Aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón Umbilical humano

Resumen

El objetivo de este protocolo es aislar las células progenitoras endoteliales de cordón umbilical. Algunas de las aplicaciones incluyen el uso de estas células como un biomarcador para identificar pacientes con riesgo cardiovascular, tratamiento de enfermedades isquémicas, y construye creando ingeniería de tejido vascular y del corazón la válvula.

Resumen

La existencia de células progenitoras endoteliales (EPCs) en sangre periférica y su implicación en la vasculogénesis primero fue divulgado por Ashara y colegas¹. Más tarde, otros documentaron la existencia de tipos similares de EPCs procedentes de médula ósea^2,3. Más recientemente, Yoder y Ingram demostró que EPCs derivan de la sangre del cordón umbilical tenían un potencial proliferativo más alto en comparación con los aislados de adulto periférico sangre^4,5,6. Aparte de estar involucrado en la vasculogénesis posnatal, EPCs también han demostrado promesa como fuente de células para crear ingeniería de tejido vascular y del corazón la válvula construcciones^7,8. Existen varios protocolos de aislamiento, algunas de las cuales implican la clasificación de la célula de células mononucleares (MNCs) derivadas de las fuentes mencionadas anteriormente con la ayuda de marcadores endoteliales y hematopoyéticas, o cultivo de estas multinacionales especializados crecimiento endotelial medio, o una combinación de estas técnicas⁹. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y cultura de EPCs usando especializado endotelial suplementado con factores de crecimiento, sin el uso de immunosorting, seguido de la caracterización de las células aisladas mediante Western Blot y immunostaining.

Introducción

Varios investigadores han estudiado las características y el potencial de humano EPCs^{5,10,11,12,13}. EPCs pueden describirse como la circulación de las células que tienen la capacidad de adherirse al tejido endotelial en sitios de hipoxia, isquemia, lesiones o la formación del tumor y contribuir a la formación de nuevas estructuras vasculares^4,14. Su participación observado en neovascularización, en forma de vasculogénesis posnatal, ha conducido a una comprensión de la patofisiología de estas células y su uso en aplicaciones terapéuticas^{4,15, 16}. el número de EPC en un individuo se ha demostrado para ser correlacionado con patología cardiovascular^{9,15,16,17,18,19 ,20}. Otros estudios han también diferenciado EPCs en un fenotipo de fibroblasto-como de la válvula y que estas células podrían utilizarse para ingeniería de tejidos corazón válvulas^7,21.

Las moléculas de superficie celular particular necesarias aislar a EPCs no han sido claramente identificadas debido a las discrepancias entre las investigaciones⁴. La adhesión de las empresas multinacionales a una matriz, con la exposición a una variedad de condiciones de cultivo, se ha realizado por varios grupos^1,17,22,23, sugiriendo que EPCs putativos puede Mostrar diferentes propiedades fenotípicas. Estas propiedades incluyen la falta de capacidad phagocytotic, formación del tubo en Matrigel y la captación de lipoproteínas de baja densidad Dil-acetilado. El potencial proliferativo y clonogenic alta son dos propiedades con que EPC puede ser jerarquizada⁵. EPCs pueden también formar en vitro de túbulos cuando morfología de fibroblastos de pulmón fetal humano⁴. Se conocen estas células expresan marcadores de superficie celular endotelial y compartir algunos de los marcadores hematopoyéticos^13,24,25. Los marcadores expresados positivamente que son ampliamente aceptados para EPCs phenotyping son CD31, CD34, receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 (VEGFR2), von Willebrand Factor (FvW), CD133, c-Kit y vascular endotelial cadherina (VE-cadherina)^{4 , 18}. las células que expresan Co CD90, CD45, CD14, CD115 o actinia alfa-lisa del músculo (α-SMA) no se consideran ser EPC debido a su limitada proliferativa potencial, capacidad de fagocitar bacterias e incapacidad para formar de nuevo humano vasos en vivo^4,7. Este artículo describe un protocolo modificado para el aislamiento de las células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón umbilical humano sin necesidad de cualquier célula clasificación de protocolos. Para este artículo, utilizamos CD31, CD34 y VEGFR2 como los marcadores positivos, con α-SMA como el indicador negativo.

En este artículo, proponemos un método de aislamiento y cultivo de células endoteliales progenitoras de sangre del cordón umbilical sin clasificar usando la célula especializada medio crecimiento endotelial suplementado con factores de crecimiento (EGM). Este EGM contiene factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento fibroblástico (FGF), que mejoran la supervivencia, proliferación y migración de células endoteliales²⁶. También incluye el ácido ascórbico, que es responsable de mantener la morfología de adoquines de células; insulina-como factor de crecimiento-1 (IGF-1), que proporciona angiogénicos y función migratoria; y heparina, la cual causa mayor estabilidad a largo plazo de factores de crecimiento en el medio²⁶. Otros factores de crecimiento añadidos al medio de cultivo de células endoteliales incluye la suplementación con factor de crecimiento epidérmico (EGF), que ayuda a estimular la proliferación celular y la diferenciación y la hidrocortisona, que sensibiliza las células al EGF²⁶ . Nos muestran que el uso de este medio de crecimiento produce un número mayor de EPCs en comparación con medio basal endotelial (EBM) o modificado Eagle Medium (DMEM de Dulbecco).

Protocolo

esta investigación se llevó a cabo con la aprobación de la Universidad de Arkansas Junta de revisión institucional (número 16-04-722). Unidades de sangre de cordón umbilical fueron recolectadas en solución citrato fosfato dextrosa (CPD) en el Banco de sangre de cordón de Arkansas, y unidades que no cumplían con el requisito de almacenamiento fueron donadas para la investigación. Unidades de sangre de cordón fueron por servicio Courier al laboratorio dentro de 24 h de colección en las temperaturas ambiente.

1. aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre del cordón

1. preparación de los reactivos.
   1. EGM preparar añadiendo medio basal endotelial (EBM) al 10% de suero bovino fetal (FBS) suplementado con 20 ng/mL de insulina-like growth factor (IGF), 1 μg/mL de ácido ascórbico, 5 ng/mL recombinante humana factor de crecimiento (rhEGF), 22,5 μg/mL heparina y 0,5 ng/mL factor crecimiento endotelial vascular (VEGF), junto con 10 ng/mL de factor de crecimiento fibroblasto humano recombinante B (rhFGF-B), hidrocortisona μg/mL 0,2 y 2% penicilina-estreptomicina-glutamina. Esterilizar el medio de cultivo utilizando un filtro de vacío de membrana de polyethersulfone (PES) de 0.2 μm.
   2. Preparar rata I cola solución de colágeno en una concentración de 50 μg/mL 0.02 N acético ácido. Esterilizar esta solución con un filtro de jeringa de 0,2 μm.
   3. La capa bien 6 placas con 2 mL de preparado rata I cola solución colágeno para cada pozo. Colocarlos en una incubadora mantenida en 5% CO ₂ y 37 ° C durante al menos 1 h antes de sembrar.
   4. Diluir aproximadamente 25 mL de sangre del cordón umbilical con Hanks equilibrada solución de sal (HBSS) a una concentración de 1:1.
   5. Ensayo de preparar radio-inmuno precipitación (RIPA) el tampón utilizando cloruro de sodio de 150 mM, 1% Tritón X-100, desoxicolato de sodio 0,5%, glicerofosfato-β de 1 mM, 0.1% SDS y 50 mM Tris (pH 8.0).
2. Aislamiento de células endoteliales progenitoras.
   1. Caliente todo preparado reactivos en un baño de agua mantenida a 37 ° C antes de la aislamiento.
   2. Añadir 20 mL de reactivo medio gradiente de densidad a un tubo de centrífuga de 50 mL.
   3. Capa cuidadosamente 20 mL de sangre diluida en el tubo de centrífuga que contiene medio de gradiente de densidad sin romper esta capa con el objetivo de la pipeta hacia la pared lateral del tubo de.
   4. Separar los componentes de la sangre que se basa en sus densidades ( figura 1) por centrifugación a 800 x g durante 30 min a temperatura ambiente, con los frenos del rotor de la centrifugadora de. No molestar las capas diferentes.
   5. Quitar la capa de plasma por cuidadosamente pipeteo del tubo sin molestar a otra célula de la capa capas hasta que la punta es capaz de llegar a la multinacional (ver figura 1). Descartar el plasma quitado.
      Nota: Al usar puntas de pipeta para remover el plasma, dejar una pequeña capa de plasma por encima de la capa MNC ( figura 1) para reducir disturbios.
   6. Recoger la capa anteada que contiene el MNCs utilizando una jeringa equipada a una aguja de calibre 18 y transferirlo a un tubo de centrífuga fresco.
   7. Añadir un volumen igual de EBM a recogidos MNCs. Centrifugar estos tubos a 500 x g por 10 min a 4 ° C. descarte el sobrenadante.
      Nota: El precipitado de células aparecerán en rojo debido a la presencia de glóbulos rojos/eritrocitos.
   8. Añadir 5 mL de solución de cloruro de amonio para lisar los glóbulos rojos. Incubar este tubo en hielo durante 5-10 min., con ocasional agitación.
      Nota: Debe tener precaución durante este paso para no exceder la duración del tiempo, como puede ser perjudicial para las empresas multinacionales.
   9. Centrifugar los tubos a 500 x g por 10 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Si los eritrocitos persisten, repita los pasos 1.2.8 y 1.2.9 hasta que no hay color rojo se observa en el sedimento.
   10. Resuspender el precipitado en EGM preparado y utilizar el hemocitómetro para contar las MNCs.
   11. Aspirada la rata cola placa de 6 pozos recubiertas de colágeno (de paso 1.1.3) y lavar los pocillos 3 veces con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   12. De semilla de la pelotilla MNC resuspendió en EGM a la placa de colágeno en una concentración de 1 x 10 ⁷ multinacionales en cada pozo. Colocar en el 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora.
   13. Después de 24 h, el medio de aspirar y lavar los pozos una vez con EGM. Añadir 3 mL de medio EGM a cada pocillo y colocar en los 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora.
   14. Reponer la placa con medio EGM fresco cada día por 7 días. Después de 7 días, cambiar el medio EGM día.
   15. Utilizando un microscopio de campo brillante, tomar imágenes de la placa de la pozo 6 todos los días para seguir la progresión de las colonias de células endoteliales. Marcar la placa donde las colonias se presentan para hacer un seguimiento de su crecimiento.
       Nota: Toma generalmente entre 5 y 9 días para las colonias que aparecen en la cultura.
3. Expansión de las células progenitoras endoteliales.
   1. Capa el frasco de cultura T-25 con rata cola colágeno (50 μg/mL) y colóquelo en el 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora durante al menos 60 min aspirar y lavar el matraz de cultivo celular T-25 tres veces con PBS 1 x antes de la siembra de las células.
   2. Trypsinize las colonias de células endoteliales cuando llegan a unos 3 mm de tamaño con 150 μL de solución de tripsina-EDTA 0,05% en cada pozo. Coloque la placa de 6 pozos en el 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora 2-3 min
   3. Golpee suavemente la placa de 6 pozos para desalojar las células adjuntas. Inmediatamente Añada 2 mL de EGM y recuperar las células en un tubo de centrífuga de 15 mL.
   4. Contar las células usando un hemocitómetro y calcular la densidad de siembra inicial.
   Tubos de
   5. girar la centrífuga de 15 mL a 400 x g por 5 min Resuspender el precipitado de células en el EGM y el matraz T-25 ~ 500.000 células de semilla. Marque este matraz como paso 1 y volver a colocar el frasco T-25 en los 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora.
      Nota: Las células se pueden platear en EBM y DMEM al comparar el crecimiento con EGM.
   6. De otros pasajes, cuando el frasco alcanza el 90% de confluencia, siga pasos 1.3.1 - 1.3.5 y contaminar las células en 10 ⁴ células/cm ² en frascos de cultivo celular T-75 o T-175. Proceder a la caracterización de las células aisladas (pasos 2 y 3).

2. Caracterización de aislados células usando Western Blotting

1. Agregar 50-100 μl de lysis buffer en cada paso cuando siguiendo los pasos de expansión para caracterizar las células aisladas. Recoger las proteínas de la aproximadamente 500.000 o más células.
2. Pipetear arriba y abajo con fuerza para romper las células y liberar las proteínas. Recoger y trasladar el buffer a un tubo de microcentrífuga.
3. Girar el tubo de microcentrífuga a 500 x g y transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga. Etiquetar y almacenar los tubos a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo.
4. Cuantificar la cantidad de proteínas en cada tubo, utilizando ya sea Bradford ' s o BCA ensayo ^{27 , 28 , 29}.
5. Realizar Western Blot utilizando procedimientos estándar ^{27 , 28 , 29}. Analizar 5 μg de la proteína total de la expresión de CD31, CD34, VEGFR2 y α-SMA. Uso de α-tubulina para normalizar los datos.

3. Inmunofluorescencia indirecta

1. someter a ultrasonidos cubreobjetos vidrio 18 mm en etanol al 50% y secar. Deja el cubreobjetos limpios en una placa de 12 pozos durante la noche en la campana de bioseguridad con un UV luz a esterilizarlas.
2. Cubrir el cubreobjetos con 50 & #181; g/mL de rata cola colágeno y transferir la placa a 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora durante al menos 60 min
3. Aspire el colágeno y añadir 1 mL de PBS 1 x a la placa de 12 pozos para lavar los cubreobjetos. Aspire el PBS 1 x y repetir dos veces.
4. 250.000 semillas cultivadas EPCs en cada pozo y lugar nuevamente en el 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora durante al menos 3 días antes de realizar el immunostaining.
5. Lavar la placa 3 veces con PBS 1 x. Añadir 1 mL de metanol helada en cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos reparar las células.
6. Realizar immunostaining usando un protocolo estándar ^{27 , 28 , 29}. Uso de los anticuerpos en sus diluciones apropiadas (por ejemplo, CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1: 100) y VEGFR2 (1:50)).
7. Tomar imágenes de los cubreobjetos immunostained con un microscopio de epifluorescencia.

Resultados

Aislamiento y expansión de las células progenitoras endoteliales:
Se proporciona un esquema (figura 1) que representa el protocolo general. Las capas de componentes diferentes de la sangre fueron observadas después de la centrifugación de gradiente de densidad de la sangre de cordón umbilical humano con medio de gradiente de densidad. Sobre siembra multinacionales sobre las placas tratadas con colágeno, el fruto de las colonias primero fue...

Discusión

Como se mencionó anteriormente, adherente EPCs poseen una morfología de adoquines. Nuestras multinacionales aisladas progresaban de una colonia de células fusiformes (figura 2A-2D) en las primeras etapas a una colonia de adoquines (figura 2E-2F) durante un período de diez días en la cultura. EPC ha sido etiquetados como diferentemente por diferentes grupos de investigación, es decir, como¹⁰finales de la d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
A) Para aislamiento y cultivo
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	Este producto viene con todos los factores de crecimiento necesarios para hacer el Medio de Crecimiento Endotelial Suero
Bovino Fetal	Thermofisher Scientific 26140079
Pencillin-Estreptomicina-Glutamina (100x)	Thermofisher Scientific	10378016
Ficoll-Paque	GE Heatlhcare	17-1440-02
Solución salina equilibrada de Hank	Thermofisher Scientific	14170-112
Tecnologías de células madre	de cloruro de amonio	7850
1x tampón de fosfato solución salina	Thermofisher Scientific	14190250
Cola de rata I Colágeno	Corning	354236
Ácido Acético Glacial	Amresco	0714-500ML
0.05% Tripsina-EDTA	Thermofisher Scientific 25300054
Tampón HEPES	Thermofisher Scientific	15630080
Medio de águila modificado de Dulbecco	Thermofisher Scientific	10566-016
B) Anticuerpos y lisados celulares
CD31	Abcam	ab28364	dilución 1:250  para Western blot
CD34	Santa Cruz Biotechnology	sc-7045	1:100 dilución para Western blot
α-SMA	abcam	ab5694	dilución 1:100 para Western blot
α-tubulina		abcam ab7291	dilución 1:2.500 para Western blot
VEGFR2	abcam	sc504	dilución 1:100 para Western blot
Lisado de células endoteliales de vena umbilical humana	Santa Cruz Biotechnology	sc24709
		células intersticiales valvular	Línea celular primaria cultivada en laboratorio propio y lisada con tampón RIPA
C) Western blot e inmunotinción
10x Tampón Tris/Glicina/SDS	Biorad	161-0772	Utilizado como tampón de ejecución
10x Tampón Tris/Glycine	Biorad	161-0771	Utilizado como tampón de transferencia
Membrana de transferencia Immobilon-FL	Merck Millipore	IPFL0010	Se trata de una membrana de transferencia de PVDF que tiene 45 µ m tamaño de poro y se menciona en el protocolo como membrana de Western blot
4x Tampón de muestra Laemmli	Biorad	161-0747
2-mercaptoetanol	Biorad	161-0710
10% Criterion TGX gel prefabricado	Biorad 5671033
Prolong Gold antidecoloración	Thermofisher Scientific	P36930	Se utiliza para el montaje de cubreobjetos inmunoteñidos para el almacenamiento a largo plazo
Metanol	VWR Analítico	BDH1135-4LP