La señalización de receptores de tipo Toll-like (TLR) juega un papel importante en la fisiopatología de muchas enfermedades inflamatorias humanas y se anticipa que la regulación de las respuestas de TLR por nanopartículas bioactivas es beneficiosa en muchas afecciones inflamatorias. Las células informadoras basadas en células THP-1 proporcionan una plataforma de cribado versátil y robusta para identificar nuevos inhibidores de la señalización de TLR.
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Artículo de método
Proyección de nanopartículas bioactivas en células inmunológicas fagocíticas para inhibidores de la señalización de receptores de tipo Toll
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Resumen
Resumen
La regulación farmacológica de las respuestas de los receptores Toll-like (TLR) es muy prometedora en el tratamiento de muchas enfermedades inflamatorias. Sin embargo, ha habido compuestos limitados disponibles hasta ahora para atenuar la señalización de TLR y no ha habido ningún inhibidor de TLR clínicamente aprobado (excepto el fármaco antipalúdico hidroxicloroquina) en uso clínico. A la luz de los rápidos avances en nanotecnología, la manipulación de la respuesta inmune usando nano-dispositivos puede proporcionar una nueva estrategia para tratar estas enfermedades. En el presente documento, presentamos un método de selección de alto rendimiento para identificar rápidamente nuevas nanopartículas bioactivas que inhiben la señalización de TLR en células inmunitarias fagocíticas. Esta plataforma de cribado está construida sobre células reporteras basadas en células THP-1 con ensayos colorimétricos y de luciferasa. Las células reporteras se manipulan por ingeniería genética a partir de la línea celular monocítica THP-1 humana mediante la integración estable de dos construcciones informadoras inducibles. Uno expresa un gen secretado de fosfatasa alcalina embrionaria (SEAP)Bajo el control de un promotor inducible por los factores de transcripción NF-κB y AP-1, y el otro expresa un gen informador de luciferasa secretado bajo el control de promotores inducibles por factores reguladores de interferón (IRFs). Los factores de transcripción y posteriormente producen SEAP y / o luciferasa, que se pueden detectar usando sus correspondientes reactivos sustrato. Utilizando una biblioteca de híbridos de nanopartículas de péptido-oro (GNP) establecida en nuestros estudios anteriores como ejemplo, identificamos un híbrido péptido-GNP que podría inhibir eficazmente los dos brazos de la cascada de señalización TLR4 desencadenada por su ligando prototípico, lipopolisacárido (LPS). Los hallazgos fueron validados por técnicas bioquímicas estándar incluyendo inmunotransferencia. Otros análisis establecieron que este híbrido de plomo tenía un amplio espectro inhibitorio, actuando sobre múltiples vías TLR, incluyendo TLR2, 3, 4 y 5. Este enfoque experimental permite una evaluación rápida deRa (u otros compuestos terapéuticos) pueden modular la señalización TLR específica en células inmunes fagocíticas.
Introducción
Los receptores Toll-like (TLRs) son uno de los elementos clave en el sistema inmune innato que contribuye a la primera línea de defensa contra las infecciones. TLRs son responsables de la detección de patógenos invasores mediante el reconocimiento de un repertorio de patógenos asociados patrones moleculares (o PAMPs) y el montaje de las reacciones de defensa a través de una cascada de la señal de transducción [ 1 , 2] . Hay 10 humanos TLRs identificados; Excepto TLR10 para el cual el ligando (s) permanece incierto, cada TLR puede reconocer un grupo distinto, conservado de PAMPs. Por ejemplo, TLR2 y TLR4, loca....
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Protocolo
1. Preparación de medio de cultivo celular y reactivos
- Preparar el medio de cultivo celular completo R10 añadiendo los suplementos de suero bovino fetal al 10% (FBS), L-glutamina 2 mM y piruvato sódico 1 mM en el medio RPMI-1640.
- Preparar el medio de cultivo de selección R10-Z añadiendo los antibióticos Zeocin (200 μg / mL) a R10 para mantener la expresión de SEAP bajo el control de la activación de NF-κB / AP-1. Para seleccionar las células que expresan ambos genes informadores de SEAP y de luciferasa, a~nadir tanto Zeocin (100 μg / mL) como blasticidina (10 μg / mL) a R10 (como R10-ZB).
- Preparar la so....
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Resultados
El enfoque experimental general se ilustra en la Figura 1 . Las dos líneas de células informadoras THP-1, THP-1-XBlue y THP-1-Dual, se usan para examinar rápidamente las respuestas de TLR probando la activación de NF-κB / AP-1 e IRFs, respectivamente. La activación de NF-κB / AP-1 puede detectarse mediante el ensayo colorimétrico de SEAP, mientras que la activación de IRF es monitorizada por la luminiscencia de luciferasa. Las células monocíticas THP-1 puede.......
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Discusión
Desde TLRs están involucrados en la patogénesis de muchas enfermedades inflamatorias, que han surgido como objetivos terapéuticos para la modulación de las respuestas inmunes y las condiciones inflamatorias. Sin embargo, el desarrollo clínico de la terapéutica para inhibir TLR señalización vías ha tenido un éxito limitado hasta la fecha. El medicamento antipalúdico hidroxicloroquina que inhibe TLR7 y TLR9 está en uso clínico 35 , 36 . Del mismo modo, sólo un núm.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer el apoyo del Programa de Profesor de Cita Especial en las Instituciones de Aprendizaje Superior de Shanghai (HY), el fondo inicial del Hospital Popular de Shanghai (HY), el apoyo de la Fundación Gaofeng de Medicina Clínica de Shanghai Jiaotong University School of Medicine (HY), y la financiación de la Fundación de Crohn y Colitis de Canadá (CCFC) (SET y HY).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| THP-1-XBlue célula reportera | InvivoGen | thpx-sp | mantiene el paso del cultivo celular por debajo de 20 |
| THP-1-Célula de rebote dual | InvivoGen | thpd-nfis | mantiene el paso del cultivo celular por debajo de 20 |
| RPMI-1640 (sin L-glutamina) | GE Health Care | SH30096.02 | Calentamiento hasta 37 ° C antes de usar; Agregue suplementos para hacer un medio completo R10 |
| Suero fetal bovino (calificado) | Thermo Fisher Scientific 12484028 | Calor inactivado; 10% en RPMI-1640 | |
| L-glutamina | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM en el medio completo R10 |
| Piruvato de sodio | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM en el medio completo R10 |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, 1X, sin calcio, magnesio | GE Health Care | SH30028.02 | Uso para el lavado de células y la preparación de reactivos |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | Sustrato SEAP |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Sustrato de luciferasa |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 Selección de | antibióticos para células reporteras |
| Blasticidina | InvivoGen | anti-bl-1 | Selección de antibióticos para células reporteras |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) para biología molecular | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Uso para la preparación de reactivos |
| Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) para biología molecular | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Uso para la diferenciación celular |
| Lipopolisacárido (LPS) de E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | ligando TLR4 |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | Lando TLR2/1 |
| Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | Lligando TLR3 |
| Flagelina de S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapuro | InvivoGen | tlrl-epstfla | Ligando TLR5 |
| SpectraMax Plus 384 lector de microplacas | Molecular Devices | N/A | Leer ensayo colorimétrico |
| Lector de microplacas multimodo Infinite M200 Pro con inyectores | Tecan | N/A | Leer luminiscience |
| Centrífuga Microfuge 22R | Beckman Coulter | N/A | Microcentrífuga con control de temperatura (hasta 18.000 g) |
| Centrífuga Allegra X-15R | Beckman Coulter | N/A | Centrífuga de uso general con control de temperatura (para uso en cultivos celulares) |
| Placa de ensayo Costar, blanca de 96 pocillos con fondo plano transparente, tratado con tejido | Corning Costar | 3903 | Se utiliza para el ensayo de luminiscencia |
Referencias
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
- Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
- Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E.
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Reimpresiones y permisos
