Inmunohistoquímica Cuantitativa del Microambiente Celular en Resecciones de Glioblastoma Paciente

Resumen

Este protocolo fue desarrollado para identificar cuantitativamente los componentes del microambiente tumoral en resecciones de pacientes con glioblastoma usando inmunohistoquímica cromogénica e ImageJ.

Resumen

Con el creciente interés en el microambiente tumoral, nos propusimos desarrollar un método para determinar específicamente los componentes del microambiente dentro de muestras de pacientes de glioblastoma, el cáncer de cerebro más mortífero y más invasivo. No sólo son métodos cuantitativos beneficiosos para describir con precisión los tejidos enfermos, sino que también pueden contribuir a un pronóstico más preciso, el diagnóstico y el desarrollo de sistemas de ingeniería de tejidos y reemplazos. En el glioblastoma, las células gliales, tales como microglia y astrocitos, se han correlacionado independientemente con un mal pronóstico basado en la clasificación de patólogos. Sin embargo, el estado de estas células y otros componentes de las células gliales no ha sido bien descrito cuantitativamente. Esto puede ser difícil debido a los grandes procesos que marcan estas células gliales. Además, la mayoría de los análisis histológicos se centran en la muestra de tejido total o sólo dentro de la mayor parte del tumor, en lugar de delinear cuantificaciones basadas en regiones conHin el tejido altamente heterogéneo. Aquí, describimos un método para identificar y analizar cuantitativamente las poblaciones de células gliales dentro de la masa tumoral y regiones adyacentes de resecciones tumorales de pacientes con glioblastoma. Se utilizó inmunohistoquímica cromogénica para identificar las poblaciones de células gliales en resecciones tumorales de pacientes y ImageJ para analizar el porcentaje de cobertura de tinción para cada población glial. Con estas técnicas podemos describir mejor las células gliales a través de las regiones del microambiente tumoral glioma.

Introducción

El glioblastoma (GBM), el cáncer de cerebro más común y maligno, se caracteriza por una invasión altamente difusa desde el tumor primario al parénquima cerebral sano circundante ^{1 , 2} . Esta invasión difusa hace que el tumor sea particularmente difícil de resecar completamente, y las células cancerosas invasoras que permanecen después de la terapia es la razón más común para la recurrencia inevitable ^{2 , 3 , 4} . Anteriormente, se encontró inhibir la invasión difusa de células de glioma de ser terapéuticamente benefic....

Protocolo

Este protocolo identifica los componentes celulares en las muestras fijadas con formalina fijadas en parafina (FFPE), como es típico para las muestras clínicas bancadas. La inclusión de parafina permite el mejor mantenimiento de la morfología celular y de los tejidos, así como una mejor longevidad de las secciones. Las muestras utilizadas para este análisis se accedieron a través de la Universidad de Virginia Biorepository y Tissue Research Facility. Las muestras de pacientes fueron seleccionadas por un neuropatólogo basado en un diagnóstico definitivo de glioblastoma (astrocitoma, grado IV de la OMS) que había completado resecciones tumorales en la Universidad de Vi....

Resultados

Para este análisis, se identificaron dos regiones de intereses dentro de nuestras resecciones tumorales - el tumor primario y las regiones adyacentes, principalmente compuestas de tejido sano con células difusas invasoras de cáncer ( Figura 1A , 1B ) - fueron identificadas por neuropatólogos colaboradores en hematoxilina y eosina Muestras. Dentro de cada muestra de pacientes, se identificó tinción positiva para astrocitos (

Discusión

Nuestro método propuesto aquí es un enfoque cuantitativo para analizar las muestras histológicas teñidas usando inmunohistoquímica cromogénica tradicional. La metodología actual para este tipo de análisis incluye protocolos de tinción similares seguidos de clasificación por patólogos independientes. Este método ha sido confiable, sin embargo, para una serie de aplicaciones, se requiere una comprensión más precisa del maquillaje celular, tal como una mejor comprensión de la heterogeneidad asociada con tumores y una recap.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Xileno	Fisher Chemical	X3P Etanol
Solución desenmascarante de antígenos de pH	alto Vector Labs	H-3301
TBS
Triton-X	Amresco	9002-93-1
Suero
Anti-ALDH1L1	abcam	ab56777
Anti-Iba1	abcam	ab5076
Proteína específica anti-oligodendrocitos1	abcam	ab53041
ImmPRESS anti-cabra	Vector Labs	MP-7405
ImmPRESS Universal (anti-ratón/conejo)	Vector Labs	MP-7500
Peróxido de hidrógeno	Sigma Aldrich	216763
ImmPACT Sustrato DAB	Vector Labs	SK-4105
Contratinción de hematoxilina	ThermoScientific	72404
Histochoice Medios de montaje	Amresco	H157-475
Aperio Scanscope	Leica Biosystems
Image Scanscope	Leica Biosystems
Super HT PAP	Pen Research Products International 195506