Péptido y proteína cuantificación usando automatizado inmuno-MALDI (iMALDI)

Huiyan Li; Robert Popp; Bjorn Frohlich; Michael X. Chen; Christoph H. Borchers

doi:10.3791/55933

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Artículo de método

Péptido y proteína cuantificación usando automatizado inmuno-MALDI (iMALDI)

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DOI:

10.3791/55933

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18 de agosto de 2017

Huiyan Li¹ , Robert Popp¹ , Bjorn Frohlich¹ , Michael X. Chen² , Christoph H. Borchers¹^,³^,⁴^,⁵

¹University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre, ²Jewish General Hospital, McGill University, ³Dept of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria, ⁴Proteomics Centre, Segal Cancer Centre, Lady Davis Institute, Jewish General Hospital, McGill University, ⁵Gerald Bronfman Department of Oncology, Jewish General Hospital

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo para la cuantificación de proteínas en fluidos biológicos complejos utilizando tecnología automatizada inmuno-MALDI (iMALDI).

Resumen

Espectrometría de masas (MS) es una de las tecnologías más utilizadas para la cuantificación de proteínas en muestras complejas, con la especificidad del ensayo excelente como resultado de la detección directa de la relación masa / carga de cada molécula de la blanco. Sin embargo, proteómica basada en la MS, como la mayoría otras técnicas analíticas, tiene un sesgo hacia la medición de analitos de alta abundancia, por lo que es un reto a alcanzar límites de detección bajos ng/ml o pg/mL en muestras complejas y esto es el intervalo de concentraciones para muchos proteínas enfermedad relevante en biofluidos como plasma humano. Para ayudar en la detección de analitos de baja abundancia, inmuno-enriquecimiento ha sido integrado en el ensayo para concentrar y purificar la sustancia a analisar antes de medición MS, mejorando significativamente la sensibilidad del ensayo. En este trabajo, la tecnología de inmuno - mediante desorción/ionización del Laser (iMALDI) es presentada para la cuantificación de proteínas y péptidos en biofluidos, basada en inmuno-enriquecimiento en granos, seguida por MALDI-MS medida sin previa elución. Los anticuerpos anti péptidos son funcionalizados en bolas magnéticas y se incubaron con muestras. Después del lavado, los granos son transferidos directamente en un plato blanco MALDI y las señales son medidas por un MALDI-tiempo de instrumento de vuelo (MALDI-TOF) después de la solución de la matriz se ha aplicado a los granos. Se simplifica el procedimiento de preparación de la muestra en comparación con otros ensayos inmuno-MS, y la medición de MALDI es rápida. La preparación de toda la muestra se automatiza con un líquido, manejo del sistema, con mayor rendimiento y mejor reproducibilidad. En este artículo, el ensayo de iMALDI se utiliza para determinar la angiotensina péptido I (Ang I) concentración en el plasma, que se utiliza clínicamente como lectura de la actividad de renina plasmática para la detección del aldosteronism primario (PA).

Introducción

Espectrometría de masas se ha convertido en una herramienta indispensable en proteómica cuantitativa. Espectrometría de masas puede determinar las masas de blanco proteínas o péptidos, por lo tanto las señales del analito obtenido pueden ser altamente específicas en comparación con los inmunoensayos. Dos métodos de ionización por electrospray y MALDI, comúnmente se utilizan para la detección de proteínas y péptidos¹^,²^,³^,⁴. Un desafío importante en la cuantificación de la proteína basada en MS radica en la detección de proteínas de baja abund....