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Artículo de método

Perla base ensayo Multiplex para el análisis de perfiles de Cytokine de lágrima

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DOI:

10.3791/55993

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13 de octubre de 2017

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1National Healthcare Group Eye Institute, Tan Tock Seng Hospital, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), 3Institute of Molecular and Cell Biology, A*STAR, 4GROW Research Laboratory, Narayana Nethralaya Foundation, 5Vimta Labs Limited

En este artículo

Resumen

Análisis de la película del rasgón citoquinas ayuda en el estudio de varias enfermedades oculares. Ensayos multiplexores grano base son sencillas y sensibles y permiten el análisis de múltiples objetivos en muestras con pequeños volúmenes. Aquí se describe un protocolo para rasgar película del cytokine perfilar un uso grano base ensayo múltiple.

Resumen

Película lagrimal es una mezcla compleja de lípidos, proteínas y minerales que cubre la superficie externa del ojo, proporcionando así lubricación, nutrición y protección a las células subyacentes. Análisis de las lágrimas es un área emergente para la identificación de biomarcadores para la predicción, diagnóstico y pronóstico de diversas enfermedades oculares. Lágrimas son fácilmente accesibles y su colección es no invasivo. Por lo tanto, avance de la tecnologías están ganando protagonismo para la identificación de múltiples analitos en lágrimas para estudiar cambios en la composición de la proteína o metabolito y su asociación con condiciones patológicas. Citoquinas de lágrima son biomarcadores ideal para el estudio de la salud de la superficie ocular y también ayudan en la comprensión de los mecanismos de diferentes desordenes superficiales oculares como enfermedad del ojo seco y conjuntivitis vernal. Ensayos multiplexores grano base tienen la capacidad de detectar múltiples analitos en una pequeña cantidad de muestra con una mayor sensibilidad. Aquí describimos un protocolo estandarizado de recolección de muestras de lágrima, extracción y análisis de citoquinas perfiles utilizando una tira basan ensayo multiplex.

Introducción

Lágrimas son producidas por la glándula lagrimal y glándulas accesorias y cubrir la superficie externa del ojo. Película lagrimal consta de una capa de lípidos externa y una capa acuosa interna que incluye proteínas solubles, mucinas y membrana limitada mucinas. Lágrimas prevenir invasión microbiana, suministrar nutrientes y proporcionan lubricación a la superficie ocular. Lágrimas actúan como una interfaz entre el aire y el tejido para el transporte de oxígeno a la córnea. 1 la película lagrimal se compone de proteínas, carbohidratos, lípidos y electrólitos. La asociación entre las proteínas de la lágrima con enfermedades oculares y sistémicas como enfermedad del ojo seco, conjuntivitis vernal, glaucoma, diabetes mellitus, cáncer y orbitopatía tiroidea asociada ha sido identificado en varios estudios. 2 , 3 , 4 muestras de lágrima se pueden recoger por los tubos de microcapillary o de flujo lagrimal (Schirmer tiras). Además, prueba de Schirmer es un procedimiento estándar realizado en la córnea y cirugía refractiva clínicas, cuyos resultados pueden utilizarse para los ensayos de análisis del cytokine. Toma de muestra no invasiva, accesibilidad de la muestra de bio y la Asociación de la composición de la lágrima con varias condiciones fisiológicas y patológicas que una potencial fuente de biomarcadores para varias enfermedades oculares y sistémicas de la película del rasgón. 4 , 5 , 6

Rasgón de citoquinas juega un papel importante en el estudio de la salud ocular superficial y las condiciones inflamatorias de diferentes enfermedades oculares. 7 concentraciones anormales de varias citoquinas en las muestras de lágrima se informaron a estar asociada con la enfermedad del ojo seco, queratoconjuntivitis vernal (VKC), queratoconjuntivitis atópica (AKC), conjuntivitis alérgica estacional y uveitis. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 las proteínas de la lágrima pueden analizarse por métodos tradicionales como la espectrometría de masas, western blot y análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). 14 , 15 sin embargo, las limitaciones de estos métodos son sensibilidad pobre y un mayor volumen de muestra requerido para el análisis de múltiples citoquinas, desgarro en cada paciente. 16 , 17 ensayos multiplexores grano base se han desarrollado para analizar múltiples analitos en muestras de la mezcla compleja y aplicado con éxito en muestras de lágrima para analizar múltiples citoquinas en diferentes enfermedades. 6 , 18 A combinación de sandwich ELISA y técnicas de citometría de flujo permiten estos ensayos a ser más sensible que el ELISA para la cuantificación de múltiples analitos en una sola muestra. 19 este método puede ser aplicado en una variedad de muestras clínicas y sobrenadantes de cultivo celular y ayuda en el estudio de las respuestas inmunes en varias condiciones fisiopatológicas. 20 , 21 , 22 , 23 , 24

Existen varios estudios comparando múltiplex de grano basado en ensayos de ELISA y han reportado una correlación entre los métodos. Loo et al. en comparación con grano base ensayo multiplex con ELISA convencional para la detección de la adiponectina, resistina, leptina y grelina en muestras de suero o plasma humano y reportado una fuerte correlación (r > 0.9) entre los ensayos. 25 Dupont et al reportó una fuerte correlación entre ensayos multiplex grano base y ELISA para la detección de IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ y TNF-α en la fitohemaglutinina y lipopolisacárido estimularon sangre entera recogidos de las mujeres embarazadas. 26 Pickering et al reportó otro fuerte correlación entre el ensayo múltiple de grano base y ELISA para la detección de anticuerpos del suero a polisacárido de Haemophilus influenzae tipo b (r = 0.96), Toxoides de Tetani del Clostridium (r = 0.96) y Corynebacterium diphtheriae (r = 0.91). 27 Biagini et al informaron una alta correlación positiva (r = 0.852) entre grano basado en análisis multiplex y ELISA para la detección de Bacillus anthracis anti-PA IgG en muestras de suero. 28 Wang et al informaron una correlación entre el ensayo múltiple de grano base y ELISA para la detección de biomarcadores de la enfermedad de Alzheimer amiloide-β 42 (r = 0.77), tau total (r = 0,94) y tau fosforilada en aminoácido 181 (r = 0,82) en muestras de líquido cefalorraquídeo. 29 estos estudios han demostrado que la aplicabilidad de grano en variedad de muestras clínicas, requisitos de volumen de muestra más pequeños y una correlación con ELISA estándar, que hacen ensayos multiplex grano basado en un prometedor base ensayos multiplexores alternativa a los tradicionales métodos de ELISA para la detección de múltiples analitos en diferentes tipos de muestras en fenotipos diferentes de la enfermedad. Aquí describimos un protocolo estandarizado para el ensayo múltiple de grano base de perfiles de citocinas para 41 analitos en muestras de lágrima recolectadas de sujetos sanos utilizando tiras de Schirmer.

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Protocolo

los protocolos utilizados en este estudio fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de Tan Tock Seng Hospital, Singapur.

1. análisis del Cytokine del rasgón

  1. colección de lágrimas:
    1. pedir el tema para sentarse cómodamente en una silla de examen y coloque su cabeza contra la cabecera.
    2. Pedir el tema para ver, cuidadosamente abrir las tiras de Schirmer (hechas de papel de filtro Whatman no. 41) y coloque el extremo redondeado de la tira en la bóveda inferior del ojo e instruir el tema cerrar los ojos durante 5 minutos. Mientras recogía las lágrimas toman gran cuidado para minimizar el contacto de la superficie ocular. 30
    3. pedir el tema para abrir sus ojos para quitar la tira y colóquela en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril. Transferir inmediatamente el tubo al laboratorio o conservar a-80 o C hasta pruebas para perfiles de cytokine.
  2. Elución de la muestra lágrimas de tira de flujo lagrimal:
    1. cortar la tira de rasgón flujo a una longitud de 0,5 cm (para estandarizar la cantidad de lágrimas para probar) y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril.
    2. Añadir 30 μl de tampón de ensayo e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos seguido de centrifugación del tubo a 14.000 x g durante 1 minuto
    3. Transferir el sobrenadante a otro tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y deseche la tira. Coloque la muestra que contiene el tubo en hielo y utilice la muestra rasgón eluídas inmediatamente para perfiles de cytokine.
  3. Preparación de los reactivos:
    Nota: los analitos cuarenta uno a ser probado en cada muestra por ensayo multiplex grano base son interleukin (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL 7, IL-8, IL-9, IL-10, P40 de la IL-12, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, interferón-alfa (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-gamma-inducible proteínas 10 (IP-10, CXCL10) derivados de macrófagos quimiocina (MDC), proteína inflamatoria del macrófago (MIP)-1α y MIP-1β, monocitos proteína quimiotáctica (MCP) -1, MCP-3, factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α), TNF-β, oncogen regulado crecimiento (GRO), alfa del factor de crecimiento tumoral (TGF-α), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), fibroblastos factor de crecimiento (FGF) -2, derivan de plaquetas factor de crecimiento (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), eotaxin, fractalkine, ligando soluble de CD40 (sCD40L), Fms-like ligando de tirosina quinasa 3 (Flt - 3L) y regulados en la activación, normal T-cell expresado y secretado proteínas (RANTES).
    1. Llevar los frascos de solución (50 X) anticuerpo grano a temperatura ambiente (20-25 o C) y agitar los frascos durante 1 minuto
    2. Cuenta el número de pozos requeridos para el análisis y calcular la cantidad de anticuerpo total grano cóctel solución (25 μl por pocillo) y cada anticuerpo grano (50 X) necesaria para el análisis.
    3. Preparar la solución cóctel añadiendo la cantidad calculada de cada anticuerpo grano solución y relleno en el volumen final deseado mediante la adición de la cantidad restante de grano diluyente. Asegúrese de que la concentración final de cada anticuerpo en la coctelería es 1 X. Siempre preparar al menos 20% volumen extra de solución cóctel en caso de errores de pipeteo.
      Nota: Como ejemplo, para un ensayo de 96 pocillos preparar 3000 μl de solución Cóctel de anticuerpos del grano. La cantidad requerida de cada solución de anticuerpo grano = 3000/stock concentración de cada anticuerpo grano solución; 3000/50 = 60 μL de cada solución de grano de anticuerpo
      1. añadir 60 μL de cada una de las soluciones de grano 41 anticuerpos (60 X 41 = 2460 μL) en un cóctel de la botella y añadir 540 μl de la solución diluyente de grano a la mezcla de grano de anticuerpo para hacer 3000 μl de final solución de trabajo (1 X).
      2. Antes del uso, mezclar la solución Cóctel de grano correctamente. Después de que el ensayo de almacenar el volumen restante a 2-8 o C hasta 30 días.
    4. Preparar los controles de calidad (QC) añadiendo 250 μl desionizada agua a las poblaciones del control de calidad 1 y 2 de control de calidad.
    5. Mezclar correctamente por invertir las botellas varias veces y de vortex para transferencia s. 10 la solución debidamente etiquetadas tubos de microcentrífuga de polipropileno y guardar la solución restante a-20 ° C que se puede utilizar durante 30 días.
    6. Preparar el tampón de lavado agregando 270 mL de agua desionizada a 30 mL de 10 X buffer de solución de lavado y mezclar bien (antes de la dilución, el buffer X 10 a temperatura ambiente y disolver los precipitados sal mezclando). Almacenar el tampón de lavado sin utilizar (1 X) a 2-8 ° C, que se puede utilizar durante 30 días.
    7. Preparar la acción estándar del cytokine humano (10.000 pg/mL de todos los analitos) mediante la adición de agua desionizada μl 250 al frasco de stock. Mezclar bien por inversión del tubo varias veces y agitar el frasco para 10 s. déjelo reposar 10 minutos y transferir la solución madre a debidamente etiquetadas tubos de microcentrífuga de polipropileno. Después del ensayo, guardar la solución restante a-20 ° C, que se puede utilizar durante 30 días.
    8. Preparar los estándares de trabajo del cytokine humano por diluciones seriadas 5-fold (50 μl - > 200 μL) con tampón de ensayo para obtener 2000, 400, 80, 16 y 3.2 pg/mL.
    9. Después de la preparación estándar, utilice los estándares de trabajo dentro de 60 minutos y el tampón de ensayo como en blanco/fondo (-pg/mL).
  4. Perfiles del Cytokine por cordón basan ensayo multiplex:
    1. traiga todos los reactivos a temperatura ambiente y agitar durante 5-10 segundos antes de añadir a la placa de microtitulación de 96 pocillos. Si muestras eluídas lagrimales son almacenadas a -80 o C antes del ensayo, descongelar los extractos de lágrima congelada en el hielo y centrifugar a 1000 X g por 5 min
    2. Preparar una hoja de trabajo de ensayo en una configuración vertical para trabajar normas de citoquinas humanas [0 (en blanco), 3.2, 16, 80, 400, 2.000 y 10.000 pg/mL], QC1, muestras y QC2.
    3. Añadir 200 μL de 1 X de tampón de lavado para cada bien de la placa, sellar con sellador de placas y mantenerlo en un agitador de la placa a temperatura ambiente (20-25 o C) durante 10 minutos
    4. Decantar el tampón de lavado 1 X invirtiendo la placa y golpéela en toallas absorbente varias veces para eliminar la cantidad residual de tampón de lavado en los pocillos de.
    5. Añadir 25 μl de cada trabajo humano del cytokine estándar, QC1, QC2, en blanco (tampón de ensayo) y las muestras en los pocillos adecuados.
    6. Añadir 25 μl de tampón de ensayo en cada pocillo de.
    7. Añadir 25 μl de 1 X anticuerpo grano cóctel solución en cada pocillo. Como la solución de anticuerpo del grano es sensible a la luz, sellar la placa con el sellador de placa y cubrir con papel de aluminio para protegerlo de la luz durante el ensayo.
    8. Incubar la placa a 4 o C durante la noche en un agitador.
    9. Coloque la placa en el estante de placa de una lavadora automática placa magnética. Dejar reposar 1 minuto para colocar las bolas magnéticas en el fondo del pozo y aspire el contenido bien. Añadir 200 μL de tampón de lavado por pocillo y dejar reposar 1 minuto y luego aspirar el contenido bien. Repetir el lavado una vez más (para el lavado de la placa, siga el fabricante del kit ' instrucciones de s).
    10. Añadir 25 μl de solución de detección de anticuerpos en cada uno, la placa de sello, cubrirlo con papel de aluminio e incubar a temperatura ambiente durante 60 min en un agitador.
    11. Añadir 25 μl de Streptavidin-ficoeritrina solución en cada pocillo, sellar la placa, cubrir con papel de aluminio e incubar a temperatura ambiente durante 30 min en un agitador.
    12. Colocar la placa sobre una arandela de placa magnética. Dejar reposar 1 minuto y luego aspirar el contenido bien. Añadir 200 μL de tampón de lavado por pocillo. Dejar reposar 1 minuto y luego aspirar el contenido bien. Repetir el lavado una vez más.
    13. Agregar 150 μL de líquido de la vaina a cada bien y colocar la placa sobre un agitador durante 5 min a temperatura ambiente para resuspender los granos anticuerpos.
    14. Leer la placa inmediatamente utilizando el grano basado en lector de placas de ensayo múltiple y analizar las concentraciones de citoquinas utilizando un algoritmo de ajuste de curvas de 5 parámetros. Un diagrama de flujo del rasgón del cytokine perfil se muestra en la figura 1.
  5. Lectura de la placa de ensayo (instrumento configurado) y análisis de datos:
    1. encienda el grano basado en lector de ensayo múltiple y pre-caliente el láser durante 30 minutos
    2. Iniciar el software de ensayo múltiple de grano base. Bajo el ' mantenimiento automatizado ' ficha, seleccione la ' verificación de la calibración ' opción. Vortex cada reactivo frasco de las perlas de calibración y verificación para 30 s. lugar 5 gotas de cada reactivo en los pozos designados. Llenar los embalses designados con etanol desionizado del agua y el 70%.
    3. Crear un nuevo protocolo
      1. abrir el ' protocolos ' Página y luego el ' protocolos ' ficha haga clic en " crear nueva ProtocolŔ el ' configuración ' pestaña abrirá.
      2. En la ' nombre ', escriba el nombre del protocolo.
      3. Escriba una descripción en el cuadro a la derecha de la ' nombre ' caja.
      4. En el ' versión ', escriba la versión del Protocolo de.
      5. En el ' fabricante ', escriba la información del fabricante para el protocolo de.
      6. Definir ajustes en el ' ajustes de adquisición ' la sección siguiente. Set ' volumen ': 100 μl, ' tiempo de espera ': 60 s; ' Compuerta DD ': 8.000 a 15.000; ' Reportero ganancia ': PMT estándar; ' Del grano de tipo ': grano magnético.
      7. Definir ajustes en el ' configuración de análisis ' apartado, selección de ' cuantitativo ' como el tipo de análisis. Set ' serie de estándares ': 6; ' Número de controles ': 0; Marque el ' significa de replica ' caja;
        Marca la ' analizar los resultados mientras adquiere muestras ' caja.
      8. Haga clic en " NextŔ la ' analitos ' pestaña se abre, haga clic en los deseada analitos (ID del grano) en la cuadrícula numerada analito.
      9. Hacer clic y escribir el analito correspondiente nombre en la ' nombre de ' columna a la derecha de la cuadrícula de analito (analitos ' nombres y sus correspondientes detalles de región de grano fueron mencionados en la tabla 1).
      10. Haga clic en y escriba la deseada unidad de medida (es decir, pg/mL) en el ' unidades ' caja a la izquierda de la ' aplicar todos ' botón. Haga clic en " aplicar los ".
      11. Hacer clic y escribir el grano deseado contar para cada analito (por ejemplo 50) en el ' Conde ' caja. Haga clic en " se aplican todos los ".
      12. Clic " NextŔ abre la ficha Diseño de la placa. Destacar los pozos para los estándares y seleccione " 2 " en replicar la cuenta y haga clic en el " S " botón estándar. Repita este paso para el fondo " B " y " U " wells.
      13. Clic " guardar ".
    4. Crear nuevas normas/Control de lotes
      1. abierto el ' protocolos ' Página y luego la ' normas & controles ' ficha haga clic en " crear nuevos lotes de estándar/Control ".
      2. Abierto el ' protocolo seleccione ' caja. Seleccione el protocolo que creó en el paso 1.5.3.
      3. Clave en la información de las normas en consecuencia: número de kit Std/Ctrl, kit nombre Std/Ctrl, caducidad y fabricante.
      4. Clave en el valor de la norma más alta para cada analito (es decir, 10000 pg/mL). Introduzca 5 bajo dilución y haga clic en " aplicar todos " para generar automáticamente las concentraciones previstas para el resto de las normas de.
      5. Clic " guardar ".
    5. Crear un lote nuevo de un protocolo existente
      1. abierto el ' lotes ' Página y haga clic en " crear una pestaña nueva hornada de un protocolo existente ".
      2. Escribe el nombre del lote en el ' nombre ' cuadro y una descripción sobre el lote en el ' Descripción opcional entrar ' caja.
      3. Haga clic en el Protocolo generado anteriormente (en el paso 1.5.3).
      4. Haga clic en " NextŔ la siguiente pestaña que se abre es la ' ETS & Ctrls ' ficha ver los detalles de las normas de ensayo y seleccione " siguiente ".
      5. En la ' diseño de placa ' pestaña, asignar comandos bien para este lote y haga clic en " guardar " para guardar la información de lote para el ' lote pendientes ' lista.
      6. La placa de carga en el lector de placa de ensayo múltiple de grano base, agitar durante 5 min y ejecutar el lote de la lista de pendientes por lotes. Los datos adquiridos se guardará en el formato de archivo .csv.
  6. Análisis de datos
    1. convertir el archivo .csv generado por el software de ensayo múltiple de grano base .rbx formato de archivo (archivo de datos de resultados) mediante el software de conversión de rbx. Iniciar el software de conversión, seleccione el archivo .csv con xPONENT seleccionar archivo (s) y haga clic en el " generar " botón; el archivo .rbx se guardará en la carpeta de salida seleccionado.
    2. Iniciar el software de análisis y abra el archivo .rbx.
    3. Optimizar las curvas estándar usando la curva de 4PL/5PL ajuste.
      1. Seleccione lo siguiente en el ' curva estándar ' ficha: ' tipo de regresión ': ' logístico-5PLƆ ' eje transformación ': ' Cienc - garrapata Ɔ lineal (y) la ' Mostrar líneas de gama de Conc ' caja, marque el ' Mostrar desconocido Muestras ' de la caja; Marca la ' Mostrar muestras de Control de ' de la caja; Marque el ' aplicar a través de todos los analitos ' caja; Marque el ' Mostrar informe después de optimización ' caja.
      2. Haga clic en el " optimizar " botón para auto-optimización.
    4. La identidad de la muestra bajo la etiqueta ' entrar muestra información ' ficha
    5. Obtener las concentraciones observadas en la ' informe de tabla ' ficha y haga clic en " Exportar tabla de informe " para generar los datos en un archivo de hoja de cálculo para su posterior análisis.

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Resultados

Se recolectaron muestras de desgarro de 8 ojos de 4 sujetos sanos utilizando tiras de flujo lagrimal y niveles del cytokine fueron analizados utilizando el protocolo mencionado. Todos los sujetos eran varones y la edad de los cuatro temas fue de 36, 42, 44 y 52 años respectivamente. Salud de superficie ocular y ojo seco la enfermedad fue evaluada por ensayos clínicos (rotura de película lagrimal tiempo, Schirmer prueba, tinción corneal, tinción conjuntival, examen de la glándula meibomian...

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Discusión

Las citoquinas son pequeñas proteínas de secreción celulares y potentes moduladores inmunes, regula las respuestas inmunitarias. 32 los perfiles de expresión de varias citoquinas en el desgarro las muestras están relacionadas con diversas condiciones patológicas del ojo y estudios sobre citocinas perfiles ayudan a comprender los mecanismos de patogénesis de la enfermedad, determinar el estado de salud ocular, severidad de la enfermedad, diagnóstico y evolución. 2 ,

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar. Ningún interés financiero o conflicto de intereses.

Agradecimientos

El trabajo de investigación fue apoyado por el centro de Tan Tock Seng Hospital personalizado semilla financiamiento programa 2015; Beca de piloto de Instituto de investigación de Singapur ojo y Tan Tock Seng Hospital echada para fondo de beca.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Milliplex MAP citoquina humana / panel de perlas magnéticas de quimiocina -1 kitMerck, EE. UU.HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D instrumento luminex Luminex Corp, Austin, TX, EE. UU.
software xPonent  Luminex Corp, Austin, TX, EE. UU.
RBXGenerador softwareBIO-RAD, Francia
Bio-Plex Manager 6.1BIO-RAD, Francia
Agitador de placasCorning, EE. UU.
Lavadora de microplacas TECANTecan, SuizaHydroSpeed
Vortex Genie 2Scientific Industries inc, EE. UU.G560E
PipetasMettler Toledo, CA, EE. UU.
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mlAxygen, EE. UU.MCT-150-C
Tira de prueba de flujo lagrimal SchirmerEye Care and Cure, EE. UU.101657
Kit de calibración Flexmap 3DLuminex Corp, Austin, TX, EE. UU.40-028
Kit de verificación Flexmap 3D LuminexCorp, Austin, TX, EE. UU. 40-029
Sillón
de exploración ocular

Referencias

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