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Artículo de método

Toxicidad del amiloide β42 de modelado y la neurodegeneración en cerebro de pez cebra adulto

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DOI:

10.3791/56014

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25 de octubre de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1German Centre for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Dresden within Helmholtz Association, 2B CUBE, Center for Molecular Bioengineering, Technische Universität Dresden, 3Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD), TU Dresden

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la síntesis, caracterización y la inyección de péptidos monomérico amiloide-β42 para generar toxicidad amiloide en pez cebra adulto para establecer un modelo de la enfermedad de Alzheimer, seguido por análisis histológicos y la detección de agregaciones.

Resumen

Enfermedad de Alzheimer (EA) es una debilitante enfermedad neurodegenerativa en la que la acumulación de amiloide tóxico-β42 (Aβ42) péptidos conduce a degeneración sináptica, inflamación, muerte neuronal y déficit de aprendizaje. Los seres humanos no pueden regenerar las neuronas perdidas en el caso de AD en parte debido a la deteriorada capacidad proliferativa de las células progenitoras neuronales (NSPCs) y reducción de la neurogénesis. Por lo tanto, terapias regenerativas eficaces también deben aumentar la proliferación y capacidad neurogénica NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) es un organismo regenerativo y podemos aprender los programas moleculares básicos que podríamos diseñar enfoques terapéuticos para hacer frente a AD. Por esta razón, fue necesaria la generación de un modelo de AD-como en el pez cebra. Con nuestra metodología, podemos introducir derivados sintéticos de Aβ42 péptido con capacidad penetrante de tejido en el cerebro del pez cebra adulto y analizar la patología de la enfermedad y la respuesta regenerativa. La ventaja sobre los métodos existentes o modelos animales es que pez cebra puede enseñarnos cómo un cerebro vertebrado puede regenerar naturalmente y así nos ayudan a tratar mejor las enfermedades neurodegenerativas humanas dirigiéndose NSPCs endógenas. Por lo tanto, el modelo de toxicidad del amiloide en el cerebro del pez cebra adulto puede abrir nuevas avenidas para la investigación en el campo de la neurología y la medicina clínica. Además, la ejecución simple de este método permite la evaluación experimental rentable y eficiente. Este manuscrito describe la síntesis y la inyección de péptidos de Aβ42 en cerebro de pez cebra.

Introducción

AD es una enfermedad progresiva crónica caracterizada por la pérdida de neuronas y sinapsis en la corteza cerebral1,2,3,4,5. Los sellos clásicos de neuropathological del anuncio son los depósitos de péptidos amiloides y formación de los ovillos enredos (NFTs)6. Las placas seniles, también conocido como placas amiloideas, están compuestas de péptidos amiloide-β (Aß) que forman estructuras de β-plisadas en el parénquima cerebral del5. La acumulación de Aβ42 en pacientes con EA tiene un papel temprano y crítico en la progresión de la enfermedad. Anuncio desencadena una cascada de eventos que llevan a disfunción sináptica y plasticidad deteriorada pérdida neuronal7,8,9,10.

El cerebro adulto del pez cebra teleósteos sirve como un excelente modelo para estudiar la regulación de la célula de vástago plasticidad11,12,13,14,15, 1617,de,18,19,20 y diversas enfermedades en el sistema nervioso central (SNC), incluyendo AD21,22,23 ,24. Debido a una gran variedad de métodos experimentales disponibles19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, estos estudios son informativos y factible. Pez cebra puede llenar el CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, en parte mediante el uso de programas moleculares activados después de la pérdida neuronal19,39,40,41,42,43, 44. Por lo tanto, establecer un modelo de enfermedad neurodegenerativa en el pez cebra puede ayudar a resolver las preguntas novela sobre biología Regenerativa de capacidad y células madre en cerebros vertebrados.

Recientemente, hemos desarrollado un modelo de la toxicidad del amiloide en cerebro de pez cebra adulto inyectando sintético Aβ42 péptidos (tabla 1)39. Esta inyección causa neurodegeneración fenotipos de patología del cerebro humano (p. ej., muerte celular, la activación microglial, degeneración sináptica y déficits de la memoria), que indica ese pez cebra puede ser utilizado para la obtención de neurodegeneración en cerebro de pez cebra, Aβ42 péptidos pueden ser detectados con los stainings de immunohistochemical y mecanismos moleculares de la regeneración en pez cebra adulto que CNS puede ser identificado39. En este protocolo, demostramos la inyección de péptidos sintéticos de amiloide en el cerebro de pez cebra con cerebroventricular inyección (CVMI) método27,39,45,46 para imitar la deposición amiloidea (figura 1). CVMI ofrece una forma novedosa de entregar los péptidos, que agregan a inyección como estructuras de β-hoja y ejercen toxicidad. Los péptidos se distribuyen uniformemente a través del cerebro, a la zona ventricular a lo largo del eje rostro caudal entero45. Además, este método permite analizar la respuesta morfológica y molecular de las NSPCs en cerebro de pez cebra adulto después de inclusiones amiloideas. Este tipo de estudios nos dará una idea para la reparación exitosa del cerebro en mamíferos. Nuestro método puede utilizarse para comprender el mecanismo molecular necesario de una respuesta exitosa regeneración después de los síntomas de AD-como para inducir la reposición de las neuronas perdidas y recuperación funcional.

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Protocolo

este protocolo es un procedimiento estándar sugerido por las directrices de la UE (2010/63) y la sociedad europea de modelos de peces en biología y medicina (EuFishBioMed) en Karlsruhe Instituto de tecnología (KIT). Todos los métodos descritos después de aquí han sido aprobados por la Comisión de ética (Landesdirektion Dresden; número TVV-52/2015).

1. preparación de Aβ42 péptido

  1. sintetizar péptidos (ver tabla 1) utilizando la química estándar 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) con 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) como el reactivo de acoplamiento en un sintetizador de péptidos de fase sólida automatizada 52. La escala de la síntesis fue μmol 100.
  2. Carga el sintetizador de péptidos automatizada con 500 mg de la resina de Fmoc-protegido como la fase sólida (capacidad de 0,2 mmol/g de carga). Los aminoácidos Fmoc-protegidos disueltos a una concentración 0,5 M de la carga en el volumen requerido y calculado para el sintetizador respectivo.
    Nota: Los cálculos se hacen para permitir el acoplamiento de cada aminoácido protegido de Fmoc dos veces con el exceso de 5 veces de cada bloque de edificio para la resina 47.
  3. Disolver los reactivos necesarios para la síntesis de péptidos en dimethlyformamide (DMF). Por ejemplo, preparar el activador, HBTU, en una concentración de 0,48 M, 45% v/v N-Methylmorpholine (NMM) (la base) y el 5% v/v anhídrido acético (la mezcla que capsula) para los grupos aminos no reaccionó.
  4. Desdoblan los péptidos de la resina mezclando continuamente el soporte sólido mediante un mezclador en una mezcla de escote recién preparada de ácido trifluoroacético (TFA): Triisopropylsilane(TIS): agua: Dithiothreitol (DTT) a 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2,5 (m/v), para 4 h. Use 10 mL para la escala de síntesis de 100 μmol.
  5. Precipitar el producto exfoliado mediante la adición de la mezcla de escote a 100 mL de éter de dietilo helada. Pasar a través de una unidad de filtración con un filtro de politetrafluoroetileno (PTFE) con un tamaño de poro de 0,45 μm y lavado con éter dietílico helada de 20 mL.
  6. Recoger el péptido filtrado desde el papel de filtro y disolver 100 mg de péptido precipitado en 5 mL de agua destilada desionizada agua: acetonitrilo 1:1.
  7. Purificar por cromatografía líquida alta presión fase inversa (CLAR) en un HPLC semi-preparativa equipado con una columna porosa poliestireno divinilbenceno de grano tamaño 10 μm.
    1. Calentar previamente la columna y se mantiene a 50 ° C utilizando una columna de aparato de la calefacción. Se recogerán todas las fracciones principales utilizando un colector de fracciones automatizada aplicando un gradiente de 5% a 100% solvente B durante 25 min a 4 mL/min
      Nota: A solvente es 0.1% TFA en el agua y el solvente B es 0.1% TFA en acetonitrilo 52.
    2. Monitorear el cromatograma a 220 nm, recoger los picos adecuados y analizar mediante LC-MS.
  8. Confirmar la pureza de marcha analítica fase ultra alta presión líquida cromatografía (UPLC) a 220 nm controlando con un Detector Ultravioleta pasando la muestra por una columna C18 analítica (grano tamaño 1.7 μm). Espectrometría de masas para confirmar el producto péptido.
    Nota: La UPLC es acoplada a una espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) y el tándem cuadrupolo Detector.
  9. Liofilizar las fracciones correcta del péptido deseado en un matraz de fondo redondo, aplicando un vacío de 0.052 mbar, para un polvo mullido. Acoplar la bomba de vacío a una unidad de congelación mantenida indefinidamente a-78 ° C. tienda a-80 ° C,.
  10. Utilizar el péptido liofilizado para preparar una solución stock de 1 mM en una mezcla de acetonitrilo: DMF: agua de grado analítico en el 1:1:1 para los experimentos. Esta solución se puede conservar durante al menos 6 meses, como los péptidos no se agregan en esta solución.

2. Preparación de la mezcla de inyección

  1. preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) para la dilución de los péptidos liofilizados.
  2. Disolver el péptido a una concentración final de 20 μm en PBS. Preparar esta solución fresca. Mezcla bien y almacenar en hielo hasta la inyección. No exceda 30 min para evitar la agregación en solución.

3. Anestesia

sistema
  1. Prepare la solución de los anestésicos, 0.1% etil-m-aminobenzoato methanesulphonate (MESAB), en agua de pescado regular de la circulación. Preparar la solución para la anestesia a una concentración final de 0.0025% (v/v).
  2. Quitar el número deseado de peces de los tanques en un recipiente de transporte con 5 L de agua del sistema.
  3. Mitad-llenar un plato de Petri (90 mm) con anestésicos de 40 mL de plástico. Utilizar este plato para las inyecciones.
  4. Incubar los peces en los anestésicos hasta que haya cesado el movimiento opercular.

4. Cerebroventricular microinyección

  1. preparación de aparatos de inyección
    1. preparar el vidrio capilares de inyección utilizando un extractor de aguja con los siguientes parámetros: calefacción de ciclo, 537, tirando ciclo, 250, velocidad, 1.5 s; tiempo, la Sra. 80
    2. hacer el ajuste de presión en la fuente de presión 25 psi.
    3. Configurar los parámetros de microinyectora para lo siguiente: Mantenga presión de 20 psi, presión de expulsión 10 psi; período valor 2.5 bloquea la Sra. valor 100
    4. Cargar el capilar de vidrio con la solución de la inyección. Introduzca el capilar de vidrio en el soporte de microinyección. Ajustar el ángulo de inyección de 45°.
      Nota: Los protocolos más detallados pueden encontrarse como se describe en referencias 27 , 46.
  2. Llenan de un peces lugar en una nueva placa de Petri con solución para la anestesia (como en el paso 3.3).
  3. Mantener el pescado con las pinzas y Oriente para la inyección.
  4. Generar un corte con la punta de una aguja de 30 G en el cráneo en El tectum óptico donde se unen las dos placas laterales. No introduzca la punta en el tejido cerebral, esto causaría sangrado y daño. Ver referencias 27 , 45 , 46 para obtener más detalles.
  5. Introduzca el capilar de vidrio en la abertura.
    1. Usar la punta de la aguja y no penetran más de 1 mm a través del cráneo. Sigue aguantando el pescado e inserte la punta del vaso capilar a través del sitio de incisión.
    2. Orientar la punta del vaso capilar hacia el telencéfalo a un ángulo de 45°. Inyectar 1 μl de la solución. El líquido se dispersa inmediatamente después de la inyección.

5. Recuperación

  1. lugar los peces hacia un contenedor de transporte hasta que recupera. Conectar el recipiente para el agua de peces regularmente circulante para asegurar la calidad óptima de agua.
    Nota: La recuperación debe tomar 1 minuto. Si tarda más, el pescado debe mantenerse en los anestésicos durante un tiempo más corto (esto debe de ser optimizado por el experimentador).

6. Preparación de tejido y secciones

  1. esperar un período de tiempo antes de sacrificar a los peces.
    Nota: Esto depende de la pregunta experimental. Deposición amiloidea puede verse tan solo 1 día después de la inyección.
  2. Sacrificar a los peces utilizando el método apropiado dependiendo de las normas éticas (por ejemplo, tratar a los peces con 0,1 M MESAB).
  3. Abrir el cráneo sobre El tectum óptico utilizando pinza puntiaguda en la parte dorsal y disecar la cabeza justo detrás de la aleta pectoral con un bisturí.
  4. Fijar las cabezas usando 2% paraformaldehido (PFA) durante la noche a 4 ° C. utilizar 3 mL de PFA por cabeza en un tubo de plástico con una tapa del tornillo de.
    PRECAUCIÓN: Use el equipo de protección personal cuando maneje PFA.
  5. Para crioprotección y descalcificación, lavarse la cabeza tres veces en 0.1M tampón fosfato (pH 7,4), transferencia en 20% sucrose/20% etilendiaminotetracético (EDTA) solución e incubar durante la noche a 4 ° C.
  6. Para incrustar el tejido en la resina, de seccionamiento congelar las cabezas en la solución de sacarosa 7,5% gelatin/20% en moldes de histología plástica en hielo seco (aproximadamente 3-5 min para congelar un bloque). Almacenar las muestras a-80 ° C o seguir el siguiente paso (cryosectioning).
  7. Sección las cabezas en cryosections gruesa de 12 μm utilizando un criostato como descrito 28 , 42. Transferir los cryosections directamente sobre los portaobjetos de vidrio y conservarlo a-20 ° C para uso a largo plazo.

7. Tinción inmunohistoquímica y la microscopia

Nota: realizar todos los pasos de incubación en una cámara humidificada. Y todos los pasos de lavado son de 10 minutos cada uno.

  1. Secar las secciones durante 30 min a temperatura ambiente. Después de descongelar, lavar las secciones dos veces en PBS y una vez en PBSTx (PBS con 0,03% Tritón X-100).
  2. Incubar con el anticuerpo primario (anticuerpo anti-Aβ42; dilución 1: 500 en PBSTx) a 4 ° C durante la noche tras día, lavar una vez en PBS y dos veces en PBSTx.
  3. Incubar las secciones con el anticuerpo secundario (detección de fluorescencia junto, dilución 1: 500) junto con DAPI (1 μg/mL) en PBSTx por 2 h a temperatura ambiente.
  4. Lavado tres veces en PBSTx. Después del lavado final, montar el portaobjetos con un cubreobjetos usando glicerol de 70% de 100 μL.
  5. Adquirir imágenes fluorescentes utilizando un microscopio confocal (por ejemplo con objetivo 20 X PL APO N.A. 0.7 con 488 rango de excitación y un filtro verde estándar; figura 2) 39.

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Resultados

HPLC se utiliza para purificar el péptido sintetizado y espectrometría de masas se ha utilizado para caracterizar los péptidos β amiloide purificada. La columna HPLC se calienta a 50 ° C para mejorar la separación de los péptidos Aβ y se recolectaron las fracciones. Para identificar el péptido sintetizado correctamente, se realizó análisis de espectrometría de masas para todas aquellas fracciones. El cromatograma UPLC muestra la pureza del compuesto. La fracción HPLC que produjo un pico e...

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Discusión

Los péptidos amiloides pueden modificarse para incluir variaciones de secuencia o varias etiquetas. Por ejemplo, se puede generar un péptido amiloide revuelto, y los péptidos pueden ser marcados con etiquetas fluorescentes en el N-terminal del extremo del péptido o etiquetados portador péptidos39. Del mismo modo, en el presente Protocolo, el péptido portador es el penetrar en la célula péptido TR debido a su eficacia para el transporte de carga profunda en el tejido cerebral del3...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por DZNE y la Asociación Helmholtz (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) y DFG (KI1524/6) (CK); y por la Asociación de Leibniz (Sierra-2011-IPF-2) y el BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). También nos gustaría agradecer a Ulrike Hofmann para síntesis de péptidos y Nandini Asokan, Prayag Murawala y Elly Tanaka durante la filmación del procedimiento.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aminoácidos protegidos contra FmocIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania)Aminoácidos basados en Fmoc para la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)hexafluorofosfato de uronio (HBTU)IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania)Activador RL-1030
OxymaIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania)RL-1180Supresor de racemización
N,N-diisopropiletilaminaIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania)SOL-003Base
DimetilformamidaIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania)SOL-004Disolvente
N-metilmorfolinaThermo Fisher (Kandel) GmbH, AlemaniaA12158Base
1-hidroxibenzotriazol hidrato (HOBT)Sigma-Aldrich Co. LLC. ( St. Louis, MO, EE. UU.)157260 ALDRICHActivador
PiperidinaMERCK KGaA (Darmstadt, Alemania)822299Reactivo de desprotección Fmoc
Diclorometano (DCM)MERCK KGaA (Darmstadt, Alemania)106050Disolvente
Ácido fórmico (FA)MERCK KGaA (Darmstadt, Alemania)100264Componente tampón para HPLC
Ácido trifluoroacético (TFA)MERCK KGaA ( Darmstadt, Alemania)808260Reactivo de mezcla Clevage
Triisopropilsilano (TIS)MERCK KGaA (Darmstadt, Alemania)233781 ALDRICHClevage Reactivo de mezcla
Acetonitrilo (para UPLC/LCMS)Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH34967-1LSolvente
Acetonitrilo (para HPLC)VWR International Ltd, Inglaterra83639.320Solvente
DiethyletherVWR International Ltd, Inglaterra23811.326Disolvente para la precipitación de péptidos
Dithiotritol (DTT)VWR International Ltd, Inglaterra0281-25GClevage Reactivo
de mezcla TentaGel S RAM Resina de amida para pista FmocRapp Polymere GmbH (Tubinga, Alemania)S30023Fase sólida para
síntesis de péptidos SPPS Jeringas de 5 ml con filtros incluidosIntavis AG (Colonia, Alemania)34.274Tubo de reacción para SPPS y para clevage del filtro de
politetrafluoroetileno (PTFE)Sartorius Stedtim (Aubagne, Francia)11806-50-NFiltración de péptidos precipitados Filtro
de jeringa de fluoruro de polivinilideno (PVDF)Carl Roth GmbH + Co. KG KarlsruheKC78.1Prefiltración para HPLC
Sintetizador de péptidosIntavis, Colonia, AlemaniaResPep SLSintetizador automatizado de péptidos en fase sólida
Water Alliance HPLCWaters, Milford Massachusetts, EE. UU.Waters 2998, Waters e2695Cromatografía líquida de alta presión (HPLC) semipreparativa en fase
inversaPolymerX, tamaño de perla 10μ m, 250x10 mmPhenomenex Ltd. Alemania00G-4328-N0Columna de HPLC de poliestireno divinilbenceno poroso
Milli-Q Advantage A10, con filtro Milli-QEMD Millipore Corporation, Billerica, MA, EE. UU. LCPAK0001Sistema de purificación de agua
Unidad de filtraciónSartorius Stedtim (Aubagne, Francia)16307Unidad de filtración para precipitación de péptidos
UPLC Aquity con detector UVWaters, Milford Massachusetts, EE. UU.M09UPA 664MFase inversa analítica ultra HPLC para LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, tamaño de cordón 1.7 μ m, 50x2.1 mmWaters, Milford Massachusetts, EE. UU.186002350Columna analítica C18
Detector ACQUITY TQWaters, Milford Massachusetts, EE. UU.QBB908Espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Alemania16706, 101542Liofilizador con bomba de vacío
Lector de placas ParadigmBeckman Coulter
MESAB (metanosulfonato de etil-m-aminobenzoato)Sigma-AldrichA5040
Placas de PetriSarstedt821.472
Solución salina tamponada con fosfatoLife Technologies, GIBCO10010-056
AgujaBecton-Dickinson305178
Microscopio de disecciónOlympus, Leica, ZeissVaría según el fabricante
Pinzas DumontWorld Precision Instruments501985
Pinzas de disección GilliesPrecision Instruments501265
Capilares de inyecciónde vidrio World Precision InstrumentsTWF10
PicoNozzleWorld Precision Instruments5430-12
Iluminador de anillo neumático PicoPumpWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
; Guía de luz anularParklandScientific ILL-RLG
CryostatLeicaCM1950
en fase sólida World

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