después de eliminar el líquido con el soporte magnético, repita el lavado otras dos veces para eliminar el ADN residual no unido. Después del lavado final, agregue 200 microlitros de tampón de elución con alto contenido de sal provisto en el kit para eluir el ADN. Luego, coloque los tubos en el soporte giratorio durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Después de la incubación, colóquelos en el soporte magnético durante un minuto y use una pipeta para transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo y limpio de 1,5 mililitros. A continuación, agregue 200 microlitros de tampón de elución con alto contenido de sal a las perlas y repita la elución girando los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos adicionales. Añadir el segundo eluido al mismo tubo que contiene los 200 microlitros del primer eluido.

Para precipitar el ADN, agregue un microlitro de glucógeno, 40 microlitros de acetato de sodio de tres molares, pH 5.2 y 800 microlitros de etanol absoluto helado a 400 microlitros de ADN eluido. Agregue también los reactivos a los 400 microlitros previamente congelados de muestras de control de ADN de entrada. Mezcle bien los tubos mediante vórtice antes de incubarlos a menos 80 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, centrifugar los tubos a 12.000 veces g y 4 grados centígrados durante 30 minutos. Deseche el sobrenadante con cuidado sin alterar la bolita. A continuación, añada 500 microlitros de etanol al 70% y agite los tubos.

Después de volver a centrifugar los tubos en las mismas condiciones pero durante 15 minutos, retire el sobrenadante con cuidado con una pipeta. A continuación, centrifugar los tubos a máxima velocidad durante un minuto a temperatura ambiente y eliminar completamente el etanol residual con una punta de pipeta. Seque el pellet al aire durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Finalmente, agregue 10 microlitros de agua libre de DNasa a la pastilla de ADN antes de proceder a la cuantificación del ADN metilado, la secuenciación de MBD y el análisis como se describe en el protocolo de texto. El análisis identificó varias regiones hipermetiladas e hipometiladas diferencialmente enriquecidas en muestras de LLC en comparación con los controles normales. Estas regiones metiladas diferencialmente se mapearon a diferentes clases de genes codificantes y no codificantes de proteínas.

Finalmente, el análisis de los datos mostró una superposición significativa entre las regiones metiladas diferencialmente asociadas a CLL obtenidas de dos comparaciones diferentes de controles normales. Aquí, todos los sitios CpG ubicados en regiones diana de dos genes metilados diferencialmente se validaron en un gran número de muestras de CLL mediante pirosecuenciación. Aquí se ilustra el rango óptimo de sonicación requerido para este método.

Este rango de ADN fragmentado es ideal y más adecuado para fines de secuenciación de próxima generación. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, los factores cruciales que afectan a la recuperación final del ADN son la calidad y la cantidad de ADN de entrada utilizada y el rango del ADN fragmentado después de la sonicación.

Decidimos utilizar este método porque es el primer estudio global de metilación de CLL que se basa en la inmunoprecipitación para enriquecer el ADN metilado que cubre todas las regiones metiladas en todo el genoma. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el pronóstico o la terapia, ya que los genes de firma metilados diferencialmente identificados podrían servir como biomarcadores normales globales y dianas epigenéticas para la terapia. Siguiendo este procedimiento, el ADN metilado enriquecido se puede utilizar para otras aplicaciones posteriores, como la hibridación o la realización de microarrays, para comparar fácilmente los metalomas entre dos muestras o entidades de enfermedades utilizando un conjunto fijo de sitios CpG presentes en las matrices.

Por último, se trata de una técnica rentable para analizar un gran número de muestras de pacientes en busca de secuencias metiladas en todo el genoma, incluidas secuencias anotadas que abarcan genes codificadores de proteínas, así como secuencias no anotadas que abarcan elementos repetitivos y ARN largos no codificantes.