Un enfoque modular para la síntesis de N- glicanos para enganchar a un vidrio recubierto de óxido de aluminio slide (diapositiva ACG) como un microarray de glicanos se ha desarrollado y ha demostrado su uso para la elaboración de perfiles de un VIH ampliamente neutralizante del anticuerpo.
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Artículo de método
Chemo-enzimático síntesis de N- glicanos para el desarrollo de la matriz y el anticuerpo del VIH perfiles
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Resumen
Resumen
Presentamos una forma muy eficiente para la preparación rápida de una amplia gama de N-ligado oligosacáridos (estimados para exceder 20.000 estructuras) que se encuentran comúnmente en glicoproteínas humanas. Para lograr la deseada diversidad estructural, la estrategia comenzó con la síntesis enzimática de quimioterapia de tres tipos de módulos de fluoruro de oligosaccharyl, seguidos por su progresivo glycosylations selectivo de α en el 3-O y 6O posiciones de la residuos de manosa de la común trisacárido de base tener un vínculo crucial β-manosida. Más lejos atamos los N- glicanos en la superficie de un portaobjetos de vidrio recubiertos de óxido de aluminio (ACG) para crear un conjunto mixto covalente para el análisis de la interacción ligando-hetero con un anticuerpo de VIH. En particular, el comportamiento del enlace de un recién aislados VIH-1 ampliamente anticuerpo de neutralización (bNAb), PG9, a la mezcla de hombre espaciados5GlcNAc2 (Man5) y el complejo bi-antennary 2, 6-di-sialylated tipo N- glicanos (SCT ) en una matriz ACG, se abre una nueva vía para guiar el diseño del inmunógeno eficaz para el desarrollo de vacuna contra el VIH. Además, nuestra gama ACG incorpora una potente herramienta para estudiar otros anticuerpos anti-VIH para el comportamiento hetero-ligando.
Introducción
N- glicanos de las glicoproteínas son covalente a la asparragina (Asn) residuos de la sequon de Asn-Xxx-Ser/Thr de consenso, que afectan varios procesos biológicos tales como el reconocimiento de lectinas, conformación, antigenicidad y solubilidad de proteína 1 , 2. la síntesis química de N-oligosacáridos vinculados representa un desafío sintético importante debido a su enorme heterogeneidad micro estructural y arquitectura muy ramificado. Cuidadosa selección de la protección de grupos para ajustar la reactividad de bloques de construcción, consecución de selectividad en centros de anomérico ....
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Protocolo
1. preparación de D1/D2 brazo módulos22
- Preparación de intermedio 2
- Pesan a partir de material 1 (se muestra en la figura 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 mmol)) en un tubo de 15 mL y disolver en Tris almacenador intermediario (25 mM, pH 7,5) que contiene Dicloruro de manganeso (MnCl2, 10 m m) para lograr una concentración final de glicanos de 5 mM.
- Añadir 2 equivalentes de galactosa de difosfato de uridina (UDP-Gal).
- Añadir 150 unidade....
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Resultados
Una estrategia modular de chemo-enzimática para la síntesis de una amplia gama de los N -glicanos se presenta en la figura 1. La estrategia está basado en el hecho de que la diversidad puede crearse en principio por la quimio-enzimático síntesis de los tres módulos importantes, seguido por el mannosylation de α-específicas en el 3-O o 6O posición de los residuos de manosa de la común trisacárido de N- glicanos de la base. T.......
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Discusión
Una clase de bNAb de VIH-1 incluyendo PG9, PG16 y PGTs 128, 141-145 reportaron ser muy potente en la neutralización de 70-80% de los aislados de VIH-1 que circulan. Los epitopos de los bNAb están muy conservados entre las variantes de todo el grupo de VIH-1 M, por lo tanto puede orientar el diseño del inmunógeno eficaz para una vacuna contra el VIH generar anticuerpos neutralizantes23,24,25 . Como parte de nuestros continuos esf.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la división de tecnología de película delgada, centro de investigación de tecnología de instrumento (ITRC) y nacional laboratorios de investigación aplicada, parque científico de Hsinchu, Taiwán. Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de ciencia (no de la concesión. La mayoría 105-0210-01-13-01) y Academia Sinica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido acético | Sigma Aldrich | 64197 | |
| Acetonitrilo | Sigma Aldrich | 75058 | |
| Anhídrido acético | Sigma Aldrich | 108247 | |
| Sulfato de magnesio anhidro | Sigma Aldrich | 7487889 | |
| Teerato de etilo de trifluoruro de boro | Sigma Aldrich 109637 | ||
| Albúmina sérica bovina | Sigma Aldrich | 9048468 | |
| Bio-Gel P2 poliacrilamida | Bio-Rad | 1504118 | |
| Dicloruro de bis(ciclopentadienil)hafnio (IV) | Sigma Aldrich | 12116664 | |
| β-1, 4 galactosiltransferasas de leche bovina | Sigma Aldrich | 48279 | |
| BioDot Tecnología de cartesion con pin robótico SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) | Arrayit | ||
| Cerio amonio Molibdato | TCI | C1794 | |
| Cerio nitrato de amonio Cerio | Sigma Aldrich | 16774213 | |
| Portaobjetos de vidrio limpio | Schott | ||
| Citidina-5′-monofosfo-N-acetilneuramínico | ácido Sigma Aldrich | 3063716 | |
| Cloroformo deuterado | Sigma Aldrich | 865496 | |
| burro Anti-humano IgG (Alexa Fluor647 conjugado | Jackson Immuno Research, EE. UU. | 709605098 | |
| Diclorometano | Sigma Aldrich | 75092 | |
| Trifluoruro de dietilaminoazufre | Sigma Aldrich | 38078090 | |
| Dimetilformamida | Sigma Aldrich | 68122 | |
| Acetato de etilo | Sigma Aldrich | 141786 | |
| Etilenglicol | Acros Organic 107211 | ||
| FAST Cámaras de incubación de portaobjetos con marco Sigma | Aldrich | ||
| Guanosina 5'- sal disódica difosfo-b-L-fucosa | Sigma Aldrich | 15839700 | |
| Lab tracer 2.0 software | Sección 4 del Protocolo | ||
| Lector GenePix Pro 4300A (análisis de imágenes de microarrays) | dispositivos moleculares | www.moleculardevices.com | |
| GraphPad Prism Software (procesamiento de imágenes) | GraphPad Software, Inc | http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ | |
| Hidróxido de litio | Sigma Aldrich | 1310652 | |
| Cloruro de manganeso | Sigma Aldrich | 7773015 | |
| Metanol | Sigma Aldrich | 67561 | |
| N-butanol | Sigma Aldrich | 71363 | |
| Ácido oxálico | Acros Orgánico | 144627 | |
| Hidróxido de paladio Sigma | Aldrich | 12135227 | |
| Fosfato Solución salina tamponada | Thermo Fisher Scientific | ||
| Piridina | Sigma Aldrich | 110861 | |
| Ácido sulfónico P-Tolueno monohidrato | Sigma Aldrich | 773476 | |
| Triflato de plata | Sigma Aldrich | ||
| Bicarbonato de sodio | Sigma Aldrich 144558 | ||
| Cloruro de sodio | Sigma Aldrich 7647145 | ||
| Sodio carbonato de hidrógeno | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Metóxido de sodio | Sigma Aldrich | 124414 | |
| Sulfato de sodio | Sigma Aldrich | 7757826 | |
| Tolueno | Sigma Aldrich | 108883 | |
| Tampón Tris | Amresco | N/A | Grado ultrapuro |
| Tween-20 | Amresco | 9005645 | |
| Uridina difosfato galactosa (UDP-galactosa) | Sigma Aldrich | 137868521 |
Referencias
- Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317(2009).
- Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L.
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Reimpresiones y permisos
