Sitio de Integración Retroviral Bidireccional Metodología de PCR y Flujo de Trabajo de Análisis de Datos Cuantitativos

Resumen

Este manuscrito describe el procedimiento experimental y el análisis de software para un ensayo de sitio de integración bidireccional que puede analizar simultáneamente el ADN de unión vector-huésped aguas arriba y aguas abajo. Los productos de PCR bidireccionales pueden utilizarse para cualquier plataforma de secuenciación aguas abajo. Los datos resultantes son útiles para una comparación cuantitativa de alto rendimiento de dianas de ADN integradas.

Resumen

Los ensayos del sitio de integración (IS) son un componente crítico del estudio de los sitios de integración retroviral y su importancia biológica. En estudios recientes de terapia génica retroviral, los ensayos de IS, en combinación con secuenciación de próxima generación, se han utilizado como una herramienta de seguimiento celular para caracterizar poblaciones de células madre clonales que comparten la misma IS. Para la comparación precisa de repoblar clones de células madre dentro y entre diferentes muestras, la sensibilidad de detección, la reproducibilidad de los datos y la capacidad de alto rendimiento del ensayo están entre las cualidades de ensayo más importantes. Este trabajo proporciona un protocolo detallado y flujo de trabajo de análisis de datos para el análisis bidireccional IS. El ensayo bidireccional puede secuenciar simultáneamente las uniones vector-huésped aguas arriba y aguas abajo. Comparado con los enfoques de secuenciación SI unidireccionales convencionales, el enfoque bidireccional mejora significativamente las tasas de detección de IS y la caracterización de eventos de integración en ambos extremos de tÉl se dirigió al ADN. La tubería de análisis de datos que aquí se describe con precisión identifica y enumera secuencias IS idénticas a través de múltiples pasos de comparación que mapean las secuencias de IS al genoma de referencia y determinan los errores de secuenciación. Utilizando un procedimiento de ensayo optimizado, hemos publicado recientemente los patrones detallados de repoblación de miles de clones de células madre hematopoyéticas (HSC) después del trasplante en macacos rhesus, demostrando por primera vez el momento preciso de la repoblación de HSC y la heterogeneidad funcional de HSCs en el Sistema de primates. El siguiente protocolo describe el procedimiento experimental paso a paso y el flujo de trabajo de análisis de datos que identifica y cuantifica con exactitud las secuencias IS idénticas.

Introducción

Los retrovirus insertan su ADN genómico en el genoma del huésped en varios sitios. Esta propiedad única, que puede contribuir al desarrollo de cánceres y otras formas de patogenia viral, tiene el beneficio irónico de hacer estos virus altamente susceptibles a la ingeniería celular para la terapia génica y la investigación básica de la biología. El Sitio de Integración viral (IS) - la ubicación en el genoma del host donde está integrado un ADN (virus) extraño - tiene implicaciones importantes para el destino tanto de los virus integrados como de las células huésped. Los ensayos de IS se han utilizado en diversos contextos de investigación biológica y clínica para estu....

Protocolo

1. Generación de las bibliotecas de secuencia de derivación (izquierda) y descendente (derecha)

1. Preparación del enlazador de ADN:
   1. Preparar una solución de ADN de ligador de 10 μL añadiendo 2 μL de oligos LINKER_A 100 μM (final: 20 μM), 2 μL de oligos LINKER_B 100 μM (final: 20 μM), 2 μL de NaCl 5 M (final: 1M) y 4 μL de agua libre de nucleasa en un tubo de PCR. Véase la Tabla 1 para las secuencias enlazadoras.
   2. Incubar la solución de ADN del enlazador a 95 ° C durante 5 min en un instrumento de PCR, detener el programa de ejecución y apagar el instrumento de PCR. Dejar la solución de enlazador en el instr....

Resultados

El bidireccional IS ensayo generado diferentes tamaños de PCR amplicones tanto para el upstream (izquierda) y aguas abajo (derecha) de acogida de acogida junturas ( Figura 2 ]. El tamaño de un amplicón de PCR depende de la localización del motivo GTAC más cercano aguas arriba y aguas abajo de un integro. El ensayo también produjo amplicones de PCR de ADN interno: las secuencias retrovirales cerca del tracto polipurino y el sitio de unión del cebador se ampli.......

Discusión

El ensayo bidireccional permite el análisis simultáneo de ambas secuencias de unión de ADN vector-huésped aguas arriba (izquierda) y aguas abajo (derecha) y es útil en una serie de aplicaciones de terapia génica, células madre y cáncer. El uso de enzimas GTAC-motivo (RsaI y CviQI) y el enfoque de PCR bidireccional mejora significativamente las posibilidades de detectar un integromo (o una población clonal) cuando se compara con anteriores enzimas de motivo TCGA- TaqαI ^{2 ,}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ADN polimerasa termoestable	Agilent	600424	PicoMaxx Polymerase
Tampón de ADN polimerasa termoestable	Agilent	600424	tampón de polimerasa PicoMaxx
Mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP) Mezcla de solución	N0447L	New England Biolabs	(10 mM cada uno)
Tubos de PCR	VWR International	53509-304	Tubos de tira de PCR con tubos de tira de PCR individuales Tapas adjuntas Tubo de
microcentrífuga de 2 mL Tubos	microcentrífuga	Molecular Bioproducts	3453
Kit de purificación de PCR	Qiagen	28106
RsaI	New England Biolabs	R0167L	enzima de restricción
CviQI	New England Biolabs	R0639L	enzima de restricción
Buffer A	New England Biolabs	B7204S	NEB CutSmart tampón
polimerasa I fragmento grande (klenow)	New England Biolabs	M0210L	Solución de
perlas de estreptavidina	embotantes Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER
kit Solución de unión	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER
kit Solución de lavado	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER
kit soporte magnético	ThermoFisher	12321D	DynaMag™-2 Imán
T4 ADN ligasa	New England Biolabs	M0202L	T4 ADN ligasa
10X T4 T4 Tampón de ADN ligasa	New England Biolabs	B0202S	T4 T4 tampón de reacción de ADN ligasa
5X T4 Tampón de ADN ligasa	Invitrogen	46300-018	Tampón de ADN ligasa T4 con espectrofotómetro UV-Vis de polietilenglicol-8000
	Fisher Scientific	S06497	Nanodrop 2000
pvuII	new England Biolabs	R0151L	enzima de restricción
sfoI	new England Biolabs	R0606L	enzima de restricción
Buffer B	New England Biolabs	B7203S	Tampón NEB 3.1
Agua libre de nucleasas	Tecnologías integradas de ADN	11-05-01-14
Electroforesis capilar	Qiagen	9001941	QIAxcel Electroforesis capilar Veriti
Termociclador rápido de 96 pocillos	Thermo Fisher Scientific	4375305	Instrumento de PCR
Rueda giratoria (o rodillo)	Eppendorf	M10534004	Tambores de rodillos de cultivo celular Tamaño del
ADN marcador	Qiagen	929559	QX marcador de tamaño (100 - 2.500 pb)
Marcador de tamaño de ADN	Qiagen	929554	marcador de tamaño QX (50 - 1.500 pb)
Marcadores de alineación de ADN	Qiagen	929524	QX Marcador de alineación
de ADN genomc ADN	no disponible	No disponible Muestra	de ADN genomc de experimentos in vivo o in vitro