Summary
Evnen til å nøyaktig oppdage utskrifter eller proteiner i Drosophila vev er avgjørende for å studere sin overflod og lokalisering knyttet til utviklingsprosessen. Her er beskrivelsen av en ukomplisert prosedyre å dissekere pupal vinger. Dette kan brukes som prøver i flere teknikker (immunohistochemistry, PCR analysen, osv.).
Abstract
Vingen utvikling i Drosophila melanogaster er en ideell modell for å studere morphogenesis på vev nivå. Disse vedheng utvikle fra en gruppe celler kalt fløyen imaginal plater dannet under embryonale utviklingen. I larver stadier vokser imaginal platene, øker antall celler og danner monolayered epitel strukturer. Inne i pupal saken, imaginal platene bud ut og kaste inn bilayers på en linje som blir fremtidige margen av vingen. Under denne prosessen stamme langsgående primodia venene blodåre celler på potensielle dorsal og ventrale overflater av vingen. Under pupal stadium kommuniserer stripene blodåre celler for hver overflaten for å generere tett rør; samtidig begynner cross-vener deres dannelse.
Med hjelp av aktuelle molekylære markører er det mulig å identifisere de store elementene komponere vingen under utviklingen. Derfor er muligheten til å nøyaktig oppdage utskrifter eller proteiner i denne strukturen avgjørende for å studere sin overflod og lokalisering knyttet til utviklingsprosessen av vingen.
Fremgangsmåten beskrevet her fokuserer på manipulere pupal vinger, gir detaljerte instruksjoner om hvordan å analysere vingen under pupal stadium. Disseksjon av pupal vev er vanskeligere å utføre enn sine kolleger i tredje skikkelsen larver. Det er derfor denne tilnærmingen ble utviklet, til å innhente rask og effektiv høykvalitets prøver. Detaljer om hvordan immunostai og mount prøvene vingen, å tillate visualisering av proteiner eller cellen komponenter, tilbys i protokollen. Med liten ekspertise er det mulig å samle 8-10 høykvalitets pupal vinger på kort tid.
Introduction
Drosophila vingene er utviklet fra vingen imaginal platene. Primordial disse fløyen plater er satt til side under embryonale utviklingen som små grupper av 20-30 imaginal celler som invaginate fra embryonale epitel. Mens Larvene vokser til tredje skikkelsen scenen, oppstår mitose i imaginal cellene til bestemte karakteristiske tider øke sine tall (ca 50000 celler) og danner vingen plate1,2,3, 4. Som cellene sprer, mote de en rørformet epitel, noe som resulterer i en selv sammenleggbar kompakt spiral. Under pupation, plate epitel teleskoper ut til skjemaet i to lag fløyen og langsgående venene starte som hull mellom dem, som oppstår to ganger under vingen utviklingsmessige5,6.
Ordningen av årer alltid har en identisk mønster; evnen å lett identifisere hver endring i årer dannelsen gjør mutasjoner ekstremt synlig (f.eks manglende eller overflødige vener, endringer i blodåre posisjoner, etc.). Interessant, er fenotype variantene vanligvis bevis på mutasjoner i kjent eller romanen komponenter signalnettverk trasé som er relevante for vinge utvikling. En av veiene som spiller en rolle i å bestemme posisjonen og opprettholde vene og intervein områder er Hedgehog (Hh) veien6,7,8.
Gitt viktigheten av den pupal vingen som modellsystem, vil det være viktig å få god kvalitet prøver å jobbe med. Tidligere har forskere har publisert for å analysere Drosophila vinger ikke gitt en passende guide å oppnå gode eksempler. Uten veiledning av en forsker kan ikke en tydelig visualisere prosessen. I disse alternative dissecting tilnærminger er puppe delt i to, skille vingen fra omkringliggende vev og gjentatte ganger vasket for å fjerne rusk. Denne typen tilnærming hevder å forlate vingen gratis forurenser men på grunn av tidligere erfaring prosessen er tregere og det er en høyere sjanse for at strukturen av skjøre vinger9.
Fremgangsmåten som er beskrevet her er utviklet av etterspørselen å finne en rask og effektiv metode for å få pupal fløyen prøver egnet til å gjenkjenne spesifikke proteiner eller transkripsjoner immunodetection protokoller eller polymerase kjedereaksjon (PCR) analyser. For å illustrere dette, uttrykk og lokalisering av lappet (Ptc eller Kanonisk reseptoren av Hh veien) registreres i pupal fløyen prøver, gir en protokoll som inneholder relevante detaljer å kunne gjennomføre hele prosedyre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dag 1
1. innsamling og dyrking pupae.
- Fjerne 0t etter blodsugende formasjon (APF) eller prepupae med en våt pensel fra kulturperler ampuller og plassere dem i nye ampuller nesten fullføre utviklingsperioden (se 2.1 og 2.2).
Merk: En sunn befolkningen av fluer bør opprettholdes ved hjelp av standardprotokoller for dyrking. Etter tre eller fire dager der eggene er lagt, kan voksne fjernes fra ampuller tillate en optimal videreutvikling av enkeltpersoner. De vedlikeholdes på en konstant temperatur til tredje skikkelsen Larvene starte pupation. Larver/pupal overgangen er merket med dannelsen av prepupa vurdert 0t APF. Prepupa er en ubevegelig hvite Larven som har en avlange, runde figuren med utstikkende fremre voksne.
Dag 2
2. overføring, disseksjon og fiksering.
- Overføre pupae (2t før utbyggingen tid er komplett) med en pensel, til mikroskopet lysbildet med dobbeltsidig tape overholdt den. Plasser pupae å danne en rad med dorsal sider opp og cephalic slutter vendt i samme retning.
- Returnere microscope skyve til konstant temperatur og la pupae å fullføre riktig utviklingsmessige tid (dvs. 24-30 h APF).
Merk: Mikroskopet lysbildet med dobbeltsidig tape vil være en forbigående disseksjon plattform å fjerne pupal tilfelle (se nedenfor). Tidsforløp på mikroskopet lysbildet (utenfor ampullen) bidrar til å tørke pupal saken gjør det lett skjør med tang. - Fjern bløtdyr fra pupal saken ved hjelp av pinsett.
- Bryte saken med tang (som vist i videoen) gjør en linje langs siden av puppen caudal slutten på den. Med riktig belysning er det mulig å oppdage puppe gjør tydelig et mellomrom like over hengselet av pupal vingen formen. Dette fungerer som en guide til å utføre åpningen uten å skade puppe.
- Fjerne deler av saken, plukke dem opp ved åpnet grensen og bære dem til motsatt side hvor dobbeltsidig tape vil holde. På slutten av dissection blir pupae nesten "naken", bare en liten bit av saken vil dekke bakre spissen.
Merk: Hensikten med at en liten mengde saken på øvre caudal slutten er å sikre en jevn frigjøring fra saken på lysbildet med dobbeltsidig tape. Begrunnelsen bak denne handlingen er fordi hvis du fjerner for mye av saken du sterkt risikere å skade puppe. På den annen side hvis du fjerner for lite, vil puppe ikke lett komme gratis saken. - Trykk ned (med tang) resten av saken. Denne bevegelsen vil øke den fremre delen av puppe, slik at både hode og brystkasse å bo i en fortrinnsrett posisjon å følge og overføres i det påfølgende trinnet.
- Ta et nytt lysbilde med dobbeltsidig tape og invertere det på puppe eller pupae rad. Det anbefales at du utfører denne tilnærmingen ved å observere bevegelser ved hjelp stereomicroscope å forhindre brudd på pupae.
- Trykk lett for å få pupae stikke på båndet og forsiktig glir lysbildet du vil fjerne pupae fra resten av sakene. Invertere microscope skyve: pupae vil bli sittende fast på dorsal side på nivå med hodet / thorax området.
- Dekker alle de nakne pupae med 4% paraformaldehyde og vente 10 min. I vår erfaring hjelper denne medgått tid med bindemiddel endre konsistensen av cuticle gjør det fast, mindre klissete og lett å håndtere.
Merk: For å utføre ribonukleinsyre (RNA) utvinning, erstatning paraformaldehyde for fosfat-bufret saltvann (PBS) med RNase gratis vann og fjerne pupal vingene å gjøre et kutt (med hjelp av saks) nær hengslene poenget med hver appendage. Ved hjelp av pinsett, overføre pupal vingen til et microcentrifuge rør med 1 mL av guanidinium thiocyanate og fenol reagens. Etter samle totalt 50-80 vinger, lagre microcentrifuge røret ved-80 ° C før utføre RNA utvinning10,11. - Lag et lite innsnitt på hengslene regionen av vingen eller i nærheten. Tillate bindemiddel nå fløyen epitel. Bruke en pipette (p200) flush etappe, den stabiliserende over vingen. Når erstatte fixate den forurensede med nye. Etter flushing, holde fløyen i bindemiddel i 5 min.
Merk: Selv om denne manøveren bidrar til å fjerne fleste av forurensende vev, noen hemocytes og fett dråper kan være fanget i mellom dorsal og ventrale epiteliale lag av vingen (se figur 1A). - Rive med tang fra cuticle grenser (som vist i videoen) utvide hullet og aktivere utgivelsen av vingen epitel fra cuticle sac. Når fløyen vevet slippes, la den i paraformaldehyde løsningen å fullføre 30 min av fiksering.
- Overføre fast vingene til en 4-vellet plast parabolen fylt med PBST (Triton X-100 0,05%). Store natten på 4 ° C.
Dag 3
3. primære antistoff inkubasjon.
- Permeabilize vev rugende pupal vingene i PBST (Triton X-100 0,2%) i 15 min med en rocking plattform for å lette en mild flytende medium bevegelse.
Merk: Før montering prøvene, bør trinnene utføres med en rocking plattform. - Blokkere prøvene bruker PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) 1t.
- Bruke samme buffer til å utvanne det primære antistoffet (mus anti-Ptc, 1: 100) og ruge pupal vingene overnatting på 4 ° C.
Dag 4
4. sekundære antistoff inkubasjon.
- Vask prøver 4 x 10 min hver med PBST (Triton X-100 0,05%)
- Inkuber med sekundær antistoff (f.eksanti-musen konjugert til fluorochrome) utvannet til riktig konsentrasjon i PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) i romtemperatur i mørket, 2T.
Merk: Hvis det er relevant, kan du bruke 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og/eller phalloidin til counterstain vev. Legg til disse sonder med sekundær antistoffer hensyntatt utslipp bølgelengden til fluorochromes å forhindre overlapping av signaler. - Vask prøver 4 x 10 min hver med PBST (Triton X-100 0,05%)
5. montering
- Forberede et utvalg lysbilde ved å plassere 4 prikker av gjennomsiktig neglelakk på mikroskopet lysbildet som om de var hjørnene i en firkant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen tilbyr en enkel metode for å få pupal fløy eksempler som beholder kjent morfologi av vingen. Fra disse forberedelsene er det mulig å få stabler av bilder som kan vises som 2-D eller 3-D, undersøke distribusjon og/eller anriking av proteiner under differensiering av vingen. En lignende protokoll kan (se merknad i 2.9) brukes til å samle inn store pupal fløyen prøven (med 50-80 pupal vinger) nødvendig å syntetisere komplementære deoksyribonukleinsyre (cDNA), malen som brukes i PCR reaksjoner.
Figur 1 : Pinnsvinet veien genet i Drosophila pupal vinger
(A) lappet, Kanonisk reseptoren av pinnsvinet veien, var visualisert på 24-30 h APF bruker musen anti - Ptc. kjerner var counterstained med DAPI mens begrepsordbok filamenter er visualisert ved hjelp av en grønn-fluorescerende phalloidin. Utgangen distribusjon hjelper for å lokalisere fløyen årer og dens forhold med lappet uttrykk. Samtidig avslører phalloidin flekken noen hemocytes og fett dråper (store ringer) som forurensende vev. 20 x forstørrelse, anterior skjer. Skalere bar, 100 µm (B) Amplicons til utgangen (lane 1, 280 bp) og ptc (kjørefelt 2, 236 bp) ble hentet ved hjelp av cDNA synthetized fra budbringer RNA (mRNA) fløyen prøve generert av en lignende disseksjon protokoll. MW molekylvekt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden disseksjon beskrev i denne videoen kan brukes til å lage høykvalitets prøver Drosophila pupal vinger fra ulike stadier for mange typer teknikker (f.eks immunofluorescence, cDNA syntese PCR råolje-terminaler, i vitro wing utvikling). I denne metoden har forskeren involvert brukt 24-30 h APF. Men det bør være ingen hindring i grunnleggende trinnene i Disseksjon av yngre eller eldre puppe. Endringer må gjøres for å imøtekomme mindre scenen puppe.
Protokollen kan utføres for å dissekere en puppe eller flere pupae samtidig. Dette bidrar til å akselerere fremgangsmåten gjør det lettere å nå et stort antall vinger dissekert. I dette tilfellet er det muligheten til å fjerne en rad med 4-5 pupae samtidig. Du kan fjerne pupae sammen eller hvis det ikke er mulig, fortsette å fjerne individuelt på det samme lysbildet (se Seksjon III av videoen: "Flere pupae disseksjon"). For å fjerne naken puppe fra åpnet saken, er det viktig at den bakre tipset er liten nok. Det er mulig å fjerne saken helt; Selv om det ville gjøre overføringen raskere, fjerning av hele saken er utfordrende og det er en større risiko for å skade puppe.
Erfaring tilsier at en viktig manøver vurdere er å forlate (siste 2 h å fullføre fastsatt utviklingstid) puppe knyttet til microscope skyve inne inkubator, men utenfor ampullen. Denne medgått tid hjelper tørke saken gjør det lettere å bryte. En annen viktig trinn i disseksjon for immunohistochemistry, er å skrelle av cuticle som dekker fløyen epitel, og dermed gi tilgang til antistoffer mot hele vingeflaten. Dette trinnet bør gjøres etter bestemmer for adskillige minuttene (minst 5 min etter at snittet på hengslene poenget) fordi bindemiddel stabiliserer vev og endrer cuticle konsistensen gjør det enklere å skrelle.
Når du utfører alle immunohistochemistry trinn, sørg for at vingene er i bevegelse (med rocking plattform). Bevegelsen bidrar til å forbedre utveksling og penetrasjon av løsningene vasker og incubations. Likevel er det viktig å utføre dem forsiktig unngå forekomsten av uønskede skjevheter i morfologi av denne skjøre struktur (dvs. det er tilstrekkelig at svingninger av plattformen litt flytte flytende medium som inneholder prøvene).
Denne prosedyren gir en alternativ og komplementær tilnærming til allerede publisert metoder for pupal fløyen disseksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke CSIC for økonomisk støtte gitt til dette prosjektet, til Mariana Di Doménico for hennes kundestøtte med AC confocal mikroskopi; til José Leonardo Báez for hans manus rettelser; til Luciano Correa for sin dedikasjon til etableringen av video; til Natalia Rosano for utlån stemmen for video og Bloomington Drosophila lager Center for å gi aksjer i denne studien. Apa1 monoklonale anti-Ptc utviklet av Isabel Guerrero ble innhentet fra den utviklingsmessige studier Hybridoma Bank (DSHB) under ledelse av NICHD og vedlikeholdes av The University of Iowa, departementet av biologisk vitenskap, Iowa City, IA 52242.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Serrano, N., O'Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
- Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
- Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
- Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
- Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).
