Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Evaluación de la Homeostasis dopaminérgica en ratones por medio de análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento y absorción de la dopamina Synaptosomal

11.9K vistas

⸱

DOI:

10.3791/56093

⸱

21 de septiembre de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Neuropharmacology and Genetics Laboratory, Lundbeck Foundation Center for Biomembranes in Nanomedicine, Department of Neuroscience and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Laboratory of Neuropsychiatry, Psychiatric Center Copenhagen and Department of Neuroscience and Pharmacology, University of Copenhagen

En este artículo

Resumen

Absorción de la dopamina Synaptosomal y cromatografía líquida de alto rendimiento representan experimental las herramientas de análisis para investigar la homeostasis de la dopamina en ratones mediante la evaluación de la función de transportador de la dopamina y los niveles de dopamina en el tejido estriado, respectivamente. Aquí presentamos los protocolos para medir contenido de tejido de dopamina y evaluar la funcionalidad del transportador de dopamina.

Resumen

Dopamina (DA) es un neurotransmisor modulador controla la actividad motora, los procesos de recompensa y la función cognitiva. Deterioro de la neurotransmisión dopaminérgica (DAergic) está fuertemente asociado con varias enfermedades asociadas del sistema nervioso central como la enfermedad de Parkinson, trastorno de hiperactividad de déficit de atención y adicción de drogas1,2 ,3,4. Delinear los mecanismos de la enfermedad que implica desequilibrio DA es críticamente dependiente de modelos animales para imitar los aspectos de las enfermedades, y así protocolos que evalúan las partes específicas de la homeostasis de la DA son importantes para proporcionar nuevos conocimientos y posible terapéutica objetivos para estas enfermedades.

Aquí, presentamos dos protocolos experimentales útiles que al combinarse proporcionan datos funcionales sobre el sistema de DAergic en ratones. Parámetros bioquímicos y funcionales en la homeostasis de la DA se obtienen a través de la evaluación de los niveles de DA y dopamina transportador (DAT) funcionalidad5. El sistema DA la investigación, la capacidad para medir confiablemente los niveles endógenos de DA del cerebro adulto es esencial. Por lo tanto, presentamos cómo realizar la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en tejido cerebral de los ratones para determinar niveles de DA. Realizamos el experimento en el tejido estriado dorsal (dStr) y Núcleo accumbens (NAc), pero el método es también adecuado para otras áreas del cerebro DA inervados.

DAT es esencial para la recaptación de DA en la terminal presináptica, así control de la actividad temporal y espacial de DA. liberado Conocer los niveles y funciones de DAT en el cuerpo estriado es de gran importancia cuando se evalúan DA homeostasis. Presentamos un protocolo que permite deducir simultáneamente información sobre niveles de superficie y la función usando un análisis de absorción de synaptosomal6 DA.

Los métodos actuales combinados con protocolos estándar immunoblotting proporcionan el investigador con las herramientas pertinentes para caracterizar el sistema de DAergic.

Introducción

Dopamina (DA) es un neurotransmisor modulador fundamental de comportamiento motor, recompensa y función cognitiva1,7,8,9. Los desequilibrios en la homeostasis de DA están implicados en varias enfermedades neuropsiquiátricas tales como trastorno por déficit de atención con hiperactividad, la adicción a las drogas, la depresión y la enfermedad de Parkinson1. DA se libera desde la neurona presináptica a la hendidura sináptica, donde ata a y activa los receptores en la membrana pre y postsináptica, transmitir aún más la señal. El nivel de DA en la sinapsis después de liberación es espacial y temporalmente controlada por DAT3,10. El transportador secuestra DA desde el espacio extracelular y así sostiene fisiológico DA niveles3,11. Supresión genética de DAT en ratones provoca un fenotipo de hiperdopaminérgicos caracterizado por elevados niveles de DA sinápticos, agotamiento de piscinas DA intracelulares y cambios profundos en postsynaptic DAergic señalización10,12.

Aquí, se presentan dos protocolos separados, un método a medida DA tejido contenido y otro para evaluar la funcionalidad de DAT. combinado con el ensayo de Biotinilación superficial descrito por Gabriel et al.13 estos dos métodos proporcionan información en DA niveles de contenido y funcionales de DAT para una evaluación cuidadosa de la homeostasis de la DA. Con estos métodos DA homeostasis de varios ratones transgénicos o modelos de la enfermedad puede ser caracterizada y descrita. Estas herramientas se han implementado y optimizado y son de uso estándar en nuestros laboratorios. Ensayos actuales han servido para investigar las consecuencias sobre la homeostasis de DA de alterar el C-terminal de DAT14 o expresando recombinase de Cre en la tirosina hidroxilasa (TH) promotor 5.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

las directrices de la inspección de Experimentación Animal danés (número de autorización: 2017-15-0201-01160) fue seguido y experimentos realizados en un centro de acreditación de AAALAC completamente bajo la supervisión de un bienestar de los animales local Comité.

1. synaptosomal absorción de la dopamina (método 1)

Nota: este protocolo es para la evaluación paralela de dos cerebros, pero puede utilizarse con éxito para realizar experimentos de absorción de synaptosomal DA con cuatro cerebros en paralelo.

  1. Tubos de preparaciones
    1. etiqueta 48 microcentrífuga de 1.5 mL por cuadro 1 (24 en cada cerebro). Utilizar diferentes colores para los tubos de cada cerebro a evitar la confusión entre muestras
    2. centelleo etiqueta 51 tubos #1-51.
    3. Lugar fosfato tampón salino (PBS) en el hielo. Esto servirá para mantener cerebros fríos.
    4. Encender la centrifugadora permite para pre-enfriar a 4 ° C.
    5. Pesar los dos tubos de microcentrífuga para obtener el peso exacto del tejido durante la preparación synaptosomal (sección 2.6).
    6. Prepare homogeneización buffer mezclando 4 mM HEPES y 0,32 M de sacarosa. Ajustar el pH a 7,4 y mantener en hielo.
      Nota: Buffer de homogeneización puede ser guardado en alícuotas a-20 ° C y descongelar el día del experimento.
    7. Preparar buffer de absorción mediante la combinación de los siguientes: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM de MgSO 4, de 5 mM 1 mM ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM D-glucosa (0,991 g/L). Ajustar el pH a 7,4 con NaOH (conduce a una concentración de sodio de 130 mM aproximadamente) y mantener en hielo.
      Nota: Para 2 cerebros, preparar 1500 mL de tampón de absorción. Preparar buffer de absorción como un 10 x solución sin ácido ascórbico y glucosa a 4 ° C. Haga 1 x solución de trabajo recién en el día, complementar con ácido ascórbico y glucosa. Ajustar el pH con NaOH a 7.4.
    8. Preparar buffer de absorción + ligando mediante la combinación de los siguientes: 25 mM HEPES, NaCl, KCl, de 5 mM de 120 mM 1,2 mM CaC l2, 1,2 mM MgSO 4, ácido ascórbico de 1 mM (0,194 g/L), 5 mM D-glucosa (0,991 g/L), 1 μM Pargilina, desipramine 100 de nM, 10 nM Inhibidor de la catecol-O-metil-transferasa (COMT). Ajustar a pH 7,4 con NaOH y mantener en hielo.
      Nota: Utilizar 50 mL de tampón de absorción y añadir ligando. Pargilina es añadido para ayudar a prevenir la degradación de DA por oxidación a través de la monoamino oxidasa (MAO). Inhibidor de la COMT (RO-41-0960) se añade para prevenir la degradación de la DA (catecolaminas en general) a través de la COMT. Desipramine se agrega al inhiben la captación a través de los transportadores de la norepinefrina y la serotonina y hacen los resultados de absorción específico para DAT.
    9. Preparar buffer de absorción ligando + cocaína mediante la combinación de los siguientes: 25 mM HEPES, 120 mM de NaCl, KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, ácido ascórbico de 1 mM (0,194 g/L), 5 mM D-glucosa (0,991 g/L), de 5 mM 1 μM Pargilina, desipramina nM 100 , 10 inhibidor de la COMT nM, cocaína 500 μM. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH y mantener en hielo.
      Nota: Use 7 mL de tampón de absorción + ligando y agregue cocaína. Cocaína se agrega para obtener una medida de fondo de absorción de DA no específicos para restar los datos, dejando sólo la absorción específica de la DAT (puesto que SERT y red son inhibidas por desipramina como se describe anteriormente). Alternativamente, puede utilizarse en lugar de otro un altamente potente y específico inhibidor de DAT GBR 12935,.
      Importante: Mantener todo el hielo de ahora en .
  2. Preparación synaptosomal
    1. sacrificar un ratón a la vez por dislocación cervical y decapitación.
    2. Cortar la piel con unas tijeras para revelar el cráneo y cortar cualquier exceso de tejido posterior izquierda del cráneo de decapitación. Corte del cráneo con pequeñas tijeras recta a lo largo de la sutura sagittalis termina anterior posible.
    3. Coloque las puntas de la tijera de dos en cada ojo de ratón y corte a través del cráneo para extraer el resto del cráneo y el cerebro intacto. Rápidamente quitar el cerebro y colocarlo en PBS helado. Esto mantendrá frío, mientras que el segundo cerebro está diseccionado.
    4. Usando una matriz de cerebro, diseccionar una porción coronal de 3 mm del cuerpo estriado (antero-posterior: +1,5 mm a-1,50 mm) seguida por la disección más fina con un golpeador. Vea la figura 1 para el área de perforación.
    5. Mantener el tejido en el hielo en todo momento hacia adelante.
    6. Transferir el tejido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para pesaje.
      Nota: Este peso será utilizado en el paso 1.2.14.
    7. 1.2.1-1.2.6 de paso de repetir para el segundo cerebro.
    8. Una vez obtenido el peso de ambos cerebros, transferir el tejido a un vaso de homogeneización que contiene 1 mL de buffer de homogenización helada.
    9. Homogeneizar el tejido usando un mortero accionado motor a 800 rpm, 10 carreras incluso.
      Nota: Un solo golpe es igual a uno arriba y abajo de acción, el primer movimiento debe ser alrededor de 5 s, los siguientes 3-4 s. homogeneización en medio isotónico es importante para evitar el estallido de los sinaptosomas 6. Uso de fuerza apropiado y medio isotónica permitirá los terminales presinápticos a citoplasma envolvente reseal, vesículas sinápticas, mitocondrias y citoesqueleto 15.
    10. Transferir el homogenizado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y recoger el homogeneizado restantes de la Copa de homogeneización aclarando con 0,5 mL de tampón de homogeneización adicional.
    11. Mantener la muestra en hielo mientras se homogeneiza el tejido del cerebro de otros. Los dos cerebros se ejecutan en paralelo en pasos 1.2.12-1.2.13.
    12. Pellets de los núcleos y restos de células por centrifugación (1.000 x g, 10 min, 4° C).
    13. Transferir el sobrenadante (S1) (contiene las membranas celulares y el citoplasma) a nuevos tubos de microcentrífuga de 1.5 mL y centrifugar a 16.000 x g durante 20 min a 4 ° C.
    14. Descartar el sobrenadante (que contiene el citoplasma) y resuspender el precipitado (P2) (contiene sinaptosomas crudos) en buffer de homogeneización de 40 μL / mg de tejido (basado en el peso obtenido en el paso 1.2.6). Resuspender suavemente la fracción synaptosomal cruda con una pipeta p1000 como demasiada fuerza romperá los sinaptosomas.
      Nota: Es importante acabar con al menos 280 μL. Si no, será necesario diluir con más de 40 μL por mg. 1.2.1-1.2.13 pasos deben realizarse tan rápido como sea posible y todo tiene que estar en el hielo. Tan pronto como los sinaptosomas crudos han sido suspendidas en buffer de homogeneización son estables mientras se mantienen en hielo 6 , 15 , 16.

2. Experimento de absorción

  1. 440 añadir μL tampón de absorción + ligando + cocaína el designado 12 tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y 440 tampón de absorción μL + ligando a los 36 restantes tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (ver tabla 1 para el diseño).
    Nota: Quite de hielo 15 minutos antes del inicio del experimento a llevar a temperatura ambiente, pero mantener en hielo hasta entonces conservar inhibidores de.
  2. Preparar curva de saturación (dopamina (2, 5, 6-[3H]-DA) (dopamina 3-H) (91,1 Ci/mmol) en diferentes concentraciones finales (0.031 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 y 1.0 μM)).
    1. Seis tubos de microcentrífuga de 2 mL de la etiqueta como 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 y 0.31.
    2. Tampón de absorción agregar 750 μL + ligando a los 5 tubos de microcentrífuga con número más bajo.
    3. Tampón de absorción 1,455.4 Añadir μL + ligando, dopamina 14,6 de μL (1 mM), 30 μl 3 H la dopamina (11 μM) al tubo etiquetado 10.
    4. Transferencia de 750 μL del tubo etiquetado 10 al tubo etiquetado 5. Mezclar bien y transferir 750 μL de este tubo al tubo de 2.5. Repita esta dilución con los tubos restantes.
  3. Pre-enjuague los filtros de microfibra de vidrio con 4 mL de tampón de absorción después de poner en un cubo de 12 filtro bien.
  4. Añadir 10 μL de la suspensión de membrana synaptosomal en las primeras 24 1,5 mL micro-centrifugar los tubos que contiene tampón μL 440 (ver tabla 1 para el diseño). Vortex con cuidado y desactivación brevemente para asegurar que los sinaptosomas son sumergidas en el búfer. Dejar a 37 o C durante 10 minutos
    Nota: Es importante ser exactos los tiempos durante el experimento de absorción para la justa comparación entre cerebros. Utilizar un cronómetro de precisión.
    5. Dopamina de
  5. añadir 50 μL de concentración 10 y 5 μM (sección 2.2) para los primeros dos columnas y dejar a 37 o C por 5 min con agitación. Después de exactamente 5 minutos, detener la reacción agregando 1 mL de tampón de absorción helada. Hacer lo mismo con una concentración 1.25 y 2.5 μM (sección 2.2) y con concentración 0.62 y 0,31 μM.
  6. Añadir las muestras a los filtros de microfibra previamente enjuagada y lavar con tampón de absorción helada de 5 x 4 mL. Cuando el primero de 12 muestras se han agregado a los filtros, hacia los filtros de tubos de centelleo. Repetir este proceso con las 12 muestras.
  7. Repita el paso 2.4-2.6 para el cerebro siguiente.
  8. Recuento de max 3 preparar tubos colocando un filtro de microfibra en la parte inferior de los tubos de centelleo 49-51 y añadir 25 μl de la concentración de dopamina máxima en la parte superior (10 μM).
  9. Deja todos los tubos de centelleo 51 en una campana de humos de 1 h.
  10. 3 Añadir líquido de centelleo de mL a cada tubo de centelleo y la sacudida vigorosa en un agitador de 1 h.
  11. Conde [3 H]-DA en un contador beta durante 1 minuto
    1. Abrir el programa y elegir: etiqueta: H-3, filtro de la placa: vial de 4 mL, 4 por 6, ensayo tipo: Normal y el recuento de tiempo: 1 minuto
      Nota: Este paso puede realizarse al día siguiente si es más conveniente. Dejar las muestras cubiertas con papel de aluminio durante la noche.
  12. Determinación de proteína
    1. usar un kit estándar de análisis de proteína BCA para determinar las concentraciones de proteína de los sinaptosomas de ajustes de cuentas por minuto (cpm) fmol/min/μg y para la adecuada comparación de la captación de entre las muestras.

3. Análisis de datos

experimento
  1. uso los datos de la absorción para una saturación de la curva para cada grupo y calcular la tasa de la reacción (V max) y la constante de Michaelis Menten (K M).
    Nota: El valor de K M refleja la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de V max. Por consiguiente, V max refleja directamente la función de DAT (capacidad de absorción máxima), que depende del número de DAT en la superficie y en cómo su actividad puede ser modulada por modificaciones postraduccionales o interacción de proteínas, así como en alteraciones en los gradientes de iones. El valor de K M es una medida indirecta de la afinidad del sustrato por el transportador que, lo importante es que también puede ser modulada por modificaciones postraduccionales o proteínas obran recíprocamente. Para evaluar completamente los cambios funcionales, por tanto, es importante determinar directamente los niveles de expresión superficial por ejemplo un análisis de Biotinilación superficial. Una descripción de la recaptación de dopamina y una elaboración sobre el significado de los valores máximos de K M y V han sido revisados por Schmitz et al. 17.

4. Cromatografía líquida de alto rendimiento (método 2)

  1. disección de cerebro
    1. tubos de microcentrífuga de etiqueta y pesaje, una por cada región por ratón.
    2. Sacrificio de un ratón a la vez por decapitación y dislocación cervical. Quitar rápidamente el cerebro como se describe en la sección 1.2. Realizar más disección inmediato.
    3. Usando una matriz de cerebro, diseccionar una porción coronal 3 mm de estriado seguido más fina bilateral disección de NAc y dStr con un golpeador. Vea la figura 3 para el área de perforación.
    4. Transferir el tejido a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y coloque rápidamente en hielo seco. Pesa el tejido y colóquelo inmediatamente en el hielo seco.
      Nota: El peso del tejido es importante para el cálculo de la concentración más tarde.
      5. 4.1.1-4.1.4
    5. Repita los pasos con el ratón siguiente.
      Nota: Coloque el tejido en 80 o C hasta la transformación posterior o inmediato proceda al tratamiento de tejido.

5. Preparación de tejido

  1. vuelta en la centrifugadora para pre-enfriar a 4 ° C
  2. (0.1 ácidos perclóricos de N (HClO 4)) de la solución de homogeneización y mantener en hielo.
  3. Usando solución de homogeneización, preparar un estándar fresco 0.1 dopamina pmol/μL de una solución stock de 1 mM (una dilución de 10.000 x).
    Nota: La solución se prepara disolviendo dopamina en buffer de homogeneización a una concentración stock de 1 mM, que se puede mantener a 20 ° C durante aproximadamente un mes. Si otras áreas del cerebro son de interés, concentración de la norma tendrá que modificarse, desde otras áreas del cerebro incluyendo el córtex prefrontral, hipocampo, sustancia negra y área tegmental ventral poseen hasta 100 veces menos DA comparado con estriado.
  4. Añadir solución de homogenización de 500 μL de cada muestra (es decir, tejido NAc y dStr; sección 4.1) y homogeneizar las muestras usando un homogeneizador ultra velocidad completo para aproximadamente 30 s. Mantenga la muestra en agua helada durante la homogeneización. Entre cada muestra, limpiar el homogenizador ultra con agua (toda velocidad de 30 s).
  5. Centrifugar las muestras durante 30 min a 4 ° C, 14.000 x g.
    6. Muestra de
  6. transferencia aproximadamente 200 μL a un vidrio de 0,22 μm filtro (1 cm de diámetro) utilizando una jeringa de plástico de 1 mL.
    Nota: El uso de filtros de vidrio no es de importancia, como los filtros elegidos son 0.22 μm para eliminar las sustancias de alto peso molecular.
  7. Análisis de muestras de detección electroquímico (EC)-HPLC metodología 18 como se describe en sección 6.

6. Análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento

  1. Prepare la siguiente solución para la fase móvil: acetato de sodio 55 mM, octanesulfonic ácido 1 m m, Na 2 EDTA 0.1 mM, 8% de acetonitrilo, ácido acético 0,1 M, pH = 3.2.
    Nota: Ajustar el pH con ácido acético de 0,1 M. Es importante ser precisos con el pH. La solución debe ser degassed por el desgasificador en línea (parte integrada del sistema HPLC). Hacer 2 L de la fase móvil y cambiar una vez al mes (cambiarlo cuando el ruido se oiga). Debido a las fluctuaciones tarda aproximadamente 24 horas para ajustar después de cambiar la fase móvil.
  2. Configuración del detector:
    1. conjunto de voltios de salida de 700 mV y la temperatura de 32 ° C en el horno del detector, esto es muy importante. Hacer un programa de gama mediante el manual en línea. Consulte el manual para más detalles). Agregar el programa de tiempo según la tabla 2.
      Nota: En este estudio, se establece el programa para cambiar automáticamente la corriente en tiempos de retención establecido, para conservar la HPLC a la corriente óptima y para mantener los picos del cromatograma ampliada como sea posible, pero todavía dentro de vista. Esto ha sido optimizado para lisados de cerebro estriado de los ratones.
  3. Cuando el programa se ha añadido al detector, hacer una curva de calibración de 3 puntos, inyectando el estándar tres veces (5, 10 y 15 μL).
    Nota: Estándar (10 μL (10 μL x 0.1 pmol/μL = 1 pmol DA)) debe ser inyectada cada décima muestra muestras y calibradas con el estándar más cercano. Bellas sintonizar el sistema el día antes por el estándar de 3 puntos de ajuste y comprobación de si el cromatograma sale dentro del rango esperado. Si se observa un considerable ruido, cambiar la fase móvil. Si un pico es más alto que 990 mV entonces volver a inyectar la muestra en un volumen más bajo, o hacer un nuevo programa de gama y una nueva curva estándar. El límite de detección se mide como 3 veces el valor del ruido en mV para el valor más bajo de pico inyectado para cada estándar (NA, DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT y 5-HT).
    1. Sistema de puesta a punto la solución LC y activación comienza 1; este análisis en el modo online. Escriba el ID de usuario y contraseña y haga clic en Aceptar. Esperar LC solución conectar a los instrumentos. Ir a tabla de lote y rellene la información (p. ej., tipo de muestra: desconocido para las muestras y std estándar, tipo de análisis: lo QT, inj volumen: 10, ISTD amt: con nivel 1). Guardar el archivo (ir a archivo - > guardar el archivo por lotes como - > Ahorre).
    2. Que el sistema inyecte la primera muestra pulsando ' iniciar lote '. Esto dará lugar a la inyección de muestra μL 10 por el inyector automático con un módulo de entrega solvente.
      Nota: Utilice una velocidad de flujo de la bomba de 0.15 mL/min y una columna de C18 con la fase de inversión. Aquí se utilizó un detector amperométrico para detección electroquímica. El electrodo de carbón vidrioso debe establecerse a 0.8 V con un electrodo de referencia Ag/AgCl. Para ensayo de dopamina, use cromatografía 3 μ de Sao (3) C18 (DA 2 mm x 100 mm, partículas tamaño 3 μm) para lograr la separación cromatográfica.
    3. Extracto de las áreas pico registrados y calculados.
      1. Vaya a adquisición de datos para seguir el cromatograma cuando terminaron las muestras. Ir a post ejecutar análisis - Lc > eligió el nombre del archivo (se abrirá el cromatograma) - > haga clic en ver. En la barra de integración manual, añadir todos los picos para integrarse - > ir a informe de los datos e imprimir la lectura.
        Nota: Aquí LC solución se utilizó el software para control de sistema y análisis de datos.
  4. De las áreas de pico, calcular la concentración de dopamina en una muestra, como sigue utilizando la concentración conocida del estándar:
    1. utilizar el área de pico de la norma (equivale a 1 pmol) para adquirir el factor A.
      figure-protocol-1
    2. utilice A factor para obtener la concentración de las muestras.
      Concentración de la muestra (en pmol por 10 μL) = Factor A × área del pico de la muestra
    3. Utilice esta fórmula para obtener la concentración de la muestra en ng.
      Muestra concentración pmol / 10 μl μl x 500 x MW de dopamina = concentración de la muestra en ng
      muestra concentración (en ng) = concentración de la muestra (en pmol por 10 μL) x 500 μL x MW de la dopamina
    4. utilizar la concentración de la muestra en ng para obtener t muestra la concentración de pg/g de tejido (muestra la concentración de pg / g de tejido = pg/g de tejido).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Protocolo de captación DA actual (figura 1) incluye todos los pasos necesarios para evaluar la funcionalidad de DAT en sinaptosomas de ratones. Nuestros datos representativos del método de captación de DA (figura 2) muestra una curva de saturación con datos sin ajustar (figura 2B) y ajustar los datos (figura 2A). La curva de saturación muestra captación de ratones de tip...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Este manuscrito describe protocolos experimentales útiles para delinear DA homeostasis en cualquier modelo de ratón de elección. Ofrecemos protocolos detallados para medir los niveles de DA en el tejido cerebral de ratones utilizando HPLC y synaptosomal DA captación para evaluar funcional DA transporte a través de DAT. Los procedimientos, protocolos y límites para el experimento HPLC y análisis de absorción DA synaptosomal serán elaborados por debajo.

El protocolo de captación synaptosomal pue...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la UCPH 2016 programa de excelencia (U.G., A.R., K.J.), la Fundación Lundbeck (M.R.) centro de la Fundación Lundbeck para biomembranas en nanomedicina (U.G.), el nacional Instituto de salud subvenciones P01 DA 12408 (U.G.), el danés Consejo para la investigación independiente - ciencias médicas (U.G.).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Inhibidor de COMTSigma Aldrich, AlemaniaRO-41-0960Para el protocolo de captación sinaptosómica de DA
[3H]-DopaminaPerkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, EE. UUNET67-3001MCPara el protocolo de captación sinaptosómica de DA
Filtros de microfibra de vidrioGF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire1822-024Para el protocolo de captación de DA sinaptosómico
HiSafe Líquido de centelleoPerkin Elmer1200-437Para el protocolo de captación de DA sinaptosómico
MicroBeta2Perkin ElmerPara el protocolo de captación de DA sinaptosómica
BCA Protein Kit de ensayoThermo Scientific Pierce23225Para el protocolo de captación de DA sinaptosómico
HEPESSigma Life ScienceH3375Para el protocolo de captación de DA sinaptosómico
SacarosaSigma Life ScienceS7903Para el protocolo de captación de DA sinaptosómico
NaClSigma Life ScienceS3014Para el protocolo de captación de DA sinaptosómico
KClSigma Life ScienceP9541Para el protocolo de captación de DA sinaptosómico
CaCl2Merck KGaA10043-52-4Para el protocolo de captación de DA sinaptosómico
MgSO4Sigma Life Science63065Para el protocolo de captación sinaptosómica de DA
Ácido ascórbicoSigma Life ScienceA0278Para el protocolo de captación de DA sinaptosómico
D-GlucoseSigma Life ScienceG7021Para el protocolo de captación sinaptosómica de DA
PargylineSigma AldrichP-8013Para el protocolo de captación de DA sinaptosómico
DesipraminaSigma AldrichD3900Para la captación sinaptosómica de DA
protocolo DopaminaSigma Life ScienceH8502Para el protocolo de absorción sinaptosómica de DA
CocaínaSigma Life ScienceC5776Para el protocolo de captación de DA sinaptosómico
Instrumentos ASIla matriz cerebralRBM2000CPara el protocolo de captación de DA sinaptosómico
Disruptor de teflón mecánico CafanoBuch & HolmDescatalogadoPara el protocolo de captación sinaptosómica de DA (homogeneización)
Antec Decade (detector amperométrico)Antec, Leiden, Países BajosDescatalogado: nuevo modelo DECADE Elite / Lite™ Detector electroquímico tipo 175 y 176Para protocolo HPLC
Avantec 0.22 μ m filtro de vidrioFrisenette ApS, Dinamarca13CP020ASPara protocolo HPLC
Columna: Prodigy 3 μ ODS-3 C18Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, AlemaniaNúmero de pieza:00A-3300-E0protocolo HPLC
ShimadzuLabSolutionspara el protocolo HPLC
Ácido percloro 0.1MFluka Analytical35418-500mlPara el protocolo HPLC (preparación de tejidos)
EDTASigmaE5134-50gPara el protocolo
HPLCNatriumdihidrogenfosfatoBie& Berntsen1.06346 1000gPara el protocolo de HPLC
Sulfonato de sodio de 1-octano monohidratadoAldrich74885 -10gPara el protocolo de HPLC
Acetonitrilo, isocrático Grado de HPLCScharlauAC03402500Para el protocolo de HPLC
Filtre 0.22umFrisenette ApS, DinamarcaAvantec 13CP020ASPara el protocolo de HPLC (Preparación de tejidos)
ácido orto-fosfórico 85%Merck1.00563. 1000mlPara el protocolo de HPLC
ElectrodoAntec, Leiden, Países BajosAN1161300Para el protocolo HPLC (consulte el manual en línea)
Programa de detector en el detector electroquímico DECADE IIAntec, Leiden, Países BajosLite™ Detector electroquímico tipo 175 y 176para protocolo HPLC
. de Para el software de solución LC del Estación de trabajo de la serie

Referencias

  1. Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
  2. Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
  3. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
  4. Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
  5. Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
  6. Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
  7. Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
  8. Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
  9. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  10. Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
  11. Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
  12. Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
  13. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
  14. Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580(2013).
  15. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  16. Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
  17. Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
  18. Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
  19. Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
  20. Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
  21. Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
  22. Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
  23. Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
  24. Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
  25. Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
  26. Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
  27. Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
  28. Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
  29. Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
  30. Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
  31. Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
  32. Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
  33. Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
  34. Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
  35. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
  36. Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468(2015).
  37. Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
  38. Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Homeostasis de la dopaminatransportador de dopaminaniveles de dopaminatejido estriatalensayo de captaci n de dopaminaan lisis de tejido cerebralfunci n del transportador de dopaminacin tica del transportador de dopamina
Evaluación de la Homeostasis dopaminérgica en ratones por medio de análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento y absorción de la dopamina Synaptosomal
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.