Artículo de método

Chemo-enzimático síntesis de N- glicanos para el desarrollo de la matriz y el anticuerpo del VIH perfiles

DOI:

10.3791/55855

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5 de febrero de 2018

 ,  ,  , 
1Genomics Research Center, Academia Sinica

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un enfoque modular para la síntesis de N- glicanos para enganchar a un vidrio recubierto de óxido de aluminio slide (diapositiva ACG) como un microarray de glicanos se ha desarrollado y ha demostrado su uso para la elaboración de perfiles de un VIH ampliamente neutralizante del anticuerpo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos una forma muy eficiente para la preparación rápida de una amplia gama de N-ligado oligosacáridos (estimados para exceder 20.000 estructuras) que se encuentran comúnmente en glicoproteínas humanas. Para lograr la deseada diversidad estructural, la estrategia comenzó con la síntesis enzimática de quimioterapia de tres tipos de módulos de fluoruro de oligosaccharyl, seguidos por su progresivo glycosylations selectivo de α en el 3-O y 6O posiciones de la residuos de manosa de la común trisacárido de base tener un vínculo crucial β-manosida. Más lejos atamos los N- glicanos en la superficie de un portaobjetos de vidrio recubiertos de óxido de aluminio (ACG) para crear un conjunto mixto covalente para el análisis de la interacción ligando-hetero con un anticuerpo de VIH. En particular, el comportamiento del enlace de un recién aislados VIH-1 ampliamente anticuerpo de neutralización (bNAb), PG9, a la mezcla de hombre espaciados5GlcNAc2 (Man5) y el complejo bi-antennary 2, 6-di-sialylated tipo N- glicanos (SCT ) en una matriz ACG, se abre una nueva vía para guiar el diseño del inmunógeno eficaz para el desarrollo de vacuna contra el VIH. Además, nuestra gama ACG incorpora una potente herramienta para estudiar otros anticuerpos anti-VIH para el comportamiento hetero-ligando.

Introducción

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N- glicanos de las glicoproteínas son covalente a la asparragina (Asn) residuos de la sequon de Asn-Xxx-Ser/Thr de consenso, que afectan varios procesos biológicos tales como el reconocimiento de lectinas, conformación, antigenicidad y solubilidad de proteína 1 , 2. la síntesis química de N-oligosacáridos vinculados representa un desafío sintético importante debido a su enorme heterogeneidad micro estructural y arquitectura muy ramificado. Cuidadosa selección de la protección de grupos para ajustar la reactividad de bloques de construcción, consecución de selectividad en centros de anomérico y uso adecuado de promotor / activator(s) son elementos clave en la síntesis de los oligosacáridos complejos. Para resolver este problema de la complejidad, una gran cantidad de trabajo para avanzar en síntesis de N- glicanos informó recientemente de3,4. A pesar de estos enfoques robustos, encontrar un método eficaz para la preparación de una amplia gama de los N- glicanos (~ 20.000) sigue siendo un gran desafío.

La tasa de mutación rápida del VIH-1 para alcanzar la amplia diversidad genética y su capacidad de neutralizar la respuesta de anticuerpos, es uno de los mayores desafíos para el desarrollo de una vacuna segura y profiláctica contra el VIH-15,6 , 7. una táctica eficaz que VIH utiliza para evitar la respuesta inmune del huésped es la glicosilación poste-de translación de la glicoproteína gp120 con diversos N-ligado glycans derivados desde el host glicosilación maquinaria8, 9. Un reciente informe sobre el análisis preciso de recombinante monomérica HIV-1 gp120 glicosilación de células 293T de riñón embrionario humano (HEK) sugiere la ocurrencia de microheterogeneity estructural con un patrón característico de la célula-específica10 , 11 , 12. por lo tanto, comprensión requiere de las particularidades de glicanos de bNAb de HIV-1 gp120 bien caracterizado relacionadas con N- glycan estructuras en una cantidad suficiente para el análisis.

El descubrimiento de la tecnología de microarrays de glicanos proporciona alto rendimiento-exploración de las especificidades de una amplia gama de proteínas de unión a carbohidratos, bacteriana virus adhesinas, toxinas, anticuerpos y lectines13,14 . El arreglo de glycans sistemática en un formato basado en chip vestido podría determinar interacciones proteína-glicanos de problemática baja afinidad presentación multivalente15,16,17,18. Este arreglo basado en el chip de glicanos convenientemente parece imitar eficazmente interfaces de la célula. Para enriquecer la tecnología y superar la cuestión irregular asociada con formatos de matriz convencional, nuestro grupo recientemente desarrollado una variedad de glicanos en un portaobjetos de vidrio recubiertos de óxido de aluminio (ACG) con glycans terminó de ácido fosfónico para mejorar la intensidad de la señal, homogeneidad y sensibilidad19,20.

Para mejorar la comprensión actual acerca de glicanos epitopos del recién aislados VIH-1 anticuerpos (bNAb) ampliamente neutralizantes, hemos desarrollado una estrategia modular altamente eficiente para la preparación de un amplio arsenal de N-ligado glycans21 ,22 al imprimir en una ACG slide (ver figura 1). Especificidad estudios perfiles de bNAb de VIH-1 en una matriz ACG ofrecen la detección inusual de comportamiento hetero-glicanos del enlace de bNAb altamente potente PG9 que fue aislado del VIH infectados individuos23,24,25.

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Protocolo

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1. preparación de D1/D2 brazo módulos22

  1. Preparación de intermedio 2
    1. Pesan a partir de material 1 (se muestra en la figura 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 mmol)) en un tubo de 15 mL y disolver en Tris almacenador intermediario (25 mM, pH 7,5) que contiene Dicloruro de manganeso (MnCl2, 10 m m) para lograr una concentración final de glicanos de 5 mM.
    2. Añadir 2 equivalentes de galactosa de difosfato de uridina (UDP-Gal).
    3. Añadir 150 unidades de la enzima β-1, 4 galactosil transferasas de leche bovina e incubar la mezcla a 37 oC por h 15.
    4. Después de 15 h, realizar la cromatografía en capa fina (TLC) para indicar el consumo total de material de partida por observar la mezcla de reacción sobre una placa de TLC, desarrollando con n-butanol/ácido acético/agua (H2O) en un 1:1:1 relación y coloración por un solución de molibdato de amonio cerio de 0.25 M seguido de calefacción. Luego apagar la reacción por calentamiento en 90 oC durante 5 minutos.
    5. Centrifugar la mezcla de reacción a una velocidad de 2.737 x g durante 3 min y el sobrenadante en la parte superior de la columna de gel de poliacrilamida de la carga (véase Tabla de materiales). Eluir la columna con agua destilada desionizado y recoger el producto con fracciones de 1-2 mL.
    6. Supervisar las fracciones recogidas por TLC26, desarrollando con n-butanol: H2O: ácido acético en 1:1:1 relación y la coloración mediante una solución de molibdato de amonio cerio seguido de calefacción. Liofilizar27 el producto que contiene fracciones para obtener 2 intermedio (115 mg, 86%) como polvo blanco. Caracterizar el producto por NMR28 y29 de la espectrometría de masas (véase el archivo de datos complementarios).
  2. Preparación de intermedio 3
    1. Pesan a partir de material 2 (se muestra en la figura 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 mg, 0,122 mmol)) en un tubo de 15 mL y disolver en Tris tampón (25 mM, pH 7,5) que contienen MnCl2 (10 mM) para preparar una concentración final de glicanos de 5 mM.
    2. Añadir 2 equivalentes de sal de guanosina disódica 5'-diphospho-β-L-fucosa (PIB-Fuc).
    3. Añadir 150 unidades de la enzima α-1, 3 fucosyl transferasa de píloros de Helicobacter (Hp1-3FTΔ26695) e incubar la mezcla a 37 oC por h 15.
    4. Siga el paso 1.1.4.
    5. Siga el paso 1.1.5.
    6. Siga el paso 1.1.6 para obtener intermedio 3 (82 mg, 84%) como polvo blanco. Caracterizar el producto por RMN y espectroscopia de masas (ver complementarios datos archivo).
  3. Preparación de módulos 4 y 5
    1. Pesar el compuesto 2,-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside p(0,230 g, 0,360 mmol) o compuesto 3, p- methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,100 g, 0.125 mmol) en un matraz de fondo redondo de 25 mL solo cuello y secado bajo vacío durante 30 minutos.
    2. Quitar el matraz de vacío, relleno con gas nitrógeno, agregar una barra de agitación magnética, tapa con una membrana de goma y coloque un globo de nitrógeno.
    3. Inyecte 7 mL de piridina seca y 3 mL de anhídrido acético (Ac2O) en el matraz a un baño de hielo a 0 oC. Revuelva la reacción resultante de 12 h a temperatura ambiente utilizando un agitador magnético a 600-700 rpm. Se evaporan los disolventes con un rotativo evaporador a una presión de vacío de 0 - 10 mbar a 50 oC.
    4. Diluir la mezcla cruda utilizando 30 mL de diclorometano (DCM) y extraer con Hidrogenocarbonato de sodio acuoso saturado (NaHCO3) (2 x 20 mL) en un matraz de 50 mL.
    5. Vuelva a extraer la capa acuosa con DCM (3 x 15 mL) y secar las capas orgánicas combinadas sobre sulfato de sodio. Quitar el sulfato de sodio por filtración y lavado con DCM (5 mL). Evaporar el disolvente utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 400 mbar a 40 oC.
    6. Cargar la solución de la mezcla cruda en 2 mL de DCM en la cima de la cama de sílice.
    7. Eluir la columna con una mezcla que contiene tolueno y la acetona de 0 - 20% acetona en tolueno y recoger fracciones de 5-10 mL.
    8. Supervisar las fracciones recogidas por TLC (pasos 1.1.4 y 1.1.6), desarrollando con acetona/tolueno (7/3), y tinción con una solución de molibdato de amonio cerio seguido por calefacción en un plato caliente.
    9. Evaporar el producto que contiene fracciones utilizando un rotavapor para obtener productos como espuma blanca en 72% y 85% de rendimiento, respectivamente.
    10. Los productos se disuelven en 7 mL de acetonitrilo: tolueno: H2O en 4: proporción de 2:1 en un matraz de fondo redondo de 25 mL.
    11. Agregar nitrato de amonio cerio (2 equivalentes) mientras se enfría a 0 oC utilizando un baño de hielo. Revuelva la reacción a temperatura ambiente durante 3 h a ~ 500-800 rpm.
    12. Después de TLC indica el consumo total de material de partida (TLC con acetona/tolueno (7/3) y visualizar por absorbancia UV a 254 nm o por tinción con una solución de molibdato de amonio cerio seguido de calefacción), diluir la mezcla de reacción con acetato de etilo (30 mL) y extracto de H2O (15 x 2 mL).
    13. Extrae las capas orgánicas combinadas con 5 mL de solución saturada cloruro de sodio (NaCl).
    14. Evaporar el disolvente utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 240 mbar a 40 oC.
    15. Cargar la solución de producto crudo en 2 mL de DCM en la cima de la cama de sílice. Eluir la columna con una mezcla que contiene tolueno y la acetona (0 - 20% acetona en tolueno) y recoger fracciones de 5-10 mL. Supervisar las fracciones recogidas por el TLC, desarrollando con acetona/tolueno (7/3).
    16. Evaporar las fracciones que contienen el producto usando un evaporador rotatorio a 77 mbar vacío y 40 oC para obtener productos como espumas blancas.
    17. Los respectivos alcoholes se disuelven en 10 mL de DCM en un matraz de fondo redondo cuello solo 25 mL y enfriar a-30 oC.
    18. Añadir trifluoruro de diethylaminosulfur (DAST, 2 equivalentes). Revuelva la mezcla de reacción a-30 oC por 2 h.
    19. Después de TLC indica consumo de material de partida (TLC con acetona/tolueno (4/1) y visualizar por absorbancia UV a 254 nm o por tinción con una solución de molibdato de amonio cerio seguido de calefacción), diluir la mezcla de reacción con DCM (30 mL) , y lavado con saturado NaHCO3 (15 x 2 mL).
    20. Extraer la capa orgánica combinada con 5 mL de solución saturada de NaCl, secarlo agregando sulfato de magnesio anhidro, filtrar la mezcla después de un lavado con DCM (5 mL) y recoger en un matraz de fondo redondo de 100 mL cuello solo.
    21. Evaporar el disolvente utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 400 mbar a 40 oC.
    22. Cargar la solución de producto crudo en 2 mL de DCM en la cima de la cama de sílice. Eluir la columna con una mezcla de tolueno y acetona (0-20% acetona en tolueno) y recogemos fracciones de 5-10 mL.
    23. Supervisar las fracciones recogidas por el TLC, desarrollando con acetona/tolueno (7/3).
    24. Evaporar el producto que contiene fracciones utilizando un rotavapor para obtener productos deseados 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluoruro (54% en 2 pasos) y 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluoruro (67% en 2 pasos) como sólidos blancos.
    25. Caracterizar el producto por RMN y espectroscopia de masas (ver complementarios datos archivo).

2. preparación de glicanos 10

  1. Preparación de intermedio 7
    1. Peso plata triflate dicloruro de bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) (AgOTf) (0,039 g, 0.155 mmol) (Cp2HfCl2) (0,041 g, 0.108 mmol) en un matraz de fondo redondo de 25 mL cuello solo, secado a vacío de línea de schlenk para 30 minutos, quitarlo de la vacío y llenarlo con gas nitrógeno.
    2. Transferir los recién secado 4 Å tamices moleculares (0,2 g) en el matraz que contiene el AgOTf y Cp2HfCl2, agregar una barra de agitación magnética, inmediatamente la tapa con el tabique y añadir un globo de nitrógeno.
    3. Transferencia de tolueno seco 3 mL en el matraz con una jeringuilla de cristal seco. Revuelva la mezcla de reacción durante 1 hora a temperatura ambiente y luego enfriar a 0 oC.
    4. Inyectar una solución de donantes 4 (figura 2, 0,043 g, 0.046 mmol) y aceptador 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (figura 3, 0,045 g, 0.031 mmol) en tolueno 3 mL en el matraz a través del tabique utilizando una jeringa de 10 mL 0 o C. Revuelva la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 3 horas.
    5. Después de TLC indica consumo de materias primas (TLC, desarrollando con DCM/acetona (8.5/1.5) y visualizar por absorbancia UV a 254 nm o por tinción con una solución de molibdato de amonio cerio seguido de calefacción), calmar la reacción por inyección de 10 equivalentes de trietilo amina.
    6. Los tamices moleculares a través de un lecho de celite del filtro en un matraz de fondo redondo de 50 mL y lavar con 10 mL de acetato de etilo más. Extrae las capas orgánicas combinadas con una solución saturada acuosa de NaHCO3 (2 x 20 mL) en un matraz de 50 mL. Extraer la capa acuosa con acetato de etilo (3 x 15 mL).
    7. Las capas orgánicas combinadas con solución saturada de NaCl (5 mL) del extracto seco mediante el uso de sulfato de magnesio anhidro, filtrar la mezcla para eliminar el sulfato de magnesio, lavar con acetato de etilo (3 x 15 mL) y recoger el filtrado en un matraz de fondo redondo de 100 mL.
    8. Evaporar el disolvente utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 240 mbar a 40 oC.
    9. Cargar la solución de producto crudo en DCM en la cima de la columna de la cama de sílice. Eluir la columna con una mezcla que contiene DCM y acetona (0-10% acetona en DCM) y recoger fracciones de 5-10 mL.
    10. Seguimiento de las fracciones recogidas por el TLC, desarrollando con DCM/acetona (8.5/1.5). Evaporar las fracciones que contiene el producto utilizando un rotavapor para obtener [5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 7, intermedio 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranoside (0,052 g, 70%), como espuma blanca.
    11. Caracterizar el producto por RMN y espectroscopia de masas (ver complementarios datos archivo).
  2. Preparación de intermedio 8
    1. Pesar hexasaccharide 7 (figura 3, 0,040 g, 0.016 mmol) en un matraz de fondo redondo de 25 mL cuello solo secado bajo vacío para 1 h, quitar de vacío, relleno con gas nitrógeno, agregar una barra de agitación magnética y tapa con una membrana de goma.
    2. Transferencia de 3 mL de acetonitrile:methanol (MeOH) (proporción 2:1) en el matraz.
    3. Añadir p-monohidrato de ácido sulfónico de tolueno (0,001 g, 0.008 mmol) en el matraz de reacción y revuelva la reacción a 800 rpm durante 5 h.
    4. Después de TLC indica consumo de material de partida (TLC, desarrollando con DCM/acetona (8.5/1.5) y visualizar por absorbancia UV a 254 nm o por tinción con una solución de molibdato de amonio cerio seguido de calefacción), calmar la reacción por inyección de 10 equivalentes de trietilo amina.
    5. Evaporar el disolvente utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 337 mbar a 40 oC.
    6. Disolver la mezcla cruda de aproximadamente 2 mL de DCM y carga encima de la cama de sílice.
    7. Eluir la columna con una mezcla de DCM y acetona (0 - 10% de acetona en DCM) y recogemos fracciones de 5-10 mL. Seguimiento de las fracciones recogidas por el TLC, desarrollando con DCM/acetona (8.5/1.5). Evaporar el solvente usando un evaporador rotatorio a 400 mbar vacío y 40 oC.
    8. Secar el residuo a presión reducida para dar intermedio 8, 5-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-acetil-4, 6-O-benzylidine-β - D - mannopyranosyl-(1→4) - O-(3, 6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (Figura 3, 0,022 g, 57%) como un sólido blanco. Caracterizar el producto por RMN y espectroscopia de masas (ver complementarios datos archivo).
  3. Preparación de intermedio 9
    1. Preparación de intermedio 9 (figura 3) se logró utilizando donantes 5 (0,015 g, 13.2 μmol) y aceptador 8 (figura 3, 0,020 g, 8.80 μmol).
    2. AgOTf (0,011 g, 44,1 μmol) y Cp2HfCl2 (0,012 g, 30,8 μmol) fueron utilizados como un promotor.
    3. Realice los pasos 2.1.1 al 2.1.10 para intermedios 9, 5-Azidopentyl - O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as espuma blanca.
  4. Global desprotección de intermedio
    1. Pesar compuesto 9 (0,010 g, 2,9 μmol) en un matraz de fondo redondo de 25 mL cuello solo, agregar una barra de agitación magnética, tapa con una membrana de goma y conecte un globo de nitrógeno.
    2. Transferir 2 mL de 1, 4 dioxano: H2O (4:1) en el matraz. Añadir hidróxido de litio (LiOH) (0,005 g, 50% por peso) en el matraz. Revuelva la mezcla de reacción a 90-100 oC por 12 h y deje que se enfríe a TA.
    3. Se evaporan los disolventes utilizando un evaporador rotatorio seco el matraz vacío de 1 h, llenar con nitrógeno, retírelo de la Unidad succionadora y tapa con una membrana de goma.
    4. Inyectar 4 mL de piridina seca y 2 mL de anhídrido acético en el matraz a través del tabique mediante una jeringa de 10 mL a 0 oC. Revuelva la mezcla de reacción de 12 h a TA.
    5. Se evaporan los disolventes utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 0-10 mbar a 50 oC.
    6. Disolver la mezcla cruda utilizando 30 mL de DCM y extraer la solución saturada acuosa NaHCO3 (2 x 20 mL) en un matraz de 50 mL.
    7. Vuelva a extraer la capa acuosa con DCM (3 x 15 mL). Evaporar el disolvente utilizando un evaporador rotatorio.
    8. Cargar una solución de producto en 2 mL aproximadamente de DCM en la cima de la cama de sílica C18. Eluir la columna con una mezcla de agua y metanol (0 - 100% de metanol en agua) y recoger fracciones de 5-10 mL.
    9. Recoger las fracciones de producto y se evaporan a presión reducida para obtener el producto deseado como espuma blanca.
    10. Disolver el producto en 5 mL de metanol seco de 25 mL redondo matraz de fondo y la tapa con una membrana de goma.
    11. Transferir 0,1 mL de Metóxido sódico (NaOMe) en metanol y fresco a 0 oC utilizando un baño de hielo y revolver la mezcla durante 12 horas.
    12. Quite el solvente usando un evaporador rotatorio y secar el producto en alto vacío.
    13. Disolver los productos crudos en 5 mL de metanol: H2O: ácido acético (6:3:1).
    14. Añadir hidróxido de paladio (Pd(OH)2) (50% por peso) y la reacción en atmósfera de hidrógeno usando un globo de hidrógeno de 15 h.
    15. La reacción a través de un lecho de celite del filtro y lavar con 2 mL de metanol, seguido de 2 mL de agua dd.
    16. Se evaporan los disolventes utilizando un evaporador rotatorio.
    17. Disolver la mezcla de crudo con aproximadamente 1 mL de agua y colóquela encima de la cama de gel de poliacrilamida (véase Tabla de materiales). Eluir el producto con agua y recoger fracciones de 1-2 mL.
    18. Supervisar las fracciones recogidas por el TLC, desarrollar con n-butanol: H2O: ácido acético (1:1:1).
    19. Recoger las fracciones de producto y liofilizar para obtener el producto deseado (5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-) 10, α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a polvo blanco.
    20. Caracterizar el producto por RMN y espectroscopia de masas (ver complementarios datos archivo).

3. preparación de glicanos con cola ácido fosfónico19,22

  1. Pesar los glicanos respectivos (2-5 μmol) en un matraz de fondo redondo 5 mL, agregar una barra de agitación magnética y tapa con una membrana de goma.
  2. Transfiera 400 μL de dimetilformamida recién secado.
  3. Añadir [2 (2 (2 (bis (benzyloxy) fosforilo) ethoxyethoxy) carbonato de etilo (2, 5-dioxopyrrolidin1-yl)] (10-25 μmol, preparado en casa) a la solución de glicanos. Revolver la mezcla a 800 rpm durante 5 h.
  4. Se evaporan los disolventes utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 5-10 mbar a 40 oC.
  5. Disolver la mezcla de reacción en 0,5 mL de agua y de la carga en la parte superior de la cama de gel de poliacrilamida (véase Tabla de materiales). Eluir el producto con agua y recoger fracciones de 1-2 mL.
  6. Supervisar las fracciones recogidas por TLC26. Spot de la mezcla de reacción sobre una placa de TLC y agregar colorante solución de molibdato de amonio cerio de 0.25 M; siga calentando con una placa caliente. Recoger el producto que contiene fracciones y liofilizar para obtener el producto deseado como un polvo blanco.
  7. Disolver el producto en 2 mL de agua y añadir Pd (OH)2 (50% en peso). Revuelva la reacción a 800 rpm en atmósfera de hidrógeno usando un globo de hidrógeno de 15 h.
  8. La reacción a través de un lecho calcinado flujo del filtro y lavar con 2 mL de metanol, seguido de 2 mL de agua destilada desionizado. Se evaporan los disolventes utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 300 mbar a 40 oC.
  9. Disolver la mezcla de crudo con aproximadamente 1 mL de agua y colóquela encima de la cama de gel de poliacrilamida (véase Tabla de materiales).
  10. Eluir el producto con agua y recoger fracciones de 1-2 mL. Supervisar las fracciones recogidas por TLC26. Liofilizar las fracciones (congelar el producto con nitrógeno líquido, luego coloque en liofilizador bajo un vacío) para obtener el producto deseado como un polvo blanco. Caracterizar los productos por RMN y espectroscopia de masas (ver complementarios archivo de datos) utilizando D2O como solvente.

4. glicanos matriz

  1. Preparación de aluminio revestido vidrio diapositivas (slide ACG) 19 , 20 , 22
    Nota: Fabricación de los portaobjetos de vidrio recubierto de aluminio se realizó en la división de tecnología de película delgada, centro de investigación de tecnología de instrumento y nacional laboratorios de investigación aplicada, parque científico de Hsinchu, Taiwán.
    1. Paquete portaobjetos recubiertos, sello de vacío para evitar la formación de la NAO y mantenga sellado hasta que la reacción electroquímica de anodizado superficial.
  2. Superficie anodización de aluminio revestido de laminas de vidrio 19 , 20 , 22
    1. Establecer la incubadora con control de temperatura a 4 ° C. Preparar solución acuosa de ácido oxálico de 0,3 M y mantener en un baño de hielo. Tome el vaso de precipitados de 500 mL, añada una barra agitadora por imán.
    2. Transferir el ácido oxálico de 0,3 M, vaso de precipitados de 500 mL y luego coloque una varilla de 10 cm de largo platino como un cátodo en la solución. Mantener revolviendo (a 300 rpm) el ácido oxálico en todo el proceso de anodización.
    3. Activar software tracer de lab, haga clic en el botón "configuración" luego "función voltaje de barrido de elección". Establecer el inicio y parada voltaje a 25,8 V, número de puntos a 100, cumplimiento a 1 y barrido retraso de ms de 1.200 y haga clic en "Aceptar".
    4. Abrazadera de la parte de vidrio recubierto de aluminio hacia el cátodo. Haga clic en el botón "test run". Observar la medición actual (~ 8-10 mA).
    5. Después de la anodización superficial, lavar el portaobjetos con agua destilada doble purga con nitrógeno seco y luego almacenar en una cámara de humedad relativa de 30% hasta su uso posterior.
  3. Fabricación de ACG glycan microarray 22
    1. Preparar 100 μl de los glicanos monovalentes (I-XI) etilen glicol en concentración 10 mM individualmente.
    2. Diluir los glicanos arriba con tampón de impresión (80% glicol de etileno y el 20% de agua desionizado) para hacer 100 concentración μm.
    3. Para estudio de hetero-ligando, prepare 5 μl de cada XI glycans y a cada uno añadir 5 μl del hombre5GlcNAc2 (proporción 1:1).
    4. Microarrays impresos de robótica del perno (véase Tabla de materiales) por la deposición de 0,6 nL de los glicanos previamente preparados en ACG diapositivas31.
    5. Almacenar las diapositivas impresas en una caja seca de humedad controladas antes de la prueba enlace.
  4. Mapeo de epítopos de glicanos de HIV-1 anticuerpos ampliamente neutralizantes PG9 22
    1. Preparar 1 mL de BSA contenida tampón de SAFT, 3% peso/volumen.
    2. Preparar 70 μl de PG9 (50 μg/mL) en tampón de SAFT (BSA contenía tampón de SAFT, 3% w/v).
    3. Preparar 120 μl del anticuerpo secundario etiqueta fluorescente burro anti humano IgG (Alexa Fluor 647 conjugado) 50 μg/mL en tampón de SAFT (BSA contenía tampón de SAFT, 3% w/v) en la oscuridad.
    4. Mezcla principal (PG9) y el anticuerpo secundario etiqueta fluorescente en proporción 1:1 (60 μL cada una). Incubar premezclados anticuerpos durante 30 min a 4 ° C.
    5. Cargar la diapositiva ACG en la cámara de incubación de la diapositiva que se divide en 16 pozos. Transferir 100 μl de anticuerpos premezclados a la matriz de glicanos e incubar a 4 ° C por 16 h.
    6. Pipeta de un premezclado anticuerpos. Extraiga la cámara de incubación de la diapositiva.
    7. Lavar el portaobjetos primero en tampón de SAFT (PBS y 0.05% Tween-20), seguido por agua desionizada y vuelta seco a 2.000 x g.
    8. Abra el software de análisis de imagen de microarrays (véase Tabla de materiales). Insertar una diapositiva con las características vestidas hacia abajo.
    9. Haga clic en el menú "configuración", ajuste la resolución de imagen 5 μm por píxel y la longitud de onda de 635 nm PMT450 y energía al 100%.
    10. Haga clic en el botón "scan" para empezar la diapositiva de imagen.
    11. Haga clic en el icono de "archivo" para guardar la imagen de escaneo en formato tif.
    12. Realizar análisis de imagen siguiendo de guía del usuario del software32.
    13. Calcular la intensidad total de fluorescencia e ilustrar usando software33 de procesamiento de imágenes (véase Tabla de materiales).
      Nota: Aquí, el porcentaje promedio de errores para todos los puntos de datos se presenta por las barras de error.

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Resultados

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Una estrategia modular de chemo-enzimática para la síntesis de una amplia gama de los N -glicanos se presenta en la figura 1. La estrategia está basado en el hecho de que la diversidad puede crearse en principio por la quimio-enzimático síntesis de los tres módulos importantes, seguido por el mannosylation de α-específicas en el 3-O o 6O posición de los residuos de manosa de la común trisacárido de N- glicanos de la base. T...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una clase de bNAb de VIH-1 incluyendo PG9, PG16 y PGTs 128, 141-145 reportaron ser muy potente en la neutralización de 70-80% de los aislados de VIH-1 que circulan. Los epitopos de los bNAb están muy conservados entre las variantes de todo el grupo de VIH-1 M, por lo tanto puede orientar el diseño del inmunógeno eficaz para una vacuna contra el VIH generar anticuerpos neutralizantes23,24,25 . Como parte de nuestros continuos esf...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen a la división de tecnología de película delgada, centro de investigación de tecnología de instrumento (ITRC) y nacional laboratorios de investigación aplicada, parque científico de Hsinchu, Taiwán. Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de ciencia (no de la concesión. La mayoría 105-0210-01-13-01) y Academia Sinica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido acéticoSigma Aldrich64197
AcetonitriloSigma Aldrich75058
Anhídrido acéticoSigma Aldrich108247
Sulfato de magnesio anhidroSigma Aldrich7487889
Teerato de etilo de trifluoruro de boroSigma Aldrich 109637
Albúmina sérica bovinaSigma Aldrich9048468
Bio-Gel P2 poliacrilamidaBio-Rad1504118
Dicloruro de bis(ciclopentadienil)hafnio (IV)Sigma Aldrich12116664
β-1, 4 galactosiltransferasas de leche bovinaSigma Aldrich48279
BioDot Tecnología de cartesion con pin robótico SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins)Arrayit
Cerio amonio MolibdatoTCIC1794
Cerio nitrato de amonio CerioSigma Aldrich16774213
Portaobjetos de vidrio limpio Schott 
Citidina-5′-monofosfo-N-acetilneuramínicoácido Sigma Aldrich3063716
Cloroformo deuteradoSigma Aldrich865496
burro Anti-humano IgG (Alexa Fluor647 conjugadoJackson Immuno Research, EE. UU.709605098
DiclorometanoSigma Aldrich75092
Trifluoruro de dietilaminoazufreSigma Aldrich38078090
DimetilformamidaSigma Aldrich68122
Acetato de etiloSigma Aldrich141786
EtilenglicolAcros Organic 107211
FAST Cámaras de incubación de portaobjetos con marco SigmaAldrich
Guanosina 5'- sal disódica difosfo-b-L-fucosa Sigma Aldrich15839700
Lab tracer 2.0 software Sección 4 del Protocolo
Lector GenePix Pro 4300A (análisis de imágenes de microarrays)dispositivos moleculareswww.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (procesamiento de imágenes)GraphPad Software, Inchttp://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Hidróxido de litioSigma Aldrich1310652
Cloruro de manganesoSigma Aldrich7773015
MetanolSigma Aldrich67561
N-butanolSigma Aldrich71363
Ácido oxálicoAcros Orgánico144627
Hidróxido de paladio SigmaAldrich12135227
Fosfato Solución salina tamponadaThermo Fisher Scientific 
PiridinaSigma Aldrich110861
Ácido sulfónico P-Tolueno monohidratoSigma Aldrich773476
Triflato de plataSigma Aldrich
Bicarbonato de sodioSigma Aldrich 144558
Cloruro de sodioSigma Aldrich 7647145
Sodio carbonato de hidrógenoSigma Aldrich144558
Metóxido de sodio Sigma Aldrich124414
Sulfato de sodioSigma Aldrich7757826
Tolueno Sigma Aldrich108883
Tampón Tris AmrescoN/AGrado ultrapuro
Tween-20Amresco9005645
Uridina difosfato galactosa (UDP-galactosa)Sigma Aldrich137868521
10010023 2923286

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317(2009).
  2. Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
  3. Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
  4. Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
  5. Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
  6. Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
  7. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
  8. Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
  9. Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
  10. Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094(2016).
  11. Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
  12. Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
  13. Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
  14. Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
  15. Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581(2015).
  16. Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
  17. Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
  18. Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  19. Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
  20. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
  21. Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
  22. Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
  23. McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
  24. Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
  25. Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
  26. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  27. de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes? J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  29. JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).
  33. GraphPad Prism version 6.01 for Windows. GraphPad Software. , La Jolla California USA. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ (2017).

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