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Artículo de método

Análisis cinemático de la marcha de plano sagital en ratones C57BL/6 sometidos a MOG35-55 inducida por encefalomielitis Autoinmune Experimental

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DOI:

10.3791/56032

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4 de noviembre de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Pharmacology, Dalhousie University, 2Medical Neuroscience, Dalhousie University, 3Psychiatry, Dalhousie University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Análisis de la cinemática de la marcha en el plano sagital obtiene información muy precisa acerca de cómo se ejecuta el movimiento. Se describe la aplicación de estas técnicas para identificar los déficits de marcha para los ratones sometidos a desmielinización autoinmune mediada. Estos métodos pueden usarse para caracterizar los déficits de paso para otros modelos de ratón con locomoción deteriorada.

Resumen

Análisis de la cinemática de la marcha en el plano sagital se ha utilizado con frecuencia para caracterizar el déficit motor en esclerosis múltiple (EM). Se describe la aplicación de estas técnicas para identificar los déficits de la marcha en un modelo murino de MS, conocida como encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Déficit motor y parálisis en los ratones sometidos a EAE normalmente se evalúan mediante una escala de puntuación clínica. Sin embargo, esta escala da solamente los datos ordinales que proporciona poca información sobre la naturaleza precisa del déficit motor. Severidad de la enfermedad EAE también ha sido evaluado por rotarod rendimiento, que proporciona una medida de coordinación motora general. Por el contrario, el análisis cinemático de la marcha de las extremidades en el plano sagital genera información muy precisa acerca de cómo se deteriora el movimiento. Para realizar este procedimiento, se colocan marcadores reflectantes en un extremidades para detectar el movimiento articular mientras que un ratón es caminar en una caminadora. Software de análisis de movimiento se utiliza para medir el movimiento de los marcadores durante la marcha. Parámetros cinemáticos de la marcha luego se derivan de los datos resultantes. Mostramos cómo estos parámetros de marcha se pueden utilizar para cuantificar la alteración movimientos de las articulaciones cadera, rodilla y tobillo en EAE. Estas técnicas pueden utilizarse para mejor entender mecanismos de la enfermedad y para identificar potenciales tratamientos para la EM y otras enfermedades neurodegenerativas que afectan la movilidad.

Introducción

Andar es una serie de movimientos repetitivos de las extremidades que utilizan para alcanzar la locomoción. Marcha se compone de ciclos de paso, que se dividen en dos fases: la fase de apoyo, que es cuando el pie se mueve hacia atrás en el suelo para propulsar el cuerpo remite; y la fase de oscilación, donde el pie es de la tierra y movimiento remite. Disturbios de la marcha son seña de identidad de muchos trastornos neurodegenerativos, como la lesión de la médula espinal (SCI), esclerosis múltiple (EM), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson (EP) y accidente cerebrovascular; modelos preclínicos de roedores de estos trastornos a menudo recapitulan su marcha respectivas deficiencias1. Los mecanismos de control básico de la locomoción en ratones han sido intensamente estudiados2,3. Además, hay modelos de ratón de muchos trastornos neurológicos humanos4. Análisis de la marcha en ratones es un enfoque atractivo para medir múltiples aspectos del déficit motor que ha sabido correlatos anatómicos. El estudio de la marcha en modelos de ratón puede proporcionar penetraciones en las bases de neuropathological del déficit locomotor en trastornos neurodegenerativos y permitir la identificación de potenciales tratamientos.

Algunas técnicas que se han utilizado para medir el paso de roedores incluyen inspección visual (por ejemplo, el Basso ratón escala5 y prueba de campo abierto6) y análisis de la marcha de la ventral plano7. Más recientemente, métodos para medir el plano sagital cinemática de los movimientos del miembro posterior han ganado popularidad porque ofrecen más información sobre la ejecución del movimiento y por lo tanto son más sensibles a cambios sutiles en el paso8, 9 , 10 , 11. técnicas de cinemática para estudiar trasera movimiento en plano sagital mientras camina en una cinta de correr9,12 se han estudiado ampliamente en el contexto de SCI, ALS, lesiones traumáticas corticales, tiempos, y La enfermedad de Huntington8,9,10,11,13,14,15,16. Por el contrario, estas técnicas han visto uso limitado en el estudio del aparato locomotor déficit para los modelos de ratón de esclerosis múltiple17.

Encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el modelo de ratón más comúnmente utilizado de MS18. Los dos principales métodos de inducir EAE es a través de la inoculación activa o pasiva. En EAE activo, ratones están inmunizados con antígenos de la mielina, que causa neuroinflamación mediada por células T autorreactivas y desmielinización en la médula espinal y cerebelo. EAE pasivo, por el contrario, es inducida por transferencia de células autorreactivas T de un ratón con EAE activa a un ingenuo ratón19. Como se describe en otra parte, el curso de la enfermedad y la neuropatología son influenciados por los antígenos del sistema nervioso central (SNC) y ratón cepa20,21,22,23,24 ,25. En experimentos EAE, control de ratones se inyectan con completa adyuvante de Freund (CFA) sin los antígenos de la mielina. EAE se caracteriza por parálisis que comienza con la debilidad de la cola y puede potencialmente implicar los miembros anteriores, ascendente dando por resultado parálisis y ataxia20. Hemos caracterizado recientemente cambios en la marcha en ratones C57Bl/6 sometidos a glicoproteína del oligodendrocyte del myelin (MOG35-55) 35-55-inducida por EAE. Estos estudios han demostrado ser superior que el análisis del comportamiento clásico porque las desviaciones del movimiento normal de tobillo están altamente correlacionadas con el grado de pérdida de materia blanca en la médula espinal lumbar de EAE ratones26análisis de la marcha. Por el contrario, la fuerza de la correlación entre la pérdida de materia blanca y dos otros comportamiento medidas tradicionales (puntuación clínica y rotarod) era mucho más débil26.

Aquí describimos el uso del análisis cinemático de la marcha para detectar déficit de movimiento en el plano sagital de los ratones EAE caminando en una cinta rodante. Cinco marcadores reflectantes se colocaron en una trasera para identificar el movimiento de la cadera, rodilla y articulaciones de tobillo en grabaciones de vídeo de alta velocidad. Software de análisis de movimiento se utiliza para extraer datos cinemáticos sobre excursiones conjuntas. Se discuten la utilidad de estas técnicas para cuantificar el déficit de movimiento para el modelo de35-55 MOG de EAE. Estas técnicas también son aplicables al estudio de los déficits de andar en otros modelos murinos de enfermedades neurodegenerativas.

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Protocolo

este protocolo está de acuerdo con el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal y fue aprobado por el Comité de la Universidad de Dalhousie en animales de laboratorio.

1. construir marcadores reflectantes:

  1. utilizando una perforadora manual, perforar el número deseado de círculos pequeños de una hoja de papel reflectante. Cada animal requiere 5 marcadores para una única grabación; dos grandes y tres pequeños marcadores.
  2. Con unas tijeras finas, hacer un corte recto que se extiende desde el perímetro al centro del círculo.
  3. Retire el papel protector del marcador para revelar la superficie adhesiva. Con unas pinzas finas, sujete firmemente el marcador y enrularlo en sí mismo con el dedo para formar una forma de cono. Para hacer un pequeño marcador, enrollamiento firmemente el cono. Para hacer un marcador grande, enrollamiento del cono libremente.
  4. Usar una pistola de pegamento manual, rellenar el interior de la pistola en forma de cono con pegamento mientras que agarre la punta del cono con pinzas y adherir el marcador en una pieza plana de cartón. El pegamento evita que el marcador de contracción y flexión durante la grabación para asegurar una óptima reflexión de la luz. Cuando el pegamento esté seco (aproximadamente 10 min), saque el marcador de la cartulina con un bisturí ( figura 1A).

2. Preparar el Animal para la grabación de

  1. Anesthetize el ratón con gas isoflurano (2,5%; 2 litros/min O 2) colocando el ratón en una cámara de inducción. Una vez que el ratón está inconsciente, colóquelo en un cono de nariz colocado encima de una manta de calentamiento de agua recirculando. El propósito de la anestesia es inmovilizar el ratón para la colocación del marcador; el procedimiento no es doloroso. Por lo tanto, profundidad de la anestesia no necesita evaluarse.
  2. Aplicar un lubricante tópico en los ojos en ambos ojos.
  3. Afeitar la trasera deseada usando cortaúñas eléctricos. Comenzar en el tobillo y extenderse a la columna vertebral y la parte inferior de las costillas; Asegúrese de no piel queda como esto afectará la adherencia marcador.
    Nota: Aquí, el miembro posterior derecho se registró; sin embargo, puede utilizarse cualquier trasera.
  4. Usando un marcador permanente, indicar la ubicación de la cresta ilíaca y la articulación de la cadera. La cresta ilíaca es justo debajo de la parte inferior de las costillas y es fácilmente palpable al reunir las rodillas bajo el ratón ' cuerpo.
    Nota: Se encuentra la articulación de la cadera flexionando y extendiendo la pierna para encontrar el punto de articulación entre la pelvis y el fémur.
  5. Con finas pinzas, sujete el extremo puntiagudo de un marcador pequeño y sumerja la base en pegamento adhesivo de acción rápida, o una alternativa equivalente. Colocar el marcador en la punta del cuarto dígito y mantenga en lugar de 2-3 s permitir que el pegamento se seque. Coloque los otros dos marcadores pequeñas en la articulación metatarsofalángica y el tobillo de la misma manera ( figura 1B).
  6. Colocar marcadores grandes sobre la cresta ilíaca y cadera ( figura 1B) de la misma manera que los pequeños marcadores.
  7. Quitar el ratón de la ojiva y traslado inmediato a la sala de grabación con una jaula de transferencia. Coloque el ratón sobre la caminadora estacionaria y permitir la completa recuperación de la anestesia.

3. Grabación de la marcha

  1. previo a la grabación del ratón ' marcha s, tomar una foto de un bloque de dimensiones conocidas en la caminadora.
    Nota: Esto permitirá que los píxeles del vídeo a convertir a mediciones reales. La cámara debe colocarse aproximadamente 120 cm de la cinta.
    1. Posición de la cámara a la misma altura y el nivel de la cinta. Mantener la misma posición de cámara para las grabaciones tras la imagen de calibración.
  2. Una vez que el ratón ha recuperado de la anestesia, encienda la caminadora a una velocidad baja (5 cm/s) para dejar el ratón empezar a caminar. Asegúrese de que la dirección de la correa de cinta de correr es tal que los marcadores en el ratón estén orientadas hacia la cámara.
  3. Aumento de la caminadora la velocidad gradualmente hasta 20 cm/s; esto es la velocidad ideal para un paso consistente en ratones sanos más.
    Nota: Aunque es ideal que todos los ratones caminando a la misma velocidad, algunos pueden ser incapaces de llegar constantemente a esta velocidad.
    1. Si el ratón es incapaz de andar en 20 cm/s, reducir la velocidad según sea necesario y asegúrese de hacer una nota de esto. Reducir la velocidad de la cinta hasta que se consiguen ciclos de paso constante.
      Nota: Más adelante análisis de los datos puede ajustar por diferencias en velocidades.
  4. Comienza el video de la grabación una vez que el ratón está caminando constantemente (es decir, caminar a un ritmo constante, no cría o tejido de un lado a otro). Continuar grabando hasta que se han registrado el paso consecutivo de 8 a 12 ciclos. Para cada video, registro la velocidad de la caminadora y el lado del ratón grabado.
  5. Una vez completada, la grabación apague la cinta de correr y retomar el ratón de su jaula. Limpiar la cinta fondo entre grabaciones como olores dejados por otros ratones pueden alterar el comportamiento de los ratones entrantes. Para reducir el estrés y daño de la piel, no quitar los marcadores; permitir que los ratones eliminar por cuenta propia.

4. Análisis

  1. procesar los vídeos utilizando el software de análisis de movimiento.
    Nota: En nuestros experimentos, utiliza secuencias de comandos personalizadas diseñadas para el software de imágenes y estadístico (véase Tabla de materiales) que fueron escritos por el Dr. Nicolas Stifani. Los pasos siguientes se realizan utilizando el software de análisis de movimiento seleccionado.
    1. Extraer las coordenadas de píxel de los marcadores de los videos y con el vídeo de calibración, transformar los valores de los píxeles a centímetros y calcular los ángulos de las juntas en cada fotograma.
    2. Identificar el comienzo y final de cada ciclo de paso, obteniendo así información sobre duración de paso y longitud.
    3. Normalizar el paso a 200 bastidores normalizados, la duración del ciclo que swing y postura están representados por 100 marcos, respectivamente.
  2. Los cuadros normalizados, calcular parámetros cinemáticos para el análisis de datos utilizando el software de hoja de cálculo (véase Tabla de materiales).
    1. Para establecer el ángulo promedio de un conjunto particular, tomar la media de todos los ángulos dentro de un marco normalizado como:
      figure-protocol-1
      Nota: aquí la x representa el valor de ángulo en un dado normalizado marco y n representa el número de bastidor normalizado.
    2. Para establecer el rango de movimiento de una articulación particular para un ratón dado, reste el ángulo más pequeño desde el ángulo más grande en un conjunto de Marcos normalizados como sigue:
      Gama de movimiento = ángulo máximo - mínimo de ángulo.
      Aquí Nota: Ángulo máximo y mínimo de ángulo son los ángulos más grandes y más pequeño conseguidos dentro del ciclo de paso normalizada, respectivamente.
    3. Para establecer diferencia de RMS, primero restar el ángulo promedio de cada punto experimental del tiempo de la grabación de línea de base. A continuación, cuadrado cada diferencia, tomar la media de valores todo cuadrados y raíz cuadrada del promedio. La ecuación es como sigue:
      figure-protocol-2
      Nota: aquí figure-protocol-3 representa el ángulo promedio de la línea de base de grabación; y representa el ángulo promedio de cada punto experimental del tiempo; n representa el número de fotogramas normalizados. Raíz significar cuadrado diferencia (RMS) es una medida usada para evaluar la desviación en la marcha de las grabaciones de la línea de base.
  3. Utilizar gráficos científicos y software de estadísticas para analizar y presentar los datos (véase Tabla de materiales).

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Resultados

La figura 1 es una representación esquemática del procedimiento utilizado para el análisis de la cinemática de la marcha. Marcadores primera, reflexivos están fabricados y colocados en un ratón en 5 puntos anatómicos. Marcha entonces se registra mientras el ratón está caminando en una cinta rodante. Software de análisis de movimiento se utiliza para extraer datos cinemáticos para posterior análisis.

Figura 2A C repres...

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Discusión

En los ratones con EAE, los dos métodos más comunes de medición de déficit motor son puntuación clínica y latencia caigan un rotarod27,28. Estas técnicas tienen varias limitaciones. Aunque conveniente y ampliamente utilizado, puntuación clínica está limitada por la obtención de datos de nivel ordinales sólo, lo que significa que no se conoce la magnitud de las diferencias entre puntuaciones clínicas. Puntuación clínica también sufre de ser incapaces de proporcion...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría reconocer Sid Chedrawe para su asistencia técnica con película. Este trabajo fue apoyado por fondos de la MS Society de Canadá (EGID 2983).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CámaraNikonNikon D750Se utiliza para filmar el video
Cinta reflectanteB& L EngineeringMKR-Tape-2
Tijeras finasFine Science Tools15023-10
PinzasFine Science Tools11252-20
Pistola de pegamentoCraftsmartE231647
mango de bisturí #4RobozR5-9884
Hoja de bisturí No.10Feather2020-12
C57BL/6 ratonesde Charles River Laboratories
EZ AnesthesiaEZ-AF9000 Auto Flow System
Manta calefactora de agua recirculanteAndroitHTP-1500
lubricante ocular tópicoRefreshDIN00210889
AfeitadoraOster78997-010
Cámara de alta velocidadFastecFastec IL3-100
Luz de alta potenciaSmith Victor CorporationModelo 700 SG (600 vatios de luz de cuarzo, 120 voltios)
Soporte de luzPromasterLS1
Cintade correr Hecho a medida en el Instituto Zoológico, Universidad de
Microsoft Excel 2016MicrosoftVersión 2016
KinemaJNicolas StifaniEste es un script generado para su uso con ImageJ
KinemaRNicolas StifaniEste es un script generado para su uso con Rstudio
Vicon MotusViconMotus Versión 9.00
GraphPad PrismGraphPad Versión6.00
Máquina anestésica Colonia

Referencias

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