Presentamos un protocolo para la caracterización rápida de biomolecular plegado y encuadernación interacciones con ligandos termolábiles utilizando calorimetría diferencial.
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Artículo de método
Medición de perfiles Biomolecular DSC con ligandos termolábiles para caracterizar rápidamente doblar y atar las interacciones
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Resumen
Resumen
Calorimetría diferencial (barrido DSC) es una técnica poderosa para la cuantificación de parámetros termodinámicos que rigen biomolecular plegable y las interacciones de los Unión. Esta información es fundamental en el diseño de nuevos compuestos farmacéuticos. Sin embargo, muchos ligandos farmacéuticamente relevantes son químicamente inestables a las altas temperaturas utilizadas en análisis de DSC. Así, las interacciones de los Unión de medición es difícil porque las concentraciones de ligandos y convierte térmicamente los productos cambian constantemente dentro de la célula del calorímetro. Aquí, presentamos un protocolo usando ligandos termolábiles y DSC para obtener rápidamente información termodinámica y cinética de plegamiento, vinculante y ligando procesos de conversión. Hemos aplicado el método al aptámero de ADN MN4 que se une a la cocaína ligando termolábiles. Usando un nuevo análisis del ajuste global que tenga en cuenta para la conversión de ligando termolábiles, el conjunto completo de parámetros vinculantes y plegable se obtienen de un par de experimentos de DSC. Además, nos muestran que la constante de velocidad para la conversión de ligando termolábiles puede obtenerse con sólo un conjunto de datos complementario de DSC. Se presentan las directrices para la identificación y análisis de datos de varios escenarios más complicados, incluyendo la agregación irreversible de la biomolécula, plegamiento lento, enlace lento y rápido agotamiento del ligand termolábil.
Introducción
Calorimetría diferencial (barrido DSC) es un método eficaz para la cuantificación biomolecular vinculante y plegable interacciones1,2,3. Los puntos fuertes de DSC incluyen su capacidad para aclarar vinculantes y mecanismos de plegamiento y rendir los correspondientes parámetros termodinámicos2,3. Además, DSC puede realizarse en solución bajo condiciones fisiológicas cerca y no requiere de etiquetado de la biomolécula o ligando, por ejemplo, con fluoróforos, etiquetas de spin o isótopos nucleares
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Protocolo
1. preparación de la muestra
- Purificar la biomolécula deseado13.
Nota: Este protocolo usa comprados cocaína vinculante ADN aptámeros MN4 después de intercambiar contra 2 NaCl M tres veces seguido por tres rondas de agua desionizada utilizando un filtro centrífugo con una membrana de corte de peso molecular de 3 kDa. - Sintetizar y purificar o comprar la deseada ligando termolábiles13.
Nota: MN4 se une la cocaína ligando termolábiles. MN4 también se une a la quinina, que se utiliza como un control negativo para thermolability ligando a estas temperaturas experimentales. - Preparación de buf....
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Resultados
Datos representativos para el DSC ligando termolábiles se muestran en la figura 1. La posición y altura del pico ligando enlazado termolábil sucesivamente cambios hacia la de las biomoléculas como el ligando termolábil se agota con cada exploración (Figura 1a). El perfil de desnaturalización libre se utiliza como referencia para el punto final de conversión ligando termolábiles (Figura 1b). Datos de .......
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Discusión
Modificaciones y la resolución de problemas
El información de los análisis de montaje global utilizado en la figura 1 y figura 2 ha sido descrito previamente4. Aquí, describimos aspectos prácticos de la realización y análisis de experimentos de unión de DSC con ligandos termolábiles. Tenga en cuenta que una base de DSC obtenidos para el ligando termolábil solo se resta del ligando + conjunto de .......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de interés.
Agradecimientos
R. W. H. V fue apoyado por el programa de formación ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC) en Bionanomachines y Ciencias naturales de McGill. A. K. M. y P. E. J. fueron apoyados por donaciones NSERC 327028-09 (A. K. M) y 238562 (P. E. J.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cloruro de sodio | Chem Impex | #00829 | |
| Fosfato de sodio monobásico dihidratado | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Fosfato de sodio dibásico | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Agua desyoinizada para biología molecular | Millipore | H20MB1001 | |
| filtros de jeringa estériles de 0,2 micras | VWR | CA28145-477 | |
| Filtros centrífugos de 3 kDa | Millipore | UFC900324 | |
| Tubo de diálisis Corte de 0,5-1,0 kDa | de Spectrum Laboratories | 131048 | |
| VWR | 89068-474 | ||
| Tapones de brida DSC de plástico | TA Instruments | 6111 | |
| Aptámero de ADN MN4 | Tecnologías de ADN integradas | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaína | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinina | Sigma Aldrich | 22620 | |
| Microcalorímetro NanoDSC-III | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | ||
| Software NanoAnalyze | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
Referencias
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I.
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Reimpresiones y permisos
