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Genetics

Protocoles pour l'assemblage standard d'ADN de C-Brick utilisant Cpf1

Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55775
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

La protéine Cpf1 associée à CRISPR peut être guidée par un ARN CRISPR spécialement conçu (CRRNA) pour cliver l'ADN bicaténaire aux sites souhaités, générant des extrémités collantes. Sur la base de cette caractéristique, une norme d'assemblage d'ADN (C-Brick) a été établie, et un protocole détaillant son utilisation est décrit ici.

Abstract

La protéine CPf1 associée au CRISPR clive l'ADN bicaténaire sous la direction de l'ARN CRISPR (CRRNA), générant des extrémités collantes. En raison de cette caractéristique, Cpf1 a été utilisé pour l'établissement d'une norme d'assemblage d'ADN appelée C-Brick, qui présente l'avantage de longs sites de reconnaissance et de cicatrices courtes. Sur un vecteur C-Brick standard, il existe quatre sites de reconnaissance Cpf1 - le préfixe (sites T1 et T2) et le suffixe (sites T3 et T4) - éléments d'ADN biologiques flanquant. Le clivage des sites T2 et T3 produit des extrémités collantes complémentaires, qui permettent l'assemblage de pièces d'ADN avec des sites T2 et T3. Pendant ce temps, une courte cicatrice "GGATCC" est générée entre les pièces après l'assemblage. Comme le plasmide nouvellement formé contient à nouveau les quatre sites de clivage Cpf1, la méthode permet l'assemblage itératif de pièces d'ADN, ce qui est similaire à celui des standards BioBrick et BglBrick. Une procédure décrivant l'utilisation de la norme C-Brick pour assembler des pièces d'ADNEst décrit ici. La norme C-Brick peut être largement utilisée par les scientifiques, les étudiants diplômés et les étudiants de premier cycle, et même les amateurs.

Introduction

La standardisation des parties biologiques de l'ADN est importante pour le développement de la biologie synthétique 1 . Le développement d'une procédure d'assemblage d'ADN peut remplacer des conceptions expérimentales ponctuelles et éliminer plusieurs des résultats inattendus qui surviennent lors de l'assemblage de composants génétiques dans des systèmes plus vastes. La norme BioBrick (BBF RFC 10) était l'une des premières normes d'assemblage d'ADN proposées. Il utilise la séquence de préfixe (contenant des sites de coupe EcoRI et XbaI) et la séquence de suffixe (contenant les sites de coupe SpeI et PstI) 2 , 3 . Étant donné que XbaI et SpeI ont des extrémités cohésives complémentaires, les pièces d'ADN BioBrick qui sont coupées avec XbaI et SpeI peuvent être jointes, générant un nouveau BioBrick pour un assemblage itératif supplémentaire.

Certains défauts ont été identifiés avec l'utilisation de la norme BioBrick 4 . Par exemple, il produit une cicatrice de 8 pbEntre les parties d'ADN, ce qui ne permet pas la construction de protéines in-fusion. En outre, les quatre types de sites de restriction de 6 pb susmentionnés doivent être retirés des pièces d'ADN, ce qui est très gênant. La norme BglBrick a été établie pour résoudre le premier problème 5 . Il crée une cicatrice "GGATCT" de 6 p. 100, produisant Gly-Ser et permettant la fusion de protéines multiples ou de domaines protéiques. IBrick a été développé pour traiter le deuxième problème 6 . Il utilise des endonucléases homing (HE) qui reconnaissent de longues séquences d'ADN. Comme les sites de reconnaissance HE existent rarement dans les séquences d'ADN naturelles, la norme iBrick peut être utilisée pour la construction directe de pièces iBrick sans modifier leurs séquences d'ADN. Cependant, la norme iBrick laisse une cicatrice de 21 pb entre les parties de l'ADN, ce qui pourrait être la raison de son impopularité.

Au cours des dernières années, les répétitions palindromiques courtes classées régulièrement (CRISPR) s'est développé rapidement 7 , 8 . Parmi les protéines associées au CRISPR (Cas), l'endonucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes est maintenant largement utilisée. Il introduit principalement des ruptures d'ADN bicaténaires (DSB) avec des extrémités franches 9 .

En 2015, Zhang et ses collègues ont caractérisé pour la première fois Cpf1 (CRISPR de Prevotella et Francisella 1). Il appartient au système CRISPR-Cas de classe 2 de type V et est une endonucléase 10 CRISRP (CRARN). Contrairement à Cas9, Cpf1 introduit un DSB avec un surtension de 5 ou 5 nt 5 '10. Sur la base de cette caractéristique, Cpf1 a été utilisé pour développer une norme d'assemblage d'ADN, C-Brick 4 . Sur un vecteur standard C-Brick, quatre sites Cpf1 de T1 / T2 préfixés et T3 / T4 suffixés flanquent les parties biologiques; Ceci est similaire à la norme BioBrick. Comme le clivage des sites T2 et T3 pTransforme les extrémités collantes complémentaires, il est possible d'effectuer l'assemblage itératif des pièces d'ADN tout en générant une cicatrice "GGATCC" entre les pièces. Notamment, la norme C-Brick a deux avantages principaux: reconnaître des séquences cibles longues et laisser des cicatrices courtes. La cicatrice "GGATCC" de 6 pb générée par C-Brick encode Gly-Ser, qui permet la construction de protéines de fusion. En outre, la norme C-Brick est également partiellement compatible avec les standards BglBrick et BioBrick.

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Protocol

1. Préparation de crRNA

  1. Préparation des modèles CRRNA
    1. Ré-suspendre les oligonucléotides individuels ( Tableau 1 ) dans de l'eau exempte de RNase à une concentration de 10 uM.
    2. Ajouter 22,5 μl d'oligonucléotide de brin supérieur (T7-F dans le tableau 1 ), 22,5 μl d'oligonucléotide de brin inférieur ( Tableau 1 ) et 5 μL de tampon de recuit 10x à un tube de PCR de 0,2 ml. Assurez-vous que le volume total est de 50 μL.
      REMARQUE: Six différents oligonucleotides de brin sont présentés dans le tableau 1 , chacun desquels doivent être couplés individuellement avec le brin T7-F supérieur. Les lettres minuscules dans le tableau 1 représentent la séquence à transcrire dans la séquence guide de crRNA. Le tampon de PCR Taq 10x peut être utilisé à la place du tampon de recuit 10x.
    3. Placez le tube PCR dans un thermocycleur.
    4. Exécuter le programme de recuit: dénaturation initiale à 95 ° C pour5 min, puis un temps de refroidissement de 95 à 20 ° C, avec une diminution de 1 ° C par minute sur le thermocycleur.
      REMARQUE: Utilisez immédiatement les échantillons pour l'étape 1.2.1.
  2. Transcription et purification de crRNA
    1. Ajouter 38 μL d'eau exempte de RNase, 8 μL du gabarit de l'étape 1.1.4, 20 μL de tampon de transcription 5x T7, 20 μL de mélange de NTP (10 μM), 4 μl d'inhibiteur de RNase recombinante (RRI) et 10 ΜL d'ARN polymérase T7 à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Assurez-vous que le volume total est de 100 μL.
    2. Mettez le tube de microcentrifugeuse dans un bain d'eau à 37 ° C pendant la nuit (environ 16 h).
    3. Utilisez un kit de nettoyage et de concentration d'ARN pour purifier l'ARN transcrit; Suivre le protocole du fabricant.
    4. Quantifier les ARN avec des spectrophotomètres UV-Vis et diluer l'ARN à une concentration de 10 μM. Utilisez les échantillons immédiatement ou rangez-les à -80 ° C.
      NOTE: La séquence CRRNAS sont listés dans le tableau 2 .

2. Construction de pièces en C-Brick ( c.-à-d. L'insertion de pièces biologiques dans un vecteur standard de C-Brick)

REMARQUE: Cette étape comporte trois sous-étapes. Pour les parties biologiques courtes ( par exemple, les promoteurs et les terminateurs), il est préférable d'utiliser la méthode de PCR directe pour insérer les parties biologiques dans un vecteur standard C-Brick 4 . Toute la séquence vectorielle est affichée dans les données supplémentaires, et la séquence de préfixe et de suffixe est illustrée à la Figure 1 (étape 2.1 ci-dessous). Pour les parties biologiques qui peuvent être facilement obtenues par PCR ( par exemple, avec des modèles d'ADN génomique , des plasmides ou des séquences d'ADN synthétisées de novo ), il est préférable d'utiliser le procédé d'assemblage sans soudure pour insérer les parties biologiques dans un vecteur standard C-Brick (Étape 2.2 ci-dessous). Pour les pièces obtenues des normes BioBrick et BglBrick, la restrictionLa digestion à médiation enzymatique et la ligature médiée par l'ADN ligase T4 peuvent être utilisées pour insérer les parties biologiques dans un vecteur standard C-Brick (étape 2.3, ci-dessous).

  1. Construction par amplification directe par PCR
    1. Concevoir et commander des oligonucléotides pour l'amplification par PCR.
      NOTE: L'extrémité 5 'de l'oligonucléotide contient la séquence de la partie ADN et l'extrémité 3' de l'oligonucléotide contient la séquence vectorielle ( c'est-à-dire "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" à l'extrémité 3 'du brin avant et "GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG" Dans le brin inverse). Soit aucun surplomb ni un surplomb de ~ 20 pb ne peut être conçu à l'extrémité 5 'de l'oligonucléotide. Des exemples spécifiques peuvent être trouvés dans une étude précédente 4 .
    2. Ré-suspendre les oligonucléotides individuels dans de l'eau ultra-pure à une concentration de 10 uM.
    3. Mettre en place des réactions de PCR sur de la glace dans un tube de PCR de 0,2 ml: ajouter 18 μL d'eau ultra-pure, 25 μL de 2x PLe tampon CR, 1 μL de dNTP (10 μM), 2,5 μL de chaque primaire (10 μM) à partir de l'étape 2.1.2, 0,5 μL de vecteur standard C-Brick (50 ng) en tant que modèle et 0,5 μL De l'ADN polymérase haute fidélité. Assurez-vous que le volume total est de 50 μL.
    4. Placez le tube directement dans un thermocycleur et démarrez le programme de thermocycleur. Utilisez les échantillons immédiatement ou congéluez-les et rangez-les à -20 ° C.
    5. Programme Thermocycler: un cycle pendant 3 min à 98 ° C; Trente cycles pendant 10 s à 98 ° C, 20 s à 55 ° C et 2 min à 72 ° C; Et un cycle pendant 10 min à 72 ° C. Conserver l'échantillon à 16 ° C.
    6. Ajouter 9 μL du mélange de l'étape 2.1.4 à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
    7. Ajouter 1 μL de DpnI et incuber pendant 1 h dans un bain d'eau à 37 ° C.
      NOTE: Si les amorces n'ont pas de séquences chevauchantes, ajouter 0,5 μL de polynucléotide kinase T4 (PNK) et 0,5 μL d'ADN ligase T4 et incuber dansUn bain d'eau à 22 ° C pendant 1 h. Sinon, si les amorces contiennent une séquence de superposition de ~ 20 nt, transformez directement les produits traités par DpnI en cellules compatibles avec E. coli (DH10B) (étape 2.4). Le produit de PCR linéarisé sera circularisé par le système de recombinaison dans l'hôte.
    8. Utilisez les échantillons immédiatement ou rangez-les à -20 ° C.
  2. Construction par assemblage sans couture
    1. Concevoir et commander des oligonucléotides pour l'amplification par PCR.
      NOTE: L'extrémité 3 'de l'oligonucléotide contient la séquence terminale de la partie ADN et l'extrémité 5' de l'oligonucléotide contient le terminal de la séquence vectorielle standard C-Brick linéarisée ( c'est-à-dire "CTAGAAAGAGAGAAAGGATCC" pour le 5 ' -end du brin avant et "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC" pour l'extrémité 5 'du brin inverse). Des exemples spécifiques peuvent être trouvés dans une étude précédente 4 .
    2. Re-suspendre les individusUal dans de l'eau ultra-pure à une concentration de 10 uM.
    3. Mettre en place des réactions de PCR sur de la glace dans un tube de PCR de 0,2 ml: ajouter 18 μL d'eau ultrapure, 25 μL de tampon PCR 2x, 1 μL de dNTP (10 μM), 2,5 μL chacune des amorces avant et inverse (10 μM ) À partir de l'étape 2.2.2, 0,5 μL de gabarit (20-500 ng) et 0,5 μl d'ADN polymerase haute fidélité. Assurez-vous que le volume total est de 50 μL.
    4. Placez le tube directement dans le thermocycleur et exécutez le programme de thermocycleur. Utilisez les échantillons immédiatement ou congéluez-les et rangez-les à -20 ° C.
      REMARQUE: Réglez le programme thermocycler sur: un cycle pendant 3 min à 98 ° C; 30 cycles pendant 10 s à 98 ° C, 20 s à 55 ° C (selon la température de recuit de l'amorce) et 1 min (selon la longueur des parties biologiques) à 72 ° C; Et un cycle pendant 10 min à 72 ° C. Conserver l'échantillon à 16 ° C.
    5. Purifier le produit de PCR en utilisant un système de nettoyage par PCRKit de température; Suivre le protocole du fabricant.
    6. Recréer le vecteur standard C-Brick avec BamHI: ajouter 34 μL d'eau ultra-pure, 10 μL de plasmide (1 μg), 5 μL de tampon 10x et 1 μL de BamHI au tube de microcentrifugeuse. Incuber jusqu'à 2 h à 37 ° C dans un bain d'eau.
    7. Purifier le produit ci-dessus à l'aide d'un kit de système de nettoyage de gel; Suivre le protocole du fabricant.
    8. Ajouter 2 μL de vecteur linéarisé (50 ng) à partir de l'étape 2.2.7, 5 μL de fragment (200 ng) de l'étape 2.2.4, 2 μL de tampon d'assemblage sans soudure 5x et 1 μL d'enzyme de montage sans soudure à partir d'un kit d'assemblage sans soudure À un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml. Assurez-vous que le volume total est de 10 μL.
    9. Placez-le dans un bain-marie à 37 ° C pendant 30 min. Utilisez les échantillons immédiatement ou congéluez-les et rangez-les à -20 ° C.
  3. Construction par restriction de la digestion à médiation enzymatique et ligature médiée par l'ADN ligase T4.
    REMARQUE: Pour les pièces obtenues à partir des normes BioBrick (étape 2.3.4-2.3.7) et BglBrick (étape 2.3.1-2.3.3), la digestion à restriction enzymatique et la ligature médiée par la ligase T4 ADN peuvent être utilisées pour insérer le Biologiques dans un vecteur standard C-Brick.
    1. Recréer les pièces standard BglBrick avec BamHI et BglII: ajouter 34 μL d'eau ultrapure, 10 μL de plasmide (2 μg), 5 μL de 10x tampon 3, 0,5 μL de BamHI et 0,5 μL de BglII au tube de microcentrifugeuse. Incuber pendant 2 h dans un bain d'eau à 37 ° C.
    2. Exécuter une électrophorèse sur gel d'agarose à 1% et purifier le fragment en utilisant un kit de système de nettoyage de gel.
    3. Relier le fragment et le vecteur standard de C-Brick: ajouter 2 μL de vecteur linéarisé (50 ng) de l'étape 2.1.12 et 6 μL de fragment (200 ng) de l'étape 2.3.3 à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Ajouter 1 μL de 10 x T4 ADN ligase tampon et 1 μL de T4 ADN ligase. Incuber pendant 2 h à 22 ° C. Utilisez les échantillons immédiatement ou freezE et rangez-les à -20 ° C.
    4. Recréer les pièces standard BioBrick avec XbaI et SpeI: ajouter 34 μL d'eau ultra-pure, 10 μL de plasmide (2 μg), 5 μL de tampon 10x, 0,5 μL de XbaI et 0,5 μL de SpeI au tube de microcentrifugeuse. Incuber pendant 2 h dans un bain d'eau à 37 ° C.
    5. Digérer le vecteur standard C-Brick avec XbaI et SpeI: ajouter 34 μL d'eau ultrapure, 10 μL de plasmide (1 μg), 5 μL de tampon 10x, 0,5 μL de XbaI et 0,5 μL de SpeI au tube de microcentrifugeuse . Incuber pendant 2 h dans un bain d'eau à 37 ° C.
    6. Exécuter une électrophorèse sur gel d'agarose à 1% et purifier le fragment de l'étape 2.3.4 et le vecteur linéarisé de l'étape 2.3.5 avec un kit de système de nettoyage de gel; Suivant le protocole du fabricant.
    7. Relier le fragment et le vecteur C-Brick: ajouter 2 μL de vecteur linéarisé (50 ng) de l'étape 2.3.5 et 6 μL de fragment (200 ng) de l'étape 2.3.4 à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Un dD 1 μL de 10x T4 ADN ligase tampon et 1 μL de T4 ADN ligase. Incuber pendant 2 h à 22 ° C. Utilisez les échantillons immédiatement ou congéluez-les et rangez-les à -20 ° C.
  4. Ajouter 10 μL des produits à partir des étapes 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 ou 2.3.7 pour la transformation chimique dans les cellules compétentes de E. coli (DH10B).
  5. Ramener plusieurs clones dans un tube liquide Luria-Bertani (LB) de 5 ml et incuber à 37 ° C sur un agitateur (220 tr / min) pendant une nuit.
  6. Extraire le plasmide en utilisant un kit de préparation de plasmide; Suivre le protocole du fabricant.
  7. Identifiez les clones appropriés par le séquençage de Sanger 11 .

3. Ensemble C-Brick ( Figure 2 )

  1. Digestion du vecteur C-Brick avec Cpf1
    1. Ajouter 22,5 μl d'eau exempte de RNase, 4 μL de tampon Cpf1 10x, 10 μL du plasmide à partir de l'étape 2.6 (1 μg), 0,5 μL de RRI et 1 &# 181; L de Cpf1 (5 μM) à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml.
      REMARQUE: Cpf1 peut être acheté commercialement ou purifié suivant le protocole dans une étude précédente 4 .
    2. Pour insérer un fragment d'ADN étranger dans les sites T1 et T2, ajouter 1 μL de crRNA-T2 (10 μM) et incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30 minutes. Un dd 1 μL de crRNA-T1 (10 μM) et Cpf1 (5 μM) pendant encore 30 min.
      NOTE: En variante, pour insérer un fragment d'ADN étranger dans les sites T3 et T4, ajouter 1 μL de crRNA-T3 (10 μM) et incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30 minutes. Ajouter 1 μL de crRNA-T4 (10 μM) pendant 30 minutes supplémentaires.
    3. Ajouter 1 μL de phosphatase alcaline thermosensible et incuber le tube dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 1 heure supplémentaire.
    4. Exécutez une électrophorèse sur gel d'agarose et purifiez le vecteur en utilisant un kit de système de nettoyage de gel. Utilisez les échantillons immédiatement ou congéluez-les et rangez-les à -20 ° C.
    Digestion du fragment d'ADN avec Cpf1
    1. Ajouter 21,5 μl d'eau exempte de RNase, 4 μL de tampon Cpf1 10x, 10 μL de plasmide à partir de l'étape 2.6 (2 μg), 0,5 μL de RRI et 2 μL de Cpf1 (5 μM) à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml.
    2. Pour insérer un fragment d'ADN étranger dans les sites T1 et T2, ajouter 1 μL de crRNA-T1 (10 μM) et 1 μL de crRNA-T3 (10 μM) et incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 2 h.
      NOTE: En variante, ajouter 1 μL de crRNA-T2 (10 μM) et 1 μL de crRNA-T4 (10 μM) et incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 2 h.
    3. Exécutez une électrophorèse sur gel d'agarose et purifiez le fragment en utilisant un kit de système de nettoyage de gel. Utilisez les échantillons immédiatement ou congéluez-les et rangez-les à -20 ° C.
  2. Assemblage C-Brick et vérification supplémentaire
    1. Relier le fragment d'ADN étranger et le vecteur C-Brick: ajouter 2 μL du vecteur linéarisé (50 ng) de l'étape 3.1.4 et 6 μL du fragment d'ADN (200 ng) de l'étape 3.2.3 à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Ajouter 1 μl de 10x T4 ADN Ligase tampon et 1 μL de T4 ADN ligase. Incuber pendant 2 h à 22 ° C. Utilisez les échantillons immédiatement ou congéluez-les et rangez-les à -20 ° C.
    2. Ajouter 10 μL des produits de ligature (étape 3.3.1) pour la transformation chimique dans des cellules compatibles avec E. coli (DH10B).
    3. Ajouter plusieurs clones dans un tube LB liquide de 5 mL et incuber pendant une nuit sur un agitateur à 220 tr / min et 37 ° C.
    4. Extraire le plasmide en utilisant un kit de préparation de plasmide; Suivre le protocole du fabricant.
    5. Identifiez les clones corrects par Sanger séquencing 11 .
  3. Effectuer un nouveau cycle d'assemblage de C-Brick. Les clones corrects de l'étape 3.3.4 peuvent être utilisés comme un nouveau vecteur C-Brick ou partie ADN pour un nouvel assemblage itératif C-Brick, suivant le même protocole à partir des étapes 3.1-3.3.
    NOTE: T2 'et T3' sIls sont conçus comme la sauvegarde des sites T2 et T3 ( Figure 1a ). Pour les plasmides obtenus à partir de l'étape 2.3.7, seuls les T2 et T3 peuvent être utilisés pour l'assemblage standard C-Brick.

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Representative Results

Ce protocole a démontré l'assemblage de trois cassettes de chromoprotéines (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) et amilGFP (BBa_K592010)). Tout d'abord, les séquences codantes des trois gènes et terminateurs mentionnés ci-dessus ont été clones individuellement dans un vecteur standard C-Brick. Des parties d'ADN courtes, un promoteur et un terminateur, ont été introduits dans le vecteur C-Brick par amplification PCR en utilisant des amorces contenant les petites parties d'ADN sur le terminal 5 '. Ceci a été suivi par la méthode de l'auto-ligature. Trois séquences codant pour la chromoprotéine ont d'abord été synthétisées de nouveau et ensuite clonées dans le vecteur standard C-Brick par un assemblage transparent. Les amorces ont été décrites dans une étude précédente 4 .

Après cela, les séquences cjBlue, eforRed et amilGFP ont été ligaturées avec des séquences de terminaison et de promoteur dans la même procédure montrée dans"Xfig"> Figure 2. Les constructions correctes ont été transformées en E. coli , démontrant de belles couleurs ( Figure 3a ). Par la suite, deux cassettes d'expression de couleur ont été assemblées avec la norme C-Brick pour créer plus de couleurs ( c.-à-d. La couleur rouge d'amilGFP plus eforRed, la couleur verte de AmilGFP plus cjBlue et la couleur violet clair de eforRed plus cjBlue; Figure 3b ).

Figure 1
Figure 1: Séquence d'ADN d'interface standard C-Brick et vecteur standard C-Brick. (A) La séquence de l'interface standard en brique C-T1, T2, T3, T4, T2 ', T3'-peut être reconnue par son CRRNA correspondant et ensuite introduite dans un surplomb de 5' à l'aide de Cpf1. Le clivage des sites T2 et T3 (ou T2 'et T3') produit des effets complémentaires surbloque. Avec les huit sites de restriction conçus, la norme C-Brick est partiellement compatible avec BioBrick et BglBrick. ( B ) Carte de plasmide pour le vecteur standard de C-Brick avec des sites de digestion de restriction. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Le flux de travail pour l'assemblage d'ADN dans le standard C-Brick. Les sites cibles T2 et T3 digérés par Cpf1 produisent des extrémités cohésives complémentaires de "GGATC" et "GATCC", respectivement, qui peuvent être ligaturés pour générer une cicatrice "GGATCC" courte. Des procédures détaillées peuvent être trouvées à l'étape 3 dans le texte ("Ensemble C-Brick"). Cliquez ici pour Voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3: Pigments bactériens colorés produits par E. coli Harboring Constructs assemblés dans la norme C-Brick. (A) Trois chromoprotéines ont été exprimées dans E. coli cultivées sur une assiette. Les bactéries sans chromoprotéines (témoin négatif) sont indiquées sur la 4ème plaque. ( B ) Trois chromoprotéines et trois chromoprotéines doubles assemblées ont été exprimées dans E. coli cultivé dans un milieu LB liquide. De 1 à 6, les constructions ont exprimé eforRed (1), amilGFP (2), cjBlue (3), amilGFP plus eforRed (4), amilGFP plus cjBlue (5) et eforRed plus cjBlue (6). Les bactéries colorées sur une seule plaque ou dans un seul tube de microcentrifugeuse ont été cultivées à partir d'un seul clone vérifié par une séquence. Les / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

prénom séquence
T7-F GAAATTAATACGACTCACTATAGGG
T7-T1-R GaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2'-R CtagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2-R GgatcctttctctctctctagATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3-R GgatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3'-R CtctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T4-R TtcaagggaaactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC

Tableau 1: Oligos pour la préparation des modèles de transcription CRRNA utilisés dans cette étude. Le T7-F était l'oligonucléotide à brin supérieur, et les autres étaient les oligonucléotides de brin. Les bases minuscules dans la séquence seront transcrites dans la séquence guide dans crRNA.

des noms Les séquences d'ARN (5'-3 ')
CrRNA-T1 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC
CrRNA-T2 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC
CrRNA-T3 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC
CrRNA-T4 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA
CrRNA-T2 ' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUACUCUAG
CrRNA-T3 ' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUGAAUUUCUCGAGCUAGAG

Tableau 2: Les séquences de crRNA utilisées dans cette étude. Les crRNA ont été produits par la transcription in vitro à l'étape 1 dans le texte ("Préparation de crRNA").

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Discussion

Ce protocole décrit une procédure pour la norme d'assemblage d'ADN C-Brick. L'étape la plus importante dans ce protocole est la linéarisation du vecteur standard C-Brick; Le clivage incomplet du vecteur pourrait affecter gravement le taux de réussite. En outre, bien que Cpf1 couvre principalement les séquences d'ADN cible dans le schéma de clivage "18-23", un clivage inexact près des deux bases a également été détecté 4 , ce qui peut provoquer un petit nombre de mutations après l'assemblage de l'ADN. Par conséquent, le séquençage de Sanger est nécessaire pour vérifier la construction assemblée.

L'efficacité de l'assemblage de C-Brick est inférieure à l'enzyme de restriction traditionnelle et aux méthodes de ligature décrites dans une étude précédente 4 . La principale raison qui affecte l'efficacité de l'assemblage peut être les caractéristiques de clivage inexactes de Cpf1. À l'avenir, des améliorations à la précision du clivage peuvent être extrêmement utiles pour la norme aNd sont en cours d'exploration.

C-Brick est également partiellement compatible avec les normes BglBrick et BioBrick. Par exemple, les pièces BglBrick peuvent être coupées avec BglII et BamHI puis insérées dans le site BamHI d'un vecteur standard C-Brick, générant une partie C-Brick. Cependant, la direction d'insertion de la partie BglBrick doit être vérifiée, et il y aurait une cicatrice "GGATCT" après l'assemblage. Lorsqu'une partie d'ADN de C-Brick est obtenue à partir d'une partie BioBrick ( c'est-à-dire avec une digestion XbaI et SpeI), les sites T2 et T3 seront détruits, et deux séquences cpf1 de sauvegarde (T2 'et T3') peuvent être utilisées.

Comme le clivage Cpf1 nécessite du sgRNA, qui est extrêmement sensible à RNase, tous les matériaux doivent être exempts de RNase. À l'heure actuelle, tous les vecteurs standard C-Brick, les nucléases Cpf1 exemptes de RNase et les CRRNA peuvent être commandés commercialement 12 . Par conséquent, les procédures pour C-Brick sont en fait aussi simples que celles du BioBrick standard.

Au cours des dernières années, plusieurs méthodes utiles d'assemblage d'ADN ont été développées et sont largement utilisées, y compris Golden Gate Assembly 13 , Gibson Assembly 14 et autres 15 . Cependant, comme les normes d'assemblage d'ADN ont le potentiel de fournir des réactions d'assemblage rentables, fiables, à haut débit et automatiques 5 , les normes peuvent faciliter la construction et l'essai de gènes, de circuits génétiques et de voies nouvellement conçus ou ré-conçus 15 , 16 , 17 , en particulier dans le domaine de la biologie synthétique. Parmi les normes d'assemblage d'ADN actuellement publiées, la norme C-Brick présente à la fois des avantages et des inconvénients évidents 4 ( c'est-à-dire l'efficacité de la ligature). Si l'efficacité de la ligature est améliorée, la norme peut être largement adoptée à l'avenir.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Nous remercions Shanghai Tolo Biotech pour son assistance technique lors du développement de la norme C-Brick. Ce travail a été soutenu par des subventions du Programme de recherche prioritaire stratégique de l'Académie chinoise des sciences (Subvention n ° XDB19040200).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Comercial Oligonucleotide Sangon Biotech
10x Taq PCR Buffer Transgen #J40928
Ultra Pure Distilled Water Invitrogen 10977-015
5x RNA Transcription Buffer Thermo Scientific K0441
T7 RNA polymerase Thermo Scientific #EP0111
NTP mixture Sangon #ND0056
RRI (Recombinant RNase Inhibitor) Takara 2313A
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015
UV-Vis Spectrometer Thermo Scientific Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer Vazyme PB505 PCR buffer
dNTPs Transgen AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase Vazyme P505-d1
Ezmax for One-step Cloning Tolobio 24303-1 seamless assembly kit
5x Buffer for Ezmax One-step Cloning Tolobio 32006
BamHI NEB #R0136L
BamHI-HF NEB #R3136L
BglII  NEB #R0144L
XbaI NEB #R0145L
SpeI NEB #R3133L
10x Buffer 3 NEB #B7003S
10x CutSmart Buffer NEB B7204S
10x T4 DNA ligase Buffer Tolobio 32002
T4 PNK Tolobio 32206
T4 DNA ligase Tolobio 32210
DpnI NEB #R01762
SV Gel and PCR clean-up system Promega A9282
Plasmid Mini Kit I Omega D6943-02 plasmid preparation kit
thermosensitive alkaline phosphatase  Thermo Scientific #EF0651 FastAP
10x Cpf1 buffer Tolobio 32008
Cpf1 Tolobio 32105 FnCpf1
thermocycler Applied Biosystems veriti 96 well
C-Brick standard vector Tolobio 98101
E. coli [DH10B] Invitrogen 18297010
Luria-Bertani media (tryptone) Oxoid LP0042
Luria-Bertani media (yeast extract) Oxoid LP0021
Luria-Bertani media (NaCl) Sangon Biotech B126BA0007

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References

  1. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
  3. Knight, T. Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).
  4. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  5. Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
  6. Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
  7. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  8. Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
  9. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  10. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from: http://www.tolobio.com/ (2017).
  13. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
  14. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  15. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  16. Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).

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Genetics biologie synthétique CRISPR Cpf1 C-Brick extrémités collantes assemblage d'ADN, Norme d'assemblage
Protocoles pour l'assemblage standard d'ADN de C-Brick utilisant Cpf1
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Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J.… More

Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1. J. Vis. Exp. (124), e55775, doi:10.3791/55775 (2017).

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