Medición de endocitosis vesícula sináptica en neuronas Hippocampal cultivadas

Resumen

Endocitosis de vesículas sinápticas se detectan por microscopia ligera de pHluorin fusionado con la proteína de la vesícula sináptica y por microscopia electrónica de la absorción de la vesícula.

Resumen

Durante la endocitosis, vesículas sinápticas fundidas se recuperan en los terminales del nervio, permitiendo para el reciclaje de la vesícula y así el mantenimiento de la transmisión sináptica durante la cocción del repetidor del nervio. Endocitosis deteriorada en condiciones patológicas conduce a disminuciones en las funciones de cerebro y fuerza sinápticas. Aquí, describimos los métodos utilizados para medir la endocitosis de vesículas sinápticas en la sinapsis hippocampal mamífera en cultivo neuronal. Supervisamos la endocitosis de la proteína de la vesícula sináptica mediante la fusión de una proteína de la membrana vesicular sináptica, incluyendo synaptophysin y VAMP2/synaptobrevin, en el lado lumenal de vesicular, con pHluorin, una proteína fluorescente verde sensibles al pH que aumenta su intensidad de fluorescencia como el pH aumenta. Durante la exocitosis, pH del lumen vesicular aumenta, mientras que durante lumen vesicular endocitosis es acidificado a pH. Así, un aumento de la intensidad de la fluorescencia pHluorin indica fusión, mientras que indica que una disminución de la endocitosis de la proteína de la vesícula sináptica con. Además de utilizar el método de proyección de imagen de pHluorin para grabar endocitosis, supervisamos endocitosis la membrana vesicular por microscopia electrónica (EM) medidas de la absorción de peroxidasa (HRP) de rábano por vesículas. Por último, controla la formación de hoyos de membrana terminal del nervio en las varias horas después de la despolarización inducida por potasio alto. El curso del tiempo de formación de HRP absorción y membrana pit indica el curso del tiempo de endocitosis.

Introducción

Neurotransmisores se almacenan en vesículas sinápticas y liberados por exocitosis. La membrana de la vesícula sináptica y proteína son internalizados por endocitosis y reutilizadas en la próxima ronda de exocitosis. Endocitosis de vesículas sinápticas es importante para el mantenimiento de piscinas de la vesícula sináptica y quitan vesículas que sobresale de la membrana plasmática. La pHluorin pH-sensible a la proteína verde fluorescente, que se apagó en condiciones ácidas y dequenched en un pH neutro, se ha utilizado para medir el tiempo de endocitosis cursos en viven las células^1,2,

Protocolo

Nota: el siguiente protocolo describe los métodos de proyección de imagen de pHluorin y métodos EM en neuronas hippocampal cultivadas. pHluorin monitores vesícula sináptica proteína asimilación en las células vivas y EM detecta la absorción de la vesícula sináptica y cambios ultraestructurales.

cuidado de los animales y procedimiento seguido las pautas de NIH y fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado de animales de NIH.

1. pHluorin imágenes

1. cultura Hippocampal neuron
   1. preparar Buffer de hipocampo (HB) mediante la combinación de 4 mM NaHCO ₃ y 5 mM HEPES y aj....

Resultados

Usando el método del portador lípido, SpH se expresó en neuronas hipocampales, lo que permite la identificación de los botones (Figura 1a). Estimulación eléctrica de las células inducido por exocitosis y un correspondiente aumento en la intensidad de la fluorescencia. El aumento de fluorescencia (ΔF) fue detenido por fin el estímulo (Figura 1b). El aumento de la fluorescencia fue seguida por un lento descenso, debido a la endocit.......

Discusión

Aquí muestran dos métodos para el monitoreo de endocitosis vesícula sináptica. En el primer método, supervisamos pHluorin fusionado con una proteína de la vesícula sináptica en neuronas transfected y posteriormente eléctricamente estimulados. En segundo lugar, utilizamos proyección de imagen de EM de la absorción HRP como inducidas por KCl. Utilizamos diversos estímulos por dos razones. En primer lugar, aplicación de alto potasio induce la despolarización de todas las neuronas en la cultura. Esto facilita el examen de la.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lipofectamina LTX con Plus	Thermo Fisher	15338-100	Transfección de ADN plasmídico incluyendo sinaptofisina o VAMP2-pHluorin
medio neurobasal	Thermo Fisher	21103-049	Medio de crecimiento para neuronas, Calentamiento hasta 37°C C antes de usar
B27	Thermo Fisher	17504-044	Gradiente para la diferenciación neuronal
Glutamax	Thermo Fisher	35050-061	Gradiente para cultivo neuronal
Cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina	Neuvitro	GG-25-pdl	Sustrato para el crecimiento neuronal y la obtención de imágenes de pHluorin
Trypsina XI de páncreas bovino	Sigma	T1005	Neuronal Tejidos del hipocampo de cultivo
desoxirribonucleasa I del páncreas bovino	Sigma	D5025	Inhibidores de cultivo neuronal estimulador de impulsos de suspensión de células viscosas
	A-M	modelo 2100	Aplicar estimulación eléctrica
Baño ranurado con estimulación de campo	Warner Instruments	RC-21BRFS
	de aislamiento de estímulo de estimulación eléctricaWarner Instruments	SIU102	Aplique
lubricante	Dow corning	111	pHluorin imageg-seal con cubreobjetos y cámara de imagen, evite fugas de la cámara
AP5	Tocris	3693	Gradiente para solución salina normal, antagonista selectivo del receptor NMDA, inhibe la actividad postsináptica que tiene potencial para actividad recurrente
CNQX	Tocris	190	Gradiente para solución salina normal, antagonista competitivo del receptor AMPA/kainato, inhibe la actividad postsináptica que tiene potencial de actividad recurrente
Iluminador	Nikon	C-HGFI	Fuente de luz de halogenuros metálicos para cámara pHluorin
EMCCD	Andor	iXon3	Imágenes de pHluorin, detectan la intensidad de fluorescencia de pHluorin
Microscopía invertida	Nikon	Ti-E	Adquisición de imágenes para células transfectadas con sinaptofisina o VAMP2 pHluorin
NIS-Elements AR	Nikon	NIS-Elements Advanced	Research Software para la adquisición y el análisis de imágenes
Igor pro	WaveMetrics	Igor pro	Software para el análisis de imágenes y la presentación de datos
cámara de imágenes	Warner Instruments	RC21B	pHluorin imaging, aplicar estimulación de campo en células vivas
poli-l-lisina	Sigma	P4832	Microscopía electrónica, sustrato para el crecimiento neuronal, aplicar en placa multipocillo durante 1 h a temperatura ambiente y luego lavar con agua esterilizada 3 veces
Peroxidasa de rábano picante (HRP)	Sigma	P6782	Microscopía electrónica, marcaje de vesículas sinápticas endocitadas mediante catalización de DAB en presencia de peróxido de hidrógeno, la concentración final es de 5 mg / mL en solución salina normal, refrescar antes de usar
Cacodilato	de NaCiencias de la microscopía electrónica	12300	Microscopía electrónica, tampón para fijadores y lavado, la concentración final es de 0,1 N
3,3′-Diaminobenzigdina(DAB)	Sigma	D8001	Microscopía electrónica, marcaje de vesículas sinápticas endocitosadas, sustrato para HRP, la concentración final es de 0,5 mg/mL en DDW y filtrado, refrescar antes de usar
Solución de peróxido de hidrógeno	Sigma	H1009	Microscopía electrónica, marcaje de vesículas sinápticas endocitadas mediante la inducción de la reacción HRP-DAB, la concentración final es del 0,3% en DDW, hacer fresco antes
de usar glutaraldehído	Ciencias de la Microscopía Electrónica 16365 Microscopía		electrónica, fijadores, la concentración final es del 4% en tampón de Na-cacodilato, hacer fresco antes de usar, agitar bien antes de usar
TEM	JEOL	200CX	Microscopía electrónica, obtención de imágenes de vesículas endocitosadas y cambios ultraestructurales
Cámara digital CCD	AMT	XR-100	Microscopía electrónica, captura de imágenes
Citrato de plomo	Microsistemas Leica	16707235	Microscopía electrónica, tinción de rejilla

Sistemas Aplicar unidad de estimulación eléctrica