Artículo de método

Aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón Umbilical humano

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DOI:

10.3791/56021

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14 de septiembre de 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

Autores correspondientes: Kartik Balachandran <kbalacha@uark.edu>

En este artículo

Resumen

El objetivo de este protocolo es aislar las células progenitoras endoteliales de cordón umbilical. Algunas de las aplicaciones incluyen el uso de estas células como un biomarcador para identificar pacientes con riesgo cardiovascular, tratamiento de enfermedades isquémicas, y construye creando ingeniería de tejido vascular y del corazón la válvula.

Resumen

La existencia de células progenitoras endoteliales (EPCs) en sangre periférica y su implicación en la vasculogénesis primero fue divulgado por Ashara y colegas1. Más tarde, otros documentaron la existencia de tipos similares de EPCs procedentes de médula ósea2,3. Más recientemente, Yoder y Ingram demostró que EPCs derivan de la sangre del cordón umbilical tenían un potencial proliferativo más alto en comparación con los aislados de adulto periférico sangre4,5,6. Aparte de estar involucrado en la vasculogénesis posnatal, EPCs también han demostrado promesa como fuente de células para crear ingeniería de tejido vascular y del corazón la válvula construcciones7,8. Existen varios protocolos de aislamiento, algunas de las cuales implican la clasificación de la célula de células mononucleares (MNCs) derivadas de las fuentes mencionadas anteriormente con la ayuda de marcadores endoteliales y hematopoyéticas, o cultivo de estas multinacionales especializados crecimiento endotelial medio, o una combinación de estas técnicas9. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y cultura de EPCs usando especializado endotelial suplementado con factores de crecimiento, sin el uso de immunosorting, seguido de la caracterización de las células aisladas mediante Western Blot y immunostaining.

Introducción

Varios investigadores han estudiado las características y el potencial de humano EPCs5,10,11,12,13. EPCs pueden describirse como la circulación de las células que tienen la capacidad de adherirse al tejido endotelial en sitios de hipoxia, isquemia, lesiones o la formación del tumor y contribuir a la formación de nuevas estructuras vasculares4,14. Su participación observado en neovascularización, en forma de vasculogénesis posnatal, ha conducido a una comprensión de la patofisiología de estas células y su uso en aplicaciones terapéuticas4,15, 16. el número de EPC en un individuo se ha demostrado para ser correlacionado con patología cardiovascular9,15,16,17,18,19 ,20. Otros estudios han también diferenciado EPCs en un fenotipo de fibroblasto-como de la válvula y que estas células podrían utilizarse para ingeniería de tejidos corazón válvulas7,21.

Las moléculas de superficie celular particular necesarias aislar a EPCs no han sido claramente identificadas debido a las discrepancias entre las investigaciones4. La adhesión de las empresas multinacionales a una matriz, con la exposición a una variedad de condiciones de cultivo, se ha realizado por varios grupos1,17,22,23, sugiriendo que EPCs putativos puede Mostrar diferentes propiedades fenotípicas. Estas propiedades incluyen la falta de capacidad phagocytotic, formación del tubo en Matrigel y la captación de lipoproteínas de baja densidad Dil-acetilado. El potencial proliferativo y clonogenic alta son dos propiedades con que EPC puede ser jerarquizada5. EPCs pueden también formar en vitro de túbulos cuando morfología de fibroblastos de pulmón fetal humano4. Se conocen estas células expresan marcadores de superficie celular endotelial y compartir algunos de los marcadores hematopoyéticos13,24,25. Los marcadores expresados positivamente que son ampliamente aceptados para EPCs phenotyping son CD31, CD34, receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 (VEGFR2), von Willebrand Factor (FvW), CD133, c-Kit y vascular endotelial cadherina (VE-cadherina)4 , 18. las células que expresan Co CD90, CD45, CD14, CD115 o actinia alfa-lisa del músculo (α-SMA) no se consideran ser EPC debido a su limitada proliferativa potencial, capacidad de fagocitar bacterias e incapacidad para formar de nuevo humano vasos en vivo4,7. Este artículo describe un protocolo modificado para el aislamiento de las células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón umbilical humano sin necesidad de cualquier célula clasificación de protocolos. Para este artículo, utilizamos CD31, CD34 y VEGFR2 como los marcadores positivos, con α-SMA como el indicador negativo.

En este artículo, proponemos un método de aislamiento y cultivo de células endoteliales progenitoras de sangre del cordón umbilical sin clasificar usando la célula especializada medio crecimiento endotelial suplementado con factores de crecimiento (EGM). Este EGM contiene factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento fibroblástico (FGF), que mejoran la supervivencia, proliferación y migración de células endoteliales26. También incluye el ácido ascórbico, que es responsable de mantener la morfología de adoquines de células; insulina-como factor de crecimiento-1 (IGF-1), que proporciona angiogénicos y función migratoria; y heparina, la cual causa mayor estabilidad a largo plazo de factores de crecimiento en el medio26. Otros factores de crecimiento añadidos al medio de cultivo de células endoteliales incluye la suplementación con factor de crecimiento epidérmico (EGF), que ayuda a estimular la proliferación celular y la diferenciación y la hidrocortisona, que sensibiliza las células al EGF26 . Nos muestran que el uso de este medio de crecimiento produce un número mayor de EPCs en comparación con medio basal endotelial (EBM) o modificado Eagle Medium (DMEM de Dulbecco).

Protocolo

esta investigación se llevó a cabo con la aprobación de la Universidad de Arkansas Junta de revisión institucional (número 16-04-722). Unidades de sangre de cordón umbilical fueron recolectadas en solución citrato fosfato dextrosa (CPD) en el Banco de sangre de cordón de Arkansas, y unidades que no cumplían con el requisito de almacenamiento fueron donadas para la investigación. Unidades de sangre de cordón fueron por servicio Courier al laboratorio dentro de 24 h de colección en las temperaturas ambiente.

1. aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre del cordón

  1. preparación de los reactivos.
    1. EGM preparar añadiendo medio basal endotelial (EBM) al 10% de suero bovino fetal (FBS) suplementado con 20 ng/mL de insulina-like growth factor (IGF), 1 μg/mL de ácido ascórbico, 5 ng/mL recombinante humana factor de crecimiento (rhEGF), 22,5 μg/mL heparina y 0,5 ng/mL factor crecimiento endotelial vascular (VEGF), junto con 10 ng/mL de factor de crecimiento fibroblasto humano recombinante B (rhFGF-B), hidrocortisona μg/mL 0,2 y 2% penicilina-estreptomicina-glutamina. Esterilizar el medio de cultivo utilizando un filtro de vacío de membrana de polyethersulfone (PES) de 0.2 μm.
    2. Preparar rata I cola solución de colágeno en una concentración de 50 μg/mL 0.02 N acético ácido. Esterilizar esta solución con un filtro de jeringa de 0,2 μm.
    3. La capa bien 6 placas con 2 mL de preparado rata I cola solución colágeno para cada pozo. Colocarlos en una incubadora mantenida en 5% CO 2 y 37 ° C durante al menos 1 h antes de sembrar.
    4. Diluir aproximadamente 25 mL de sangre del cordón umbilical con Hanks equilibrada solución de sal (HBSS) a una concentración de 1:1.
    5. Ensayo de preparar radio-inmuno precipitación (RIPA) el tampón utilizando cloruro de sodio de 150 mM, 1% Tritón X-100, desoxicolato de sodio 0,5%, glicerofosfato-β de 1 mM, 0.1% SDS y 50 mM Tris (pH 8.0).
  2. Aislamiento de células endoteliales progenitoras.
    1. Caliente todo preparado reactivos en un baño de agua mantenida a 37 ° C antes de la aislamiento.
    2. Añadir 20 mL de reactivo medio gradiente de densidad a un tubo de centrífuga de 50 mL.
    3. Capa cuidadosamente 20 mL de sangre diluida en el tubo de centrífuga que contiene medio de gradiente de densidad sin romper esta capa con el objetivo de la pipeta hacia la pared lateral del tubo de.
    4. Separar los componentes de la sangre que se basa en sus densidades ( figura 1) por centrifugación a 800 x g durante 30 min a temperatura ambiente, con los frenos del rotor de la centrifugadora de. No molestar las capas diferentes.
    5. Quitar la capa de plasma por cuidadosamente pipeteo del tubo sin molestar a otra célula de la capa capas hasta que la punta es capaz de llegar a la multinacional (ver figura 1). Descartar el plasma quitado.
      Nota: Al usar puntas de pipeta para remover el plasma, dejar una pequeña capa de plasma por encima de la capa MNC ( figura 1) para reducir disturbios.
    6. Recoger la capa anteada que contiene el MNCs utilizando una jeringa equipada a una aguja de calibre 18 y transferirlo a un tubo de centrífuga fresco.
    7. Añadir un volumen igual de EBM a recogidos MNCs. Centrifugar estos tubos a 500 x g por 10 min a 4 ° C. descarte el sobrenadante.
      Nota: El precipitado de células aparecerán en rojo debido a la presencia de glóbulos rojos/eritrocitos.
    8. Añadir 5 mL de solución de cloruro de amonio para lisar los glóbulos rojos. Incubar este tubo en hielo durante 5-10 min., con ocasional agitación.
      Nota: Debe tener precaución durante este paso para no exceder la duración del tiempo, como puede ser perjudicial para las empresas multinacionales.
    9. Centrifugar los tubos a 500 x g por 10 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Si los eritrocitos persisten, repita los pasos 1.2.8 y 1.2.9 hasta que no hay color rojo se observa en el sedimento.
    10. Resuspender el precipitado en EGM preparado y utilizar el hemocitómetro para contar las MNCs.
    11. Aspirada la rata cola placa de 6 pozos recubiertas de colágeno (de paso 1.1.3) y lavar los pocillos 3 veces con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    12. De semilla de la pelotilla MNC resuspendió en EGM a la placa de colágeno en una concentración de 1 x 10 7 multinacionales en cada pozo. Colocar en el 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
    13. Después de 24 h, el medio de aspirar y lavar los pozos una vez con EGM. Añadir 3 mL de medio EGM a cada pocillo y colocar en los 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
    14. Reponer la placa con medio EGM fresco cada día por 7 días. Después de 7 días, cambiar el medio EGM día.
    15. Utilizando un microscopio de campo brillante, tomar imágenes de la placa de la pozo 6 todos los días para seguir la progresión de las colonias de células endoteliales. Marcar la placa donde las colonias se presentan para hacer un seguimiento de su crecimiento.
      Nota: Toma generalmente entre 5 y 9 días para las colonias que aparecen en la cultura.
  3. Expansión de las células progenitoras endoteliales.
    1. Capa el frasco de cultura T-25 con rata cola colágeno (50 μg/mL) y colóquelo en el 37 ° C, 5% CO 2 incubadora durante al menos 60 min aspirar y lavar el matraz de cultivo celular T-25 tres veces con PBS 1 x antes de la siembra de las células.
    2. Trypsinize las colonias de células endoteliales cuando llegan a unos 3 mm de tamaño con 150 μL de solución de tripsina-EDTA 0,05% en cada pozo. Coloque la placa de 6 pozos en el 37 ° C, 5% CO 2 incubadora 2-3 min
    3. Golpee suavemente la placa de 6 pozos para desalojar las células adjuntas. Inmediatamente Añada 2 mL de EGM y recuperar las células en un tubo de centrífuga de 15 mL.
    4. Contar las células usando un hemocitómetro y calcular la densidad de siembra inicial.
      5. Tubos de
    5. girar la centrífuga de 15 mL a 400 x g por 5 min Resuspender el precipitado de células en el EGM y el matraz T-25 ~ 500.000 células de semilla. Marque este matraz como paso 1 y volver a colocar el frasco T-25 en los 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
      Nota: Las células se pueden platear en EBM y DMEM al comparar el crecimiento con EGM.
    6. De otros pasajes, cuando el frasco alcanza el 90% de confluencia, siga pasos 1.3.1 - 1.3.5 y contaminar las células en 10 4 células/cm 2 en frascos de cultivo celular T-75 o T-175. Proceder a la caracterización de las células aisladas (pasos 2 y 3).

2. Caracterización de aislados células usando Western Blotting

  1. Agregar 50-100 μl de lysis buffer en cada paso cuando siguiendo los pasos de expansión para caracterizar las células aisladas. Recoger las proteínas de la aproximadamente 500.000 o más células.
  2. Pipetear arriba y abajo con fuerza para romper las células y liberar las proteínas. Recoger y trasladar el buffer a un tubo de microcentrífuga.
  3. Girar el tubo de microcentrífuga a 500 x g y transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga. Etiquetar y almacenar los tubos a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo.
  4. Cuantificar la cantidad de proteínas en cada tubo, utilizando ya sea Bradford ' s o BCA ensayo 27 , 28 , 29.
  5. Realizar Western Blot utilizando procedimientos estándar 27 , 28 , 29. Analizar 5 μg de la proteína total de la expresión de CD31, CD34, VEGFR2 y α-SMA. Uso de α-tubulina para normalizar los datos.

3. Inmunofluorescencia indirecta

  1. someter a ultrasonidos cubreobjetos vidrio 18 mm en etanol al 50% y secar. Deja el cubreobjetos limpios en una placa de 12 pozos durante la noche en la campana de bioseguridad con un UV luz a esterilizarlas.
  2. Cubrir el cubreobjetos con 50 & #181; g/mL de rata cola colágeno y transferir la placa a 37 ° C, 5% CO 2 incubadora durante al menos 60 min
  3. Aspire el colágeno y añadir 1 mL de PBS 1 x a la placa de 12 pozos para lavar los cubreobjetos. Aspire el PBS 1 x y repetir dos veces.
  4. 250.000 semillas cultivadas EPCs en cada pozo y lugar nuevamente en el 37 ° C, 5% CO 2 incubadora durante al menos 3 días antes de realizar el immunostaining.
  5. Lavar la placa 3 veces con PBS 1 x. Añadir 1 mL de metanol helada en cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos reparar las células.
  6. Realizar immunostaining usando un protocolo estándar 27 , 28 , 29. Uso de los anticuerpos en sus diluciones apropiadas (por ejemplo, CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1: 100) y VEGFR2 (1:50)).
  7. Tomar imágenes de los cubreobjetos immunostained con un microscopio de epifluorescencia.

Resultados

Aislamiento y expansión de las células progenitoras endoteliales:
Se proporciona un esquema (figura 1) que representa el protocolo general. Las capas de componentes diferentes de la sangre fueron observadas después de la centrifugación de gradiente de densidad de la sangre de cordón umbilical humano con medio de gradiente de densidad. Sobre siembra multinacionales sobre las placas tratadas con colágeno, el fruto de las colonias primero fue observado entre los días 5 y 7 (figura 2A). Estas colonias continuaron creciendo y tenían una morfología de células fusiformes (figura 2A-2D) en las primeras etapas, que progresó más adelante a una guijarro-como morfología (figura 2E-2F). Figura 3 A muestra el número total de células frente al tiempo en la cultura, y cada punto de datos representa el número de células cosechadas en cada paso. Figura 3 B representa el tiempo promedio para que la primera colonia para presentarse en la placa de la pozo 6 tratados con colágeno después de la siembra de las multinacionales.

Caracterización mediante Western Blot:
Figura 4 Al representante se muestran resultados del Western blot membrana que fue probada contra los anticuerpos distintos. Nuestros resultados sugieren que las células eran positivas para CD31 y CD34. La expresión de CD31 (figura 4B) y CD34 (figura 4C) parece disminuir en pasajes posteriores, mientras que VEGFR2 (figura 4D) se expresó igualmente en pasajes posteriores, con la primera paso de tener la más alta expresión. También observamos que la EPC no expresaron el marcador de células mesenquimales α-SMA (figura 4E). Las células endoteliales (HUVEC) de la vena umbilical humana y lysates de la célula de células intersticiales valvulares (VIC) se utilizaron como controles positivos y negativos, respectivamente. HUVECs conocen para expresar CD31, CD34 y VEGFR2, mientras VICs expresan a α-SMA.

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Figura 1 : Esquema de aislamiento EPC. Inicio el aislamiento cable diluyendo la sangre con HBSS y capas con cuidado sobre el medio de gradiente de densidad, como se muestra. La centrifugación de gradiente de densidad de la sangre en capas se realiza para obtener capas distintas de la sangre, que se compone de corporaciones multinacionales (buffy coat), medio de gradiente de densidad, granulocitos y eritrocitos. La imagen subconjunto muestra estas diferentes capas. Empresas multinacionales se recogen y se resembraron en una placa de cultivo celular tratados con colágeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2 . Progresión de la Colonia celular. (A-E) Imágenes representativas del campo brillante de la progresión de la Colonia EPC con el tiempo. Tenga en cuenta que la Colonia tiene células fusiformes en las primeras etapas, adoptando la morfología de adoquines. (E) imagen representativa de EPC cultivada en un frasco de T-75 en el paso 3. Barra de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Las curvas de crecimiento de EPCs. (A) la gráfica representa el número de células de crecimiento durante un período de tiempo, y cada uno de los puntos de datos indica la celda número cosechada durante cada paso (P0 - P10) (n = 4). (B) tiempo para la primera colonia EPC para aparecer en la placa de la pozo 6 (n = 4). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). No significación estadística fue encontrada usando ANOVA unidireccional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4 : Borrar occidental. Membrana de Western blot (A) teñida con distintos anticuerpos. HUVEC lisado y VIC lisado fueron utilizados como controles positivos. (B) intensidad media de CD31 bandas normalizadas con α-tubulina. Intensidad media (C) de CD34 bandas normalizadas con α-tubulina. Intensidad media (D) de VEGFR2 bandas normalizadas con α-tubulina. Intensidad media (E) de α-SMA bandas normalizadas con α-tubulina (n = 3-6). Las barras de error denotan la SEM. No significación estadística fue encontrada usando ANOVA unidireccional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Immunostaining. Imágenes representativas de EPC cultivada en EGM para 7 días y immunostained en varios pasajes para CD31, CD34, VEGFR2 y α-SMA. Escala de la barra - 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Suplementario Figura 1: El gráfico muestra el número de células por unidad de área durante un período de 7 días cuando cultivadas en DMEM, EGM y EBM. EGM mostró un mayor crecimiento de la célula en comparación con los medios de comunicación (EBM y DMEM). Los datos mostraron significación estadística, con p < 0.01, utilizando ANOVA unidireccional (n = 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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/ > Suplementario Figura 2: imágenes representativas de EPC cultivada en EBM para 7 días y immunostained para CD31, CD34, VEGFR2 y α-SMA. Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Suplementario Figura 3: Imágenes representativas de EPC cultivada en DMEM para 7 días y immunostained para CD31, CD34, VEGFR2 y α-SMA. Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Como se mencionó anteriormente, adherente EPCs poseen una morfología de adoquines. Nuestras multinacionales aisladas progresaban de una colonia de células fusiformes (figura 2A-2D) en las primeras etapas a una colonia de adoquines (figura 2E-2F) durante un período de diez días en la cultura. EPC ha sido etiquetados como diferentemente por diferentes grupos de investigación, es decir, como10finales de la de las células progenitoras endoteliales, endoteliales formadoras de las células5, o de células progenitoras endoteliales12. Debe señalarse que estas células son funcionalmente iguales y expresan marcadores de superficie celular similar. El número de células observadas durante el período de cultivo (figura 3) aumentado a casi 108 células, análogas a las anteriores publicaciones y típicas del alto potencial proliferativo de EPCs3,5. De hecho, se encontró que EPCs obtienen de sangre de cordón umbilical humano demostrada una alta proliferativa potencial y demostró varios población doblajes antes de someterse a senescencia comparada con EPCs aislados de sangre periférica humana adulto5 , 10.

Los Western Blot resultados (figura 4A) demostraron la presencia de VEGFR2, CD31 y CD34 en los lysates de la célula de EPCs en comparación con el control positivo, HUVEC. HUVECs expresan CD31, CD34 y VEGFR2 y activado VIC expresa α-sSMA. Similar a anteriores informes10,18, disminución de la expresión de CD31 con pasajes más. El patrón de expresión también fue similar en el caso de CD34 y VEGFR2, donde tanto los marcadores se expresaron fuertemente en el primer paso y en cantidades relativamente menores pero igual en pasajes posteriores. Esta información muestra una tendencia que está de acuerdo con los resultados de grupos anteriores, en que protocolos basados en immunosorting fueron utilizados para aislar de Ingenierías derivadas de sangre de cordón12. En general, EPCs no expresan marcadores mesenquimales y, para comprobar que las células aisladas no eran mesenquimales en la naturaleza, immunolabeled nuestras membranas de Western blot con α-SMA. Nuestros resultados muestran claramente que no había ninguna expresión de α-SMA en el EPC cultivada en comparación con los lysates de la célula del control positivo de VICs, que exhiben fuerte expresión de α-SMA anticuerpo.

Para demostrar que EGM permite la proliferación creciente de la célula en comparación con otros medios de cultivo utilizados para EPCs, cultivan las células en tres diferentes tipos de medios: DMEM, EBM y EGM (es decir, EBM suplementado con factores de crecimiento, como se indica anteriormente). Todos fueron suplementados con 10% FBS. Hemos sembrado células de diferentes pasajes en cada pocillo de una placa de 12 pozos. Complementaria la figura 1 muestra el número de células por unidad de área en cada pozo con el tiempo en la cultura en las formulaciones de diferentes medios de comunicación. Observamos que la EPC cultivadas en EGM mostraron un aumento constante en el número de células y células en EBM, hubo una tasa más lenta de aumento en el número de células durante los tres primeros días, posteriormente plateaued. Esto sugiere que la EPC todavía podría sobrevivir en EBM, pero la ausencia de factores de crecimiento impide la proliferación. También observamos que EPC cultivadas en disminución DMEM en número, lo que sugiere que esta formulación particular del medio no es adecuada para su supervivencia o la proliferación. Nuestros datos de inmunotinción muestran que la EPC cultivadas en EGM (figura 5) expresa CD31 más en comparación con EPC cultivada en EBM (suplementario Figura 2) y DMEM (suplementario Figura 3). Comparando la figura 5 con suplementario Figura 2 y figura 3 complementaria, puede verse que las células no fueron contaminadas con otros tipos celulares. También, al comparar el immunostained EPCs (figura 5), podemos cualitativamente afirmar que la expresión de CD31 y CD34 redujo sobre pasos superiores, nuestros datos de Western blot (figura 4).

Para reiterar, el objetivo principal de nuestro protocolo propuesto es demostrar que uno puede aislar las células progenitoras endoteliales por cultivo sangre multinacionales en medios selectivos especializados. Se trata de mostrar que EPC se puede aislar sin sofisticados equipos y procedimientos, a diferencia de otros métodos que implican el uso de citometría de flujo - inmediatamente después de MNC aislamiento1,3,20 , 30 o después de las colonias se han convertido en una monocapa - replating4,10,12,13,23. Las colonias EPC suelen aparecerán entre los días 5 y 9. Así, nuestro método es un método más rápido y más costo-eficiente para aislar EPCs. La principal limitación de esta técnica es que disminuye la expresión de CD31 y CD34 con pasajes posteriores, que podrían sugerir que las células pierden su fenotipo progenitor. Por lo tanto, se recomienda que uno debe usar las células obtenidas del paso 5 o inferior para llevar a cabo experimentos si usando este protocolo.

Después de la centrifugación de densidad deben tomarse precauciones para no perturbar las diferentes capas cuando toma los tubos de centrifugado en la campana y al retirar el plasma. Otro paso fundamental pertenece a la lisis de eritrocitos, donde un tiempo de incubación podría dañar potencialmente el MNC. Por lo tanto conviene no repetir más de dos veces. De hecho, ya que la aspiración del medio se lleva a cabo 24 h después de la galjanoplastia, trazas de los eritrocitos se eliminan, como son no adherente. Sustratos alternativos, como la fibronectina o la gelatina, mientras no probado por nosotros, pueden usarse según los protocolos específicos para la creación de células capas de cultura. Empleando la menor modificación en los pasos iniciales, los investigadores pueden aislar de EPCs no adherente30.

En conclusión, hemos reportado un método de aislamiento de EPCs de sangre del cordón umbilical. Es importante tener en cuenta que la EPC no expresa marcadores como el α-SMA, lo que sugiere que no son células mesenquimales. De hecho, α-SMA sirve como un marcador importante cuando se trata de estudiar la transición endotelio-mesénquima (endo-MT) de EPCs. Endo-MT es un proceso de transdiferenciación celular durante el cual las células endoteliales son conocidas para perder sus marcadores específicos y transformar a un fenotipo de células mesenquimales como. Se ha demostrado que EPCs pueden someterse a esta transición en la presencia de transformación del crecimiento factor-β7 y pueden liberar proteínas de la membrana extracelular en sus andamios tejido-dirigida8. Todas estas observaciones indican la promesa de EPCs para uso como fuente de células autólogas para crear una válvula cardiaca u otras construcciones de ingeniería de tejido Cardiovasculars.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este material está basado en trabajo apoyado por la National Science Foundation bajo la subvención no. CMMI-1452943 y por el Colegio de honores de la Universidad de Arkansas. También quisiéramos reconocer el Banco de sangre de cordón de Arkansas por facilitarnos con unidades de sangre de cordón.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
A) Para aislamiento y cultivo
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162Este producto viene con todos los factores de crecimiento necesarios para hacer el Medio de Crecimiento Endotelial Suero
Bovino FetalThermofisher Scientific 26140079
Pencillin-Estreptomicina-Glutamina (100x)Thermofisher Scientific10378016
Ficoll-PaqueGE Heatlhcare17-1440-02
Solución salina equilibrada de HankThermofisher Scientific14170-112
Tecnologías de células madrede cloruro de amonio7850
1x tampón de fosfato solución salinaThermofisher Scientific14190250
Cola de rata I ColágenoCorning354236
Ácido Acético GlacialAmresco0714-500ML
0.05% Tripsina-EDTAThermofisher Scientific 25300054
Tampón HEPESThermofisher Scientific15630080
Medio de águila modificado de DulbeccoThermofisher Scientific10566-016
B) Anticuerpos y lisados celulares
CD31 Abcamab28364dilución 1:250  para Western blot
CD34Santa Cruz Biotechnologysc-70451:100 dilución para Western blot
α-SMAabcamab5694dilución 1:100 para Western blot
α-tubulinaabcam ab7291dilución 1:2.500 para Western blot
VEGFR2abcamsc504dilución 1:100 para Western blot
Lisado de células endoteliales de vena umbilical humanaSanta Cruz Biotechnologysc24709 
células intersticiales valvularLínea celular primaria cultivada en laboratorio propio y lisada con tampón RIPA
C) Western blot e inmunotinción
10x Tampón Tris/Glicina/SDSBiorad161-0772Utilizado como tampón de ejecución
10x Tampón Tris/GlycineBiorad161-0771Utilizado como tampón de transferencia
Membrana de transferencia Immobilon-FLMerck MilliporeIPFL0010Se trata de una membrana de transferencia de PVDF que tiene 45 µ m tamaño de poro y se menciona en el protocolo como membrana de Western blot
4x Tampón de muestra LaemmliBiorad161-0747
2-mercaptoetanolBiorad161-0710
10% Criterion TGX gel prefabricadoBiorad 5671033
Prolong Gold antidecoloraciónThermofisher ScientificP36930Se utiliza para el montaje de cubreobjetos inmunoteñidos para el almacenamiento a largo plazo
MetanolVWR AnalíticoBDH1135-4LP
Lisado de

Referencias

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