Artículo de método

Sitio de Integración Retroviral Bidireccional Metodología de PCR y Flujo de Trabajo de Análisis de Datos Cuantitativos

DOI:

10.3791/55812

⸱

14 de junio de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UCLA AIDS Institute, University of California at Los Angeles (UCLA), 2Department of Microbiology, Immunology, & Molecular Genetics, University of California at Los Angeles (UCLA), 3Departments of Biomathematics and Mathematics, University of California at Los Angeles (UCLA), 4Personalized Genomic Medicine Research Center, Division of Strategic Research Groups, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 5Department of Medicine, University of California at Los Angeles (UCLA), 6Department of Veterinary Biosciences, College of Veterinary Medicine, The Ohio State University (OSU)

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito describe el procedimiento experimental y el análisis de software para un ensayo de sitio de integración bidireccional que puede analizar simultáneamente el ADN de unión vector-huésped aguas arriba y aguas abajo. Los productos de PCR bidireccionales pueden utilizarse para cualquier plataforma de secuenciación aguas abajo. Los datos resultantes son útiles para una comparación cuantitativa de alto rendimiento de dianas de ADN integradas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los ensayos del sitio de integración (IS) son un componente crítico del estudio de los sitios de integración retroviral y su importancia biológica. En estudios recientes de terapia génica retroviral, los ensayos de IS, en combinación con secuenciación de próxima generación, se han utilizado como una herramienta de seguimiento celular para caracterizar poblaciones de células madre clonales que comparten la misma IS. Para la comparación precisa de repoblar clones de células madre dentro y entre diferentes muestras, la sensibilidad de detección, la reproducibilidad de los datos y la capacidad de alto rendimiento del ensayo están entre las cualidades de ensayo más importantes. Este trabajo proporciona un protocolo detallado y flujo de trabajo de análisis de datos para el análisis bidireccional IS. El ensayo bidireccional puede secuenciar simultáneamente las uniones vector-huésped aguas arriba y aguas abajo. Comparado con los enfoques de secuenciación SI unidireccionales convencionales, el enfoque bidireccional mejora significativamente las tasas de detección de IS y la caracterización de eventos de integración en ambos extremos de tÉl se dirigió al ADN. La tubería de análisis de datos que aquí se describe con precisión identifica y enumera secuencias IS idénticas a través de múltiples pasos de comparación que mapean las secuencias de IS al genoma de referencia y determinan los errores de secuenciación. Utilizando un procedimiento de ensayo optimizado, hemos publicado recientemente los patrones detallados de repoblación de miles de clones de células madre hematopoyéticas (HSC) después del trasplante en macacos rhesus, demostrando por primera vez el momento preciso de la repoblación de HSC y la heterogeneidad funcional de HSCs en el Sistema de primates. El siguiente protocolo describe el procedimiento experimental paso a paso y el flujo de trabajo de análisis de datos que identifica y cuantifica con exactitud las secuencias IS idénticas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los retrovirus insertan su ADN genómico en el genoma del huésped en varios sitios. Esta propiedad única, que puede contribuir al desarrollo de cánceres y otras formas de patogenia viral, tiene el beneficio irónico de hacer estos virus altamente susceptibles a la ingeniería celular para la terapia génica y la investigación básica de la biología. El Sitio de Integración viral (IS) - la ubicación en el genoma del host donde está integrado un ADN (virus) extraño - tiene implicaciones importantes para el destino tanto de los virus integrados como de las células huésped. Los ensayos de IS se han utilizado en diversos contextos de investigación biológica y clínica para estudiar la selección y la patogénesis del sitio de integración retroviral, el desarrollo del cáncer, la biología de células madre y la biología del desarrollo 1 , 2 , 3 , 4 . La baja sensibilidad de detección, la baja reproducibilidad de los datos y la frecuente contaminación cruzadaLos factores clave que limitan las aplicaciones de los ensayos de IS a los estudios actuales y previstos.

Se han desarrollado muchas tecnologías de análisis de IS. Los ensayos de sitios de integración basados ​​en enzimas de restricción, que incluyen la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) 5 , la PCR inversa 6 y la PCR 7 de Medición de Amplificación Lineal (LAM), son las más ampliamente utilizadas. El uso de enzimas de restricción específicas de sitio, sin embargo, genera un sesgo durante la recuperación de la IS, permitiendo sólo un subconjunto de integromes (un ADN extraño integrado en el genoma del huésped) en la vecindad del sitio de restricción a ser recuperado [ 4] . En los últimos años también se han introducido tecnologías de ensayo que evalúan de forma más exhaustiva el vector IS. Estos ensayos emplean diversas estrategias, incluyendo la PCR 8 mediada por transposón Mu, la PCR 9 no restrictiva (nr) -LAM, la enzima de restricción tipo IILa digestión edificada 10 , el cizallamiento mecánico 11 y la PCR aleatoria basada en hexámero (Re-PCR libre) 12 , para fragmentar ADN genómicos y amplificar IS. Las tecnologías actuales tienen diferentes niveles de sensibilidad de detección, cobertura del genoma, especificidad del objetivo, capacidad de alto rendimiento, complejidad de los procedimientos de ensayo y sesgos en la detección de las frecuencias relativas de los sitios objetivo. Dadas las diferentes cualidades de los ensayos existentes y la variedad de propósitos para los cuales pueden ser usados, el enfoque de ensayo óptimo debe ser cuidadosamente seleccionado.

Este trabajo proporciona procedimientos experimentales detallados y un flujo de trabajo de análisis de datos computacionales para un ensayo bidireccional que mejora significativamente las tasas de detección y precisión de cuantificación de secuencias analizando simultáneamente el IS aguas arriba y aguas abajo del ADN diana integrado (ver la Figura 1 para una vista esquemática de los procedimientos de ensayo ). Este enfoque tambiénS los medios para caracterizar el proceso de integración retroviral (por ejemplo, la fidelidad de la duplicación del sitio objetivo y las variaciones en las secuencias genómicas de inserciones aguas arriba y aguas abajo). Se han utilizado otros métodos bidireccionales principalmente para clonar y secuenciar ambos extremos del ADN diana 11 , 13 , 14 . Este ensayo se optimiza ampliamente para la cuantificación de alto rendimiento y reproducible de clones marcados con vectores, utilizando el método LM-PCR bien establecido y la cartografía de análisis computacional, y para cuantificar las uniones tanto aguas arriba como aguas abajo. El análisis bidireccional con la enzima TaqαI ha demostrado ser útil para la cuantificación clonal de alto rendimiento en estudios preclínicos de terapia génica de células madre 2 , 15 . Este artículo describe un método modificado que utiliza un cortador más frecuente (RsaI / CviQI - motivo: GTAC) que dobla tLas posibilidades de detectar integromes en comparación con un ensayo basado en TaqαI . Se describen procedimientos experimentales detallados y procedimientos de análisis de datos que utilizan enzimas con motivo GTAC para el análisis IS vectorial lentiviral (NL4.3 y sus derivados) y gamma-retroviral (vectores pMX). Los oligonucleótidos usados ​​en el ensayo se enumeran en la Tabla 1 . En el documento complementario se proporciona un script de programación interno para el análisis de secuencias de IS.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generación de las bibliotecas de secuencia de derivación (izquierda) y descendente (derecha)

  1. Preparación del enlazador de ADN:
    1. Preparar una solución de ADN de ligador de 10 μL añadiendo 2 μL de oligos LINKER_A 100 μM (final: 20 μM), 2 μL de oligos LINKER_B 100 μM (final: 20 μM), 2 μL de NaCl 5 M (final: 1M) y 4 μL de agua libre de nucleasa en un tubo de PCR. Véase la Tabla 1 para las secuencias enlazadoras.
    2. Incubar la solución de ADN del enlazador a 95 ° C durante 5 min en un instrumento de PCR, detener el programa de ejecución y apagar el instrumento de PCR. Dejar la solución de enlazador en el instrumento durante 30 minutos para enfriar lentamente el ADN del engarce. La solución de ADN enlazador se puede almacenar a 4ºC.
  2. Extensión de cebador de biotina específica de LTR:
    1. Utilizar un espectrofotómetro UV-Vis para determinar la concentración de ADN y los valores de 260/280 nm del ADN genómico de in vivoO experimentos in vitro . Diluir 1-2 μg de ADN genómico de muestra hasta un volumen final de 170 μl de solución de ADN genómico utilizando agua libre de nucleasa.
    2. Preparar una reacción de PCR de 200 μL mezclando 2,5 μl de cada uno de 10 μM de cebadores de biotina específicos para HIV-1 (L-BP y R-BP en la Tabla 1 : total de 10 μl para cuatro cebadores específicos de lentivirus), 20 μl de 10X termoestable ADN polimerasa, 4 μL de dNTP 10 mM (final: 200 μM de cada dNTP), 3 μL de 2,5 U / μl de ADN polimerasa termoestable y 163 μL de ADN genómico.
      NOTA: Para los vectores gammaretrovirales (vectores pMX), utilice 5 μl de cada uno de dos cebadores de biotina específicos de pMX 10 μM (L-BP y R-BP: total de 10 μl) en lugar de los cuatro cebadores de biotina específicos de HIV-1 anteriores.
    3. Se divide la solución en cuatro tubos de PCR (cada 50 μl) y se lleva a cabo un único ciclo de extensión bajo las siguientes condiciones: 94 ° C durante 5 min, 56 ° C durante 3 min, 72 ° C durante 5Min, y 4 ° C para el almacenamiento.
    4. Reúna las cuatro reacciones de PCR en un tubo de microcentrífuga de 2 ml y siga el procedimiento de purificación por PCR del kit de purificación de PCR. Eluir con 50 μl de tampón de elución (5 veces el tampón de elución diluido en agua proporcionado en el kit). Proceder inmediatamente con el paso 1.3.1 o almacenar el ADN eluido a -20ºC.
  3. RsaI y CviQI digestión
    1. Preparar una reacción de digestión de 100 μL añadiendo 50 μl de ADN (de la etapa 1.2.4), 10 μl de 10 μg de tampón A y 2 μl (20 μl) de enzima RsaI. Incubar a 37 ° C durante 1 h en un instrumento de PCR.
    2. Añadir 1 μl (10 U) de enzima CviQI a la reacción e incubar a 25 ° C durante 30 min en un instrumento de PCR. Proceda inmediatamente con el paso 1.4.1
  4. Extremo romo:
    1. Preparar una mezcla de 4,5 μL que contiene 2,5 μL de fragmento grande de ADN Polimerasa I (klenow) y 2 μL de dNTP 10 mM. Transferencia 181; L de la mezcla a la muestra de ADN de la etapa 1.3.2. El volumen total será de 102 μl. Mezclar bien por vórtex e incubar a 25 ° C durante 1 h en un instrumento de PCR. Proceda inmediatamente con el paso 1.6.1.
  5. Preparación de perlas de estreptavidina:
    1. Vórtice brevemente la solución de perlas de estreptavidina y transfiera 50 μl a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml. Eliminar el sobrenadante usando el soporte magnético y lavar las perlas con 200 μl de solución de unión.
    2. Resuspender las perlas en 100 μl de solución de unión y colocar el tubo lejos del soporte magnético. Proceda inmediatamente con el paso 1.6.1.
  6. Estreptavidina:
    1. Transferir 100 μl del ADN de la muestra (paso 1.4.1) a la solución de 100 μL de resuspensión suspendida (paso 1.5.2) y mezclar cuidadosamente pipeteando para evitar cualquier formación de espuma de la solución. Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 3 h en una rueda giratoria o en un rodillo.
    2. Utilice el soporte magnético para capturar las perlas y deseche el sobrenadante. Lavar las perlas dos veces en 400 μl de solución de lavado y dos veces en 400 μl de tampón de DNA-ligasa 1x T4 (diluido de solución 10X usando agua libre de nucleasa).
    3. Resuspender las perlas en 200 μl de tampón de ADN ligasa 1x4 T4 (diluido de solución 10X con agua libre de nucleasa) y colocarlo lejos del soporte magnético. Proceda inmediatamente con el paso 1.7.1.
  7. Enlace ligador:
    1. Preparar una solución de reacción de ligadura de 400 μl en un tubo de microcentrífuga de 2 ml mezclando 0,5 μl del adaptador de ADN (paso 1.1.2), 10 μl de tampón de ADN ligasa 10 x T4, 20 μl de tampón 5X de ADN ligasa T4 (que contiene 25% de polietileno Glicol), 5 μl de ADN ligasa T4, 164,5 μl de agua libre de nucleasa y 200 μl de perlas re-suspendidas (etapa 1.6.3). Colocar el tubo de reacción en la rueda giratoria e incubar a RT (22 ° C) durante 3 h (o 16 ° CO / N).
    2. Lavar las perlas dos veces con la solución de lavado y dos veces con tampón de ADN polimerasa 1X termoestable (diluido a partir de solución 10x usando agua libre de nucleasa) usando el soporte magnético.
    3. Resuspender las perlas en 50 μ l de 1x buffer de PCR polimerasa de ADN termoestable y colocarlo lejos del soporte magnético. Proceda inmediatamente con el paso 1.8.1 o guarde a 4 ° C durante un máximo de un día.
  8. Pre-amplificación del ADN de la unión izquierda y derecha:
    1. Preparar una reacción de PCR de 200 μL añadiendo 10 μl de cebador 1L 10 μM, 10 μL de cebador 1R 10 μM, 20 μL de cebador Primer 10 μM (Tabla 1), 10 μL de tampón 10X de ADN polimerasa termoestable, 4 μL de DNTP 10 mM (final: 200 μM de cada dNTP), 8 μl (20 U) de ADN polimerasa termoestable y 88 μl de agua libre de nucleasa a las perlas re-suspendidas (50 μl) de la etapa 1.7.3.
    2. Alícuota de la mezcla de reacción en 4 tubos de PCR (cada 501; L) y llevar a cabo la PCR con la siguiente condición: 94 ° C de incubación durante 2 min; 25 ciclos de 94ºC durante 20 s, 56ºC durante 25 s, y 72ºC durante 2 min; Y una extensión final a 72 ° C durante 5 min.
    3. Reúna las 4 reacciones de PCR en un tubo de microcentrífuga de 2 mL y siga el procedimiento de purificación por PCR del kit de purificación de PCR. Eluir con 50 μl de tampón de elución.
    4. Determinar la concentración de ADN y los valores de 260/280-nm utilizando un espectrofotómetro UV-Vis; El ADN se puede almacenar a -20 ° C hasta que esté listo para el siguiente paso. Proceda con los pasos 1.9.1 / 1.10.1 (opcional) o directamente con los pasos 1.11.1 / 1.12.1.
  9. Eliminación del amplicón de ADN interno del lado izquierdo (opcional):
    1. Transferir hasta 100 ng de producto de ADN de PCR del paso 1.8.4 a un tubo de microcentrífuga de 2 ml y ajustar el volumen a 10 μl usando agua libre de nucleasa.
    2. Preparar una reacción de enzima de restricción dirigida específicamente a la D interna del lado izquierdoNA amplicón.
      NOTA: La condición de reacción puede diferir dependiendo de la elección de la enzima. Por ejemplo, cuando se elimina el ADN interno del lado izquierdo de vectores lentivirales basados ​​en NL4.3, se añade 1 μl de pvuII , 2 μl de tampón B y 7 μl de agua libre de nucleasa. Incubar a 37 ° C durante 1 h en un instrumento de PCR. Proceda inmediatamente con el paso 1.11.1 o guarde a -20 ° C.
  10. Eliminación del amplicón de ADN interno del lado derecho (opcional):
    1. Proceda de la misma manera que en el paso 1.9.1.
    2. Prepare una reacción de enzima de restricción dirigida específicamente al amplicón de ADN interno del lado derecho.
      NOTA: Por ejemplo, al eliminar el ADN interno del lado derecho de vectores lentivirales basados ​​en NL4.3, añada 1 μl de sfoI , 2 μl de tampón B y 7 μl de agua libre de nucleasa. Incubar a 37 ° C durante 1 h en un instrumento de PCR. Proceda inmediatamente con el paso 1.12.1 o guarde a -20 ° C.
  11. Izquierda- amplificación específica de la función:
    1. Preparar una reacción de PCR de 50 μL mezclando 5 μl de ADN del paso 1.8.4 (o del paso opcional 1.9.2), 5 μl de cebador 2L de 10 μM (final: 1 μM), 5 μl de cebador de cebador 10 μM Link2 (Final: 1 μM), 5 μl de tampón de polimerasa de ADN termoestable 10x, 1 μl de dNTP 10 mM (final: 200 μM de cada dNTP), 2 μl (5 μl) de ADN polimerasa termoestable y 27 μl de nucleasa libre de nucleasa agua.
    2. Realizar la PCR con la siguiente condición: 94 ° C de incubación durante 3 min; 8-15 ciclos de 94 ° C durante 20 s, 56 ° C durante 25 s, y 72 ° C durante 2 min; Y una extensión final a 72 ° C durante 5 min.
      NOTA: El ADN amplificado puede almacenarse a -20 ° C. * Se sugiere la optimización del número de ciclos.
    3. Siga el procedimiento de purificación por PCR del kit de purificación de PCR. Eluir con 50 μl de tampón de elución. Determine la concentración de ADN y los valores de 260/280 nm.
  12. Amplificación específica de la unión derecha:
    1. Todos los procedimientos son idénticos a "amplificación específica de unión a la izquierda" (pasos 1.11.1-1.11.3), excepto por el uso de diferentes cebadores; Utilice el cebador específico de unión a la derecha (cebador 2R, ver Tabla 1 ) en este paso.
  13. Prueba de variación de longitud del amplicón de PCR:
    1. Analizar las variaciones de la longitud del amplicón de PCR mediante la realización de electroforesis en gel de agarosa al 2% o electroforesis capilar ( Figura 2 ).
      NOTA: Este es un paso esencial para confirmar la finalización de los procedimientos de ensayo y para hacer una evaluación aproximada de los patrones de IS basados ​​en los patrones de banda de PCR. El amplicón de PCR purificado de las etapas 1.11.3 y 1.12.3 puede usarse para diversas plataformas de secuenciación de ADN. Proceda con los procedimientos de preparación de muestras apropiados para la secuenciación clásica de cadena (Sanger) o secuenciación de próxima generación. El ADN se puede almacenar a -20 °;DO.

2. Análisis de Secuencia IS Computacional

  1. Preparación de archivos de datos:
    1. Prepare tres archivos de datos de entrada: un archivo de datos de secuencia de formato fasta (Test_data.fa en datos suplementarios), un archivo tsv para los motivos de búsqueda para secuencias de vector y enlazador (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv en datos suplementarios) y un archivo tsv para información de enzimas de restricción (Enzyme.tsv en datos suplementarios).
      NOTA: Estos archivos son necesarios para demultiplexar, recortar secuencias de vector y enlazador, y eliminar secuencias de vector interno ( Figura 3A ). En el archivo README.txt de los datos suplementarios se proporcionan instrucciones detalladas paso a paso para implementar el flujo de trabajo computacional.
  2. Análisis computacional:
    1. Ejecutar demultiplexing y recortar scripts.
      NOTA: La secuencia en bruto se procesará para demultiplexación y para la trimminG de las secuencias de vector, enlazador y cebador (vea STEP-1 en el archivo README.txt complementario).
    2. Ejecute el comando mapping (vea STEP-2 en el archivo README.txt) para asignar las secuencias procesadas al genoma de referencia usando una herramienta de alineación similar a BLAST (BLAT; www.genome.ucsc.edu).
    3. Ejecute el script de análisis cuantitativo IS (consulte STEP-3 en el archivo README.txt).
      NOTA: Se generarán dos archivos de salida (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt y Final_count.txt). Más detalles sobre la cartografía y las estrategias de enumeración de secuencias se pueden encontrar en el "archivo README.txt en los datos complementarios y en publicaciones anteriores 2 , 15 .

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El bidireccional IS ensayo generado diferentes tamaños de PCR amplicones tanto para el upstream (izquierda) y aguas abajo (derecha) de acogida de acogida junturas ( Figura 2 ]. El tamaño de un amplicón de PCR depende de la localización del motivo GTAC más cercano aguas arriba y aguas abajo de un integro. El ensayo también produjo amplicones de PCR de ADN interno: las secuencias retrovirales cerca del tracto polipurino y el sitio de unión del cebador se ampli...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El ensayo bidireccional permite el análisis simultáneo de ambas secuencias de unión de ADN vector-huésped aguas arriba (izquierda) y aguas abajo (derecha) y es útil en una serie de aplicaciones de terapia génica, células madre y cáncer. El uso de enzimas GTAC-motivo (RsaI y CviQI) y el enfoque de PCR bidireccional mejora significativamente las posibilidades de detectar un integromo (o una población clonal) cuando se compara con anteriores enzimas de motivo TCGA- TaqαI 2 ,

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El financiamiento fue proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones R00-HL116234, U19 AI117941, y R56 HL126544; La Fundación Nacional de Ciencias Grant DMS-1516675; La Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); Y el programa de la iniciativa KRIBB.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ADN polimerasa termoestableAgilent600424PicoMaxx Polymerase
Tampón de ADN polimerasa termoestableAgilent600424tampón de polimerasa PicoMaxx
Mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP) Mezcla de soluciónN0447LNew England Biolabs(10 mM cada uno)
Tubos de PCRVWR International53509-304Tubos de tira de PCR con tubos de tira de PCR individuales Tapas adjuntas Tubo de
microcentrífuga de 2 mL TubosmicrocentrífugaMolecular Bioproducts3453
Kit de purificación de PCRQiagen28106
RsaI New England BiolabsR0167Lenzima de restricción
CviQINew England BiolabsR0639Lenzima de restricción
Buffer ANew England BiolabsB7204SNEB CutSmart tampón
polimerasa I fragmento grande (klenow) New England BiolabsM0210LSolución de
perlas de estreptavidinaembotantes Invitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER
kit Solución de uniónInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER
kit Solución de lavadoInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER
kit soporte magnéticoThermoFisher12321DDynaMag™-2 Imán
T4 ADN ligasaNew England BiolabsM0202LT4 ADN ligasa
10X T4 T4 Tampón de ADN ligasaNew England BiolabsB0202ST4 T4 tampón de reacción de ADN ligasa
5X T4 Tampón de ADN ligasaInvitrogen 46300-018Tampón de ADN ligasa T4 con espectrofotómetro UV-Vis de polietilenglicol-8000
Fisher ScientificS06497Nanodrop 2000
pvuIInew England BiolabsR0151Lenzima de restricción
sfoInew England BiolabsR0606Lenzima de restricción
Buffer BNew England BiolabsB7203STampón NEB 3.1
Agua libre de nucleasasTecnologías integradas de ADN11-05-01-14
Electroforesis capilarQiagen9001941QIAxcel Electroforesis capilar Veriti
Termociclador rápido de 96 pocillosThermo Fisher Scientific4375305Instrumento de PCR
Rueda giratoria (o rodillo)EppendorfM10534004Tambores de rodillos de cultivo celular Tamaño del
ADN marcadorQiagen929559QX marcador de tamaño (100 - 2.500 pb)
Marcador de tamaño de ADNQiagen929554marcador de tamaño QX (50 - 1.500 pb)
Marcadores de alineación de ADNQiagen929524QX Marcador de alineación
de ADN genomc ADNno disponibleNo disponible Muestrade ADN genomc de experimentos in vivo o in vitro
dNTP de de ADN

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
  2. Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
  3. Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
  4. Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
  5. Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
  6. Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150(1990).
  7. Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
  8. Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72(2011).
  9. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  10. Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
  11. Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
  12. Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
  13. Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
  14. Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543(2014).
  15. Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
  16. Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234(2004).
  17. Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  18. Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284(2013).
  19. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
  22. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
  23. Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Metodolog a de PCR bidireccionalan lisis del sitio de integraci nflujo de trabajo de cuantificaci n clonalc lula madre hematopoy ticauniones vector hu spedelectroforesis capilarflujo de an lisis de datoskit de purificaci n de PCRuni n a esferas de estreptavidina

Artículos relacionados