Artículo de método

Perfilación de IgG anti-Neu5Gc en sueros humanos con un ensayo de microarray de sialoglucano

DOI:

10.3791/56094

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13 de julio de 2017

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1Department of Cell Research and Immunology, Tel Aviv University, 2Department of Chemistry, University of California-Davis

En este artículo

Resumen

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Se puede utilizar un ensayo de microarrays de sialoglucano para evaluar anticuerpos anti-Neu5Gc en sueros humanos, lo que lo convierte en un posible ensayo diagnóstico de alto rendimiento para el cáncer y otras enfermedades humanas mediadas por inflamación crónica.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células están cubiertas con un manto de cadenas de carbohidratos (glicanos) que se altera habitualmente en el cáncer y que incluye variaciones en la expresión del ácido siálico (Sia). Se trata de azúcares ácidos que tienen una cadena principal de 9 carbonos y que tapan los glicanos vertebrados en las superficies celulares. Dos de las principales formas de Sia en los mamíferos son el ácido N- acetilneuramínico (Neu5Ac) y su forma hidroxilada, el ácido N- glicolilneuramínico (Neu5Gc). Los seres humanos no pueden producir Neu5Gc endógeno debido a la inactivación del gen que codifica la citidina 5'monofosfato-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hidroxilasa (CMAH). Neu5Gc extranjero es adquirido por las células humanas a través del consumo de la dieta de la carne roja y lácteos y posteriormente aparece en diversos glicanos en la superficie celular, acumulando principalmente en carcinomas. En consecuencia, los seres humanos tienen anticuerpos circulantes anti-Neu5Gc que desempeñan diversos papeles en el cáncer y otras enfermedades crónicas mediadas por la inflamación y que se están convirtiendo en potencial diagnóstico y terapéutico.Rgets Aquí, se describe un alto rendimiento sialoglycan microarray ensayo para evaluar tales anticuerpos anti-Neu5Gc en el suero humano. Los glicanos que contienen Neu5Gc y sus pares emparejados de controles (glicanos que contienen Neu5Ac), cada uno con una amina primaria de núcleo, están unidos covalentemente a diapositivas de vidrio revestidas con epoxi. Ejemplificamos la impresión de 56 diapositivas en un formato de 16 pozos utilizando una nano-impresora específica capaz de generar hasta 896 matrices por impresión. Cada diapositiva puede usarse para examinar 16 muestras de suero humano diferentes para la evaluación de la especificidad, intensidad y diversidad de anticuerpos anti-Neu5Gc. El protocolo describe la complejidad de esta herramienta robusta y proporciona una guía básica para aquellos que buscan investigar la respuesta al antígeno de carbohidratos dietéticos Neu5Gc en diversas muestras clínicas en un formato de matriz.

Introducción

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Los sias son azúcares ácidos que cubren las cadenas de glicanos sobre las glicoproteínas de la superficie celular y los glicolípidos en los vertebrados. La expresión de Sia se modifica en las células cancerosas 1 y se correlaciona con la progresión y / o metástasis 2 , 3 . Dos de las principales formas de Sia en los mamíferos son Neu5Ac y su forma hidroxilada, Neu5Gc 2 . Los seres humanos no pueden sintetizar Neu5Gc debido a una inactivación específica del gen que codifica la enzima CMAH. Este Sia no humano incorpora metabólicamente en las células humanas como "yo", originado de alimentos ricos en Neu5Gc dietéticos ( por ejemplo, carne roja) 4 , 5 . Neu5Gc está presente en niveles bajos en las superficies celulares de epitelios humanos y endotelios, pero se acumula especialmente en los carcinomas. Neu5Gc es reconocido como extraño por el sistema inmune humanos humoral 2 , 6 .La complejidad antigénica de Neu5Gc-glicanos puede surgir a múltiples niveles, incluyendo Neu5Gc modificación, vinculación, glycans subyacente y andamios, y su densidad, todo reflejado por la complejidad de anti-Neu5Gc respuesta de anticuerpos en los seres humanos [ 6] . Algunos de estos anticuerpos sirven como biomarcadores de carcinoma y inmunoterapéuticos potenciales [ 7] . El advenimiento de la síntesis quimioenzimática de diferentes sialoglicanos 8 abrió el camino para el más análisis en profundidad de dichos anticuerpos, facilitado por el uso de la tecnología de microarrays glicano 9, 10. Por lo tanto, con la facilidad de preparación y manipulación de grandes bibliotecas de carbohidratos naturales y sintéticos, los microarrays de glicano se han convertido en una poderosa tecnología de alto rendimiento para investigar las interacciones de los carbohidratos con una miríada de biomoléculas 10 , 11 , 12 , 13 . En un formato de matriz, se utilizan cantidades mínimas de materiales, y esta presentación multivalente de glicanos biológicamente relevantes permite la investigación de miles de interacciones de unión en un solo experimento. Es importante destacar que esta tecnología también puede aplicarse al descubrimiento de biomarcadores y al seguimiento de respuestas inmunes en varias muestras [ 7 , 12] .

La fabricación exitosa de microarray de glycan requiere la consideración de tres aspectos importantes: el tipo de robot de impresora, la química de conjugación de glicano y la óptica de detección. En cuanto a la consideración del instrumento de impresión, existen dos técnicas: impresoras de contacto y sin contacto. En la impresión de contacto, se sumergen 1-48 clavijas de acero en una placa de fuente de pocillos múltiples que contiene solución de glicano y se manchan en portaobjetos de vidrio funcionalizados poniendo en contacto directamente la superficie de deslizamiento de vidrio. La cantidad de solución deQue se fija a la corredera es una función de la duración prolongada de la superficie de deslizamiento. Por lo general, las muestras se pre-manchan primero en un bloque de vidrio (para llegar a puntos homogéneos) antes de que se impriman en la superficie de la diapositiva. En impresoras sin contacto ( por ejemplo, la impresora piezoeléctrica), los glicanos se imprimen a partir de un capilar de vidrio usando señales eléctricas controladas. La señal eléctrica puede calibrarse finamente para conseguir una impresión más precisa en relación con la impresión por contacto. El tamaño y la morfología de las manchas son también relativamente más homogéneas. Una ventaja adicional es el reciclado de la muestra de vuelta a la placa fuente después de la impresión. Sin embargo, la principal desventaja de las impresoras piezoeléctricas es la limitación de la punta de impresión (4 u 8), dando como resultado una duración de impresión muy larga, lo que requiere una especial atención a la estabilidad de la diapositiva, temperatura, humedad y evaporación de la muestra. La impresora de inyección de tinta sin contacto requiere volúmenes de muestra más grandes 14 .

En contraste con las limitadas opciones disponibles para los métodos de impresión, la química de conjugación de glicanos es una consideración más compleja, con muchas opciones para elegir. La química de inmovilización seleccionada debe tener en cuenta tanto los grupos activos sobre los glicanos como la reactividad de la superficie deslizante. Los glicanos que se inmovilizarán sobre una superficie de microarrays específica, sintetizada sintéticamente o aislada naturalmente, requieren un grupo reactivo idéntico. Además, los glicanos necesitan ser puros y homogéneos. Por otro lado, la superficie de inmovilización y la química deben proporcionar reproducibilidad y densidad de unión fiable. Se han desarrollado múltiples métodos de inmovilización con uniones covalentes o no covalentes (absorción física) 10 , 11 , 12 , 13 . Para información altamente detallada sobre la tecnología de microarray de glicano impreso para los no iniciadosD investigador, refiérase a estas excelentes revisiones 13 , 15 . Es importante destacar que la reciente información mínima requerida para una iniciativa de Glycomics Experiment (MIRAGE) describe pautas para la preparación de muestras 16 y para reportar los datos de los análisis de microarray de glycan 17 para mejorar los estándares en este campo en crecimiento.

Aquí, describimos un protocolo detallado para la fabricación de sialoglycan microarrays utilizando un contacto específico nano-impresora en un formato de 16 pozos. Cada uno de los glicanos tiene una amina primaria que median su enlace covalente con diapositivas de vidrio activadas con epoxi. También describimos el desarrollo y el análisis de una diapositiva usando varias muestras de suero humano, anticuerpos y lectinas de plantas de unión a Sia. Los ensayos de microarrays de Sialoglycan implican varios pasos importantes que incluyen la fabricación, procesamiento, desarrollo y análisis de la matriz. La fabricación de arrays requiere la planificación del arLa preparación de los glicanos y la placa fuente, la programación de la nano-impresora y la impresión de las diapositivas. Posteriormente, las diapositivas se procesan, desarrollan y analizan ( Figura 1 ).

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Protocolo

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Se obtuvieron muestras de sueros humanos del Banco de Sangre de Israel y se utilizaron de acuerdo con la declaración de Helsinki y la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Tel Aviv.

1. Planificación y diseño de la fabricación de arrays

  1. Determine el diseño de la diapositiva.
    NOTA: Cada diapositiva contiene 16 sub-matrices divididas en 16 bloques idénticos numerados B1 a B16 ( Figura 1B , Figura 1A ).
  2. Determine el diseño del pasador. Utilice cuatro clavijas, cada una imprimiendo cuatro sub-arrays (bloques) por diapositiva:
    Pin 1 imprime los bloques 1, 2, 9 y 10;
    El Pin 2 imprime los bloques 3, 4, 11 y 12;
    El Pin 3 imprime los bloques 5, 6, 13 y 14; y
    El pin 4 imprime los bloques 7, 8, 15 y 16 ( Figura 1A adicional ).
  3. Determine el bloque y la disposición de la placa de 384 pozos.
    NOTA: El orden en que aparecen los glicanos en cada bloque requiere una planificación cuidadosa. En este ejemplo arrAy, imprima cada muestra en cuatro repeticiones, diseñe puntos fluorescentes en la esquina inferior derecha (para facilitar el análisis de puntos) e imprima manchas de IgG estándar a seis concentraciones crecientes ( Figura 1B ).
    1. Para cada mancha impresa, primero dispense el material en cuatro pocillos (uno para cada pin) en una placa de 384 pocillos.
      NOTA: El orden de los materiales en la placa de 384 pozos se basa en la disposición de bloques diseñada ( Figura 1B-C suplementaria ).

2. Preparación de glicanos y la placa fuente

  1. Preparar tampón de impresión de glicano (50 ml de tampón fosfato 300 mM, pH 8,4). Pesar 58,5 mg de monohidrato de fosfato monosódico (NaH 2 PO 4 .1H 2 O) y 3,9 g de heptahidrato de fosfato disódico (Na 2 HPO 4 .7H 2 O) en 40 ml de agua desionizada (DIW). Titular hasta pH 8,4 usando NaOH 4 M. Ajuste el volumen a 50 mlD a través de una membrana de 0,2 μm para esterilización.
  2. Preparar tampón marcador (50 ml de tampón de fosfato 187 mM, pH 5). Pesar 289 mg de monohidrato de fosfato monosódico (NaH 2 PO 4 .1H 2 O) y 1,94 g de heptahidrato de fosfato disódico (Na 2 HPO 4 .7H 2 O) en 40 ml de DIW. Se titula a pH 5 usando HCl 1 M. Ajuste el volumen a 50 ml y filtre a través de una membrana de 0,2 μm para esterilización.
  3. Preparar el tampón de curva de STD (50 ml de PBS-glicerol: solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, suplementado con glicerol al 10% a partir de un stock de glicerol al 100%) y filtrarlo a través de una membrana de 0,2 μm para esterilización.
  4. Preparar cada solución madre de glicano a 10 mM en DIW. Verificar las concentraciones de glicano sialilado por detección de fluorescencia en el análisis de cromatografía líquida de alta presión de fase inversa 18 .
  5. Diluir cada glicano a 100 μM en un volumen total de 100 μl de tampón de impresión de glicanoEn tubos de microcentrífuga.
  6. Preparar una amina primaria que contenga colorante fluorescente. Solubilizar Alexa 555-hidrazida a 1 mg / ml con tampón marcador y luego diluir a 1 μg / ml en un volumen total de 1 ml.
    NOTA: Cualquier otro colorante que contiene amina primaria se puede usar con una longitud de onda apropiada de acuerdo con el escáner de diapositivas.
    NOTA: Los puntos marcadores facilitan la alineación de la cuadrícula en cada bloque durante el análisis.
  7. Preparar diluciones de la curva de la ETS de IgG humana: preparar 0,5 mL de una solución madre de IgG humana a 160 ng / μl en tampón de curva STD. Diluya en serie el stock 1: 1 seis veces para obtener 80, 40, 20, 10, 5, y 2,5 ng / μL, todos en tampón de la curva STD con un volumen total de 200 μl cada uno.
    NOTA: Se pueden usar otros isotipos Ig si son adecuados para el experimento ( por ejemplo, IgA humana, IgM, IgE o una Ig de un organismo diferente).
  8. Coloque la placa de 384 pocillos sobre hielo. Utilizando una pipeta electrónica múltiple, alícuota de 7 μL de cada glicano, marcador y curva de STD IgG-cuatro repeticionesS de cada uno - de acuerdo con la disposición de la placa ( Figura 1C adicional ). Para mayor precisión, cargue 35 μL de cada muestra y alícuote 7 μL en cada uno de los cuatro pocillos de la muestra. Coloque los 7 μl restantes de cada glicano en su tubo original.
  9. Cubra la placa con parafilm y centrifugue durante 2 min a 250 g y 12 ° C. Coloque la placa a temperatura ambiente (RT), protegida de la luz. No descubra la placa antes de que la humedad en la habitación alcance el 60-70%.

3. Programación de la Nano-impresora

  1. Abra el software "Microarray Manager". Utilice la ventana "Propiedades del método".
  2. Configure el diseño de la mesa de trabajo: elija la "56 configuración de la diapositiva".
    NOTA: Se trata de una configuración predefinida que permite la impresión de 56 diapositivas. Calibre para cada tipo de placa, alfiler y formato de impresión ( Figura 2 , paso 1).
  3. Seleccione "Pin Configuration"| "Pin Herramienta 1x4 9 mm."
    NOTA: Esta es una configuración predefinida para usar cuatro pines ( Figura 2 , paso 2).
  4. Defina el "Tipo de pin". Calcular y crear el tipo de pasador que es adecuado para la impresión.
    NOTA: Este paso define cuántos puntos imprimirá un pin antes de volver a sumergirlo en el pozo de la muestra 384 y debería optimizarse para los diferentes tipos de clavijas y la química de las superficies de deslizamiento.
    NOTA: Al usar clavijas 946MP3, considere dos cuestiones importantes: 1) cada pin puede imprimir hasta 140 puntos homogéneos y 2) el pre-spotting es esencial para drenar el exceso de líquido de la punta del pin antes de imprimir en las diapositivas. Por lo tanto, programe cada pin para imprimir 20 pre-puntos en un bloque de preimpresión (optimizado para clavijas de 946MP3 en diapositivas recubiertas de epoxi).
    1. Calcular el número total de manchas impresas por muestra.
      NOTA: Aquí, cada pin imprime 4 puntos por sub-array (bloque); Un total de 4 sub-arrays por diapositivas = 16 spots / slIde Después de 7 diapositivas, cada pin imprime 16 x 7 = 112 puntos. Además, 20 pre-puntos antes de la impresión da 132 puntos / inmersión. Por lo tanto, el tipo de pin se define como "946MP3-132 puntos" (4 puntos por muestra por bloque x 4 bloques x 7 diapositivas + 20 pre-puntos = 132).
    2. Cree el "tipo Pin" ( Figura 2 , paso 3). Pulse "Configuración" (panel izquierdo del software) | "Pines Micro Spotting" | "Nuevo Nombre" (946MP3-132 puntos). Defina el número de puntos por inmersión (132), el diámetro de mancha (100 μm), la absorción (0,25 μL), el suministro (0,7 nL) y el espaciamiento mínimo de puntos (100 μm). Presione "OK" | "DE ACUERDO."
    3. En la ventana "Propiedades del método", seleccione el tipo de pin creado: "946MP3-132 puntos".
  5. Definir las condiciones de lavado. Ajuste "Lavar antes de comenzar" y "Lavar después de terminar" a "Lavado normal" ( Figura 2 , paso 4).
  6. Defina la "Lista de placas".
    NOTA: Este es el patrón de muestreo de la placa (el orden de las inmersiones de la placa de 384 pocillos) de acuerdo con el diseño de la placa. Para cargar la placa en la lista de placas, configure un patrón de muestreo de placas.
    1. Cree la placa "Patrón de muestreo". Vaya a "Plantillas" ( Figura 3 ) | "Patrones de muestreo". Dar un nuevo nombre ( por ejemplo, JoVE matriz) y seleccione "Insertar" | "Rellenar top-bottom" | "Pin Herramienta 1 x 4 9 mm." Seleccione el orden de las capturas de pozos de acuerdo con el diseño de placa predefinido ( Figura 1A ). Presione "OK" | "DE ACUERDO."
    2. Cargue el patrón de muestreo de placas. Haga clic en el lado derecho de la celda "Lista de placas" ( Figura 3 ) | "Agregar placa" y seleccione el patrón de muestreo de placa correcto (el "arreglo JoVE" descrito en el paso 3.6.1.). Seleccione "Lavado normal". prensa"OK" | "DE ACUERDO."
  7. Vaya a "Placas de muestra" y cambie el desplazamiento de posición a 1 (que determina dónde se encuentra la placa en la cubierta del arrayer).
    NOTA: La posición de desplazamiento de 0 está más cerca del baño de sonicador.
  8. Defina el "Diseño de impresión de Microarray". Calcular las distancias entre bloques y bloques y el espaciado.
    1. Tenga en cuenta las dimensiones de la herramienta de desarrollo que divide la corredera en 16 pocillos de 7 x 7 mm, con espacios de 2 mm entre sub-series (un total de 9 mm entre bloques; complementario Figura 4).
    2. Considere las dimensiones de la sub-matriz.
      NOTA: El espacio entre los puntos es 0,275 mm y hay 12 columnas y 18 filas en este diseño de impresión; Las dimensiones totales son: anchura (11 x 0,275 mm = 3,025 mm) y altura (17 x 0,275 mm = 4,675 mm). Calcular la separación horizontal: 9 mm - (11 0,275) = 5,97 mm. Calcular la separación vertical: 9 mm - (17 x 0,275) = 4,325 mm. Calcular dIsance del lado izquierdo de la corredera: 4,43 mm + 1,07 mm = 5,5 mm. Calcular la distancia desde el lado superior de la corredera: 2,95 mm + 0,55 mm = 3,5 mm ( Figura 4 ).
    3. Defina los "diseños de impresión" ( Figura 5 ). Seleccione "Plantillas" | "Diseños de impresión" | "Nuevo."
      1. Seleccione "Pin Setup" | "Herramienta Pin 1 x 4 9 mm" | "Pin - 946MP3-132 manchas". En la pestaña "General", cambie el "Nombre de Microarray Print" ( es decir, "matriz JoVE"). Seleccione "Velocidad de punto" | "Número de duplicado" (4) | "Punto de contacto Altura" (0 ​​mm) | "Altura de toque suave" (3 mm) | "Imprimir en todas las posiciones disponibles" ( Figura 5A adicional ).
      2. En la pestaña "Microarray", seleccione la separación horizontal y vertical (5,9 mm y 4,325 mm del paso 3.8.2) y el número de microarrays horizontales y verticales (2). Seleccione "ImprimirMicroarray Horizontalmente "" Print Duplicate Microarray "( Figura 5B adicional ).
      3. En la pestaña de sub-matriz, elija el número máximo de columnas (12), el número máximo de filas (18) y la distancia entre columnas y filas (275 μm) ( Figura 5C adicional ).
      4. En la pestaña de medidas, elija la distancia desde el lado izquierdo de la diapositiva (5,5 mm), la distancia desde la parte superior de la diapositiva (3,5 mm, calculada en el paso 3.8.2), el ancho de la diapositiva de impresión (25 mm) , Y la altura de la diapositiva de impresión (75 mm) ( Figura 5D ). Presione "OK" | "DE ACUERDO."
  9. Haga clic en el lado derecho de la celda "Microarray Print Designs" y seleccione el diseño definido ("JoVE array" del paso 3.8.3, Figura 6 ).
  10. Defina el "Recuento de diapositivas" (56), y cambie el "Desplazamiento de posición" (0). Esto determina el poLa primera diapositiva que se va a imprimir en la cubierta de la máquina ( Figura 6 ).
  11. Definir el "Microarray Pre-Print Design" ( Figura 6 ). Seleccione "Bloque de vidrio" | "Herramienta Pre-Print 1 x 4 mm Pin."
    NOTA: Este ajuste de separación de puntos permite 46.464 pre-puntos (para todos los 4 pines) en el bloque de vidrio, por lo tanto 46.464 / 4 = 11.616 pre-puntos por pin. Cuando se haya agotado el espacio en el bloque de preimpresión, la impresora se detendrá y el bloque tendrá que voltearse.
    NOTA: Para calcular después de cuántas muestras el bloque de preimpresión está lleno, considere lo siguiente: cada muestra se tomará por 8 pin-dips en la placa de 384 pozos para completar 56 diapositivas (7 diapositivas por inmersión) y cada inmersión Tiene 20 pre-spots adicionales, dando un total de 160 pre-spots por muestra. Por lo tanto 11.616 / 160 = 72.6 muestras. Por lo tanto, el bloque de vidrio preimpreso tendría que ser volteado después de 72 muestras (para evaluar el tiempo de vuelco, medir hCuanto tiempo tarda una muestra en completar un recorrido completo en 56 diapositivas y luego multiplicar por 72).
  12. Seleccione "Usar diseño previo" | "Sí" | "Escanear códigos de barras" (No) | "Imprimir duplicado único" (No) ( Figura 6 ).
  13. Haga clic en "Validar" ( Figura 6 ).
  14. Haga clic en "Guardar" y guardar el método como un archivo arr ( por ejemplo, "JoVE array.arr," Figura 6 ).

4. Impresión de matrices diseñadas

NOTA: Todos los pasos deben realizarse en una sala limpia con una humedad del 60-70% y con guantes y ropa apropiados para la protección

  1. Encienda la impresora y el humidificador de la impresora nano.
  2. Para el tampón de lavado y humidificación, llenar con agua DI. Vaciar la botella de lavado (drenaje) y el colector de la trampa de humidificación ( Figura 7A ).
  3. Coloque el humidificador en70% de humedad y humidificación de inicio.
  4. Limpie todos los pines antes de imprimir. Preparar 50 ml de una solución de limpieza de punta de punta caliente (65 ° C) (15 g de reactivo limpiador de punta y 50 ml de agua a 65 ° C, mezclar bien hasta que el reactivo sólido se disuelva completamente).
    1. Aplique la solución limpiadora a cada punta de la clavija sumergiendo el cepillo de punta (fino) en la solución de limpieza de la punta y cepillando la superficie de cada punta de la clavija.
      NOTA: La solución de limpieza con punta es corrosiva y tóxica. Asegúrese de usar guantes y gafas de seguridad en todo momento cuando use esta solución. El remojo de los pasadores en la solución de limpieza con clavija durante más de unos minutos puede resultar en daños permanentes en los pasadores.
    2. Llene el baño de ultrasonidos con 1 L de agua destilada y coloque los pernos en un portabotellas en el baño. Sonicate durante 5 min y retire los pines. Dejar secar y limpiar suavemente con toallitas especiales de sala limpia.
  5. Abra la impresión "Microarray Manager"Software er; En el conjunto de conexión, la luz de la impresora se encenderá (rojo / verde). Presione "Stop" | "Clear" | "Init" ( Figura 7B suplementaria , pasos 1-3); El brazo del cabezal de impresión reajustará entonces las alineaciones X, Y, Z.
  6. Para cargar los pines en el cabezal de impresión, presione "Load" ( Figura 7B , paso 4) y coloque los pines en el cabezal de impresión de acuerdo con la configuración definida del diseño de la herramienta de impresión / pin ( Figura 7C ); Este diseño utiliza 4 pines, cada uno imprimiendo 4 sub-arrays en cada diapositiva para obtener un total de 16 sub-arrays por diapositiva ( Figura 1A ). Después de colocar los pines, presione "Init" de nuevo.
  7. Montar las diapositivas en la cubierta del arrayer. Abra la caja de diapositivas y limpie cada diapositiva soplando gas nitrógeno de ultra-alta pureza. Coloque el número deseado de diapositivas en la plataforma matriz. Sostenga las diapositivas con dos dedos en las esquinas inferiores y luego coloque la diapositiva en suposición. Sostenga las dos esquinas derechas y empuje las esquinas izquierdas suavemente hasta que la diapositiva se ajuste firmemente en su posición. Empuje suavemente hacia la esquina inferior izquierda para asegurar un ajuste apretado ( Figura 7D ).
  8. Limpie el vidrio de pre-bloque con agua destilada, etanol al 70%, y etanol al 100% y deje que se seque al aire (use sólo toallitas limpias). Coloque el vidrio de prebloqueo en su posición en la cubierta.
  9. Llenar un baño de sonicador ( Figura 7B adicional ). Pulse "Fill" durante 55 s y luego pulse "OK". Drene el sonicador haciendo clic en "Drenar" durante 20 sy luego presionando "Aceptar". Repetir el llenado y drenaje una vez más y luego rellenar de nuevo durante 55 s.
  10. Llene el baño de lavado ( Figura 7B adicional ): presione "Prime" durante 40 s y luego presione "OK".
  11. Coloque la placa de 384 pocillos con muestras alícuotas en su ubicación en la cubierta del arrayer y retire la cubierta parafilm.
  12. Inicie la impresión.
  13. Cuando finalice la impresión, drene el baño del sonicador ( Figura 7B ) y apague el humidificador.
  14. Deje que las diapositivas se sequen en la cubierta del arrayer durante 16-24 h sin humidificación.
  15. Numere las diapositivas con una pluma de marcaje resistente al alcohol / disolvente y guárdelas en una caja sellada al vacío en la oscuridad.

5. Procesamiento y desarrollo de las matrices

  1. Saque una diapositiva de la caja sellada al vacío y colóquela en un capuchón químico durante 5 min, con la matriz hacia arriba, para evaporar el exceso de líquido.
  2. Escanee la diapositiva con la ganancia más alta (950 PMT) para asegurarse de que se han impreso todos los puntos.
  3. Proceda con el bloqueo químico de grupos epoxi en la corredera
    1. Preparar 50 ml de solución de bloqueo de etanolamina (Tris-HCl 0,1 M, pH 8 y etanolamina 0,05 M). Mezclar 140 ml de DIW con 8,8 ml de Tris-HCl (1,7 M, pH 8) y 0,45 ml de etanolamina (16,6 M). Transferencia a un 50 ml de tubo de tinción ( Figura 8A ) y caliente a 50 ° C.
    2. Hidratar la diapositiva. Coloque la lámina en un tubo de tinción lleno de DIW, cúbrala con papel aluminio e incube durante 5 min con agitación lenta y suave a RT.
    3. Bloquee los grupos epoxi reactivos en la diapositiva. Sumerja la lámina en el tubo de tinción de 50 ml lleno de solución de bloqueo de etanolamina precalentada, cubra con papel aluminio e incube durante 30 minutos con agitación lenta y suave a RT.
    4. Deseche la solución de bloqueo de etanolamina en el recipiente de basura de riesgo biológico apropiado y coloque la corredera en un nuevo tubo de tinción limpio lleno de 50 ° C DIW. Cubrir con papel aluminio e incubar durante 10 min con agitación lenta y suave a la RT.
    5. Deseche el agua y transfiera los portaobjetos a un soporte de tinción de vidrio ( Figura 8B ). Coloque el soporte de tinción de vidrio en un soporte de placa oscilante y centrifugue el portaobjetos durante 5 min a 200 xg y RT.
  4. Configurar un divisor y proceder con el bloqueo biológico.
    1. Coloque la diapositiva en un divisor de 16 pozos ( Figura 8C ).
    2. Preparar la solución de lavado PBST: 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 + Tween-20 al 0,1%.
    3. Preparar solución de bloqueo biológico (PBS-OVA): 5 mL de PBS, pH 7,4 + 1% de ovoalbúmina de pollo (10 mg / mL).
      NOTA: La elección del reactivo de bloqueo es fundamental para el éxito de la detección de anticuerpos anti-Neu5Gc. La ovoalbúmina se hace en pollos que, al igual que los seres humanos, no pueden sintetizar Neu5Gc, causando una falta de expresión de este Sia. Para la detección de Neu5Gc, incluso los contaminantes menores pueden reducir drásticamente la sensibilidad del ensayo, a veces incluso no detectar cualquier reactividad anti-Neu5Gc. Por ejemplo, el reactivo de bloqueo más comúnmente utilizado, albúmina de suero bovino (BSA), aunque no glicosilado por sí mismo, contiene contaminantes de IgG bovino que portan restos de Neu5Gc y por lo tanto compiten wCon glicanos impresos cuando se unen a la muestra con anticuerpos anti-Neu5Gc 19 , 20 .
    4. Preparar previamente los pozos. Utilizando una pipeta múltiple, colocar alícuotas de 200 μL de PBST en los pocillos deslizantes, colocarlos en una cámara húmeda cubierta y agitar durante 5 min.
      NOTA: La cámara de humedad es una bandeja de vidrio con un papel de toalla húmedo, cubierta con una envoltura de nylon y papel de aluminio para proteger las muestras de la luz.
    5. Retire el PBST haciendo un chasquido y tocando suavemente sobre una toalla de papel limpia y alícuote 200 μl de tampón de bloqueo PBS-OVA en cada pocillo. Colocar en una cámara húmeda e incubar durante 1 h a RT con agitación suave.
  5. Preparar la detección primaria diluida en tampón de bloqueo PBS-OVA, como se indica en la Tabla 2 .
    NOTA: Para la evaluación del control de calidad de este microarray de sialoglucano, utilice varias proteínas de unión de Sia: se espera que la lectina Sambucus nigra (SNA), aislada de corteza de baya de saúco, reconozca a Sia &# 945; 26; Maackia Amurensis Lectina II (MALII) se espera que reconozca Siaα23; Y anti-Neu5Gc IgY de pollo se espera reconocer todos los sialoglucanos que contienen Neu5Gc. Además, utilice varias muestras de suero humano para perfilar la respuesta de IgG anti-Neu5Gc. La concentración de lectinas / anticuerpos / sueros debe calibrarse experimentalmente.
  6. Secar el tampón de bloqueo PBS-OVA y añadir 200 μl de anticuerpo primario por pocillo (volumen mínimo por pocillo: 70 μl), incubar en una cámara húmeda durante 2 h.
  7. Secar la detección primaria en seco y lavar 4 veces con PBST (entre el 3 º y 4 º lavado, incubar la diapositiva en PBST durante 5 minutos en la cámara húmeda). Lavar una vez con PBS.
  8. Preparar el anticuerpo secundario en PBS, como se indica en la Tabla 2 .
  9. Deje secar el PBS y agregue 200 μl de anticuerpo secundario. Incubar durante 1 h a RT con agitación.
  10. Secar el anticuerpo secundario en seco y lavar cuatro veces con PBST (entre los 3Rd y 4 th lavar, incubar la diapositiva en PBST durante 5 min en la cámara húmeda).
  11. Retire con cuidado el marco y coloque los portaobjetos en un tubo de tinción de 50 ml lleno de PBS y agite durante 5 min.
  12. Llene dos baños con manchas de diapositivas ( Figura 8D ) con DIW, coloque la corredera en el porta-portaobjetos y dóblelo dentro del baño. Sumerja rápidamente 10 veces y luego transfiera al segundo baño y báñese 10 veces más. Incubar durante 10 min a TA con agitación.
  13. Deseche el agua y transfiera la diapositiva a un soporte de tinción de vidrio ( Figura 8B adicional , deje que el portaobjetos se seque al aire). Coloque el soporte de tinción de vidrio en un soporte de placa oscilante y centrifugue el portaobjetos durante 5 min a 200 gy RT.
  14. Escanee la diapositiva y guárdela en una caja sellada al vacío en la oscuridad.

6. Escaneado de Array y Análisis de Datos

  1. Abra el escáner fluorescente y deje que se caliente durante 5 min. Abre elEscaneo y análisis de software.
  2. Establezca los parámetros de exploración ( Figura 9A adicional ): exploración a 532 nm y 100% de potencia con una ganancia de 350 PMT, con una línea a la media y una posición de enfoque de 0 μm. Utilice una resolución de tamaño de píxel de 10,0 μm.
    NOTA: Los parámetros de escaneado se pueden ajustar a diferentes tipos de diapositivas, fluorescencia y resolución.
  3. Escanee la diapositiva desarrollada. Abra la puerta del escáner y coloque la diapositiva dentro, la matriz hacia abajo. Inicie el escaneo (botón verde "Reproducir" en el menú del panel de navegación del software, Figura 9B ).
  4. Guarde las diapositivas escaneadas como un archivo tiff.
  5. Prepare la diapositiva para su análisis. Seleccione "Cargar lista de matrices" y cargue el archivo GAL apropiado que mapea los arrays en cada bloque de la diapositiva ( Figura 9C adicional ).
    NOTA: El archivo GAL contiene información sobre la identidad y la ubicación (X, Y) de cada punto de la diapositiva. Este archivo puede ser creadoPor el software de la impresora que exporta un archivo de texto delimitado por tabuladores basado en identidades de muestras en la placa fuente de 384 pocillos y en el diseño de impresión definido.
  6. Establezca los parámetros de alineación y análisis. Pulse el botón "Opción" en el menú del panel de navegación del software ( Figura 10 ).
  7. Defina los parámetros de alineación. Encuentre características circulares, cambie el tamaño de las características durante la alineación de 50 a 350%, limite el movimiento de la entidad a una traducción máxima de 40 μm, desactive las funciones que no superen el umbral de fondo (umbral CPI 0), estime el envolvimiento y rotación al encontrar bloques y automatice el registro de imágenes (10 píxeles) ( Figura 10 suplementaria ).
  8. Definir los parámetros de análisis: relación W1 / 532, desviación estándar normal, analizar las características ausentes, y la resta de fondo. Haga clic en "seleccionar" y luego "Mediana de fondo de característica local" y establezca 2 píxeles para excluir y un ancho de fondo de 3 píxeles de fondo. Presiona OK." SeT el nivel de saturación del escáner al valor predeterminado ( Figura 10 ).
    NOTA: El método de sustracción de fondo depende del diseño experimental y puede modificarse según las necesidades específicas.
  9. Alinee los mapas de características. Ajuste el programa en modo de bloque (presione en "B"), seleccione todos los bloques (Ctrl + A), coloque las cuadrículas del mapa de la matriz y alinee todos los bloques (Alt + Mayús + F7) ( Figura 11 ).
  10. Refinar la alineación de funciones en cada bloque. Zoom (pulse "Z" para entrar en el modo de zoom) en el bloque superior izquierdo, pulse de nuevo "B" (modo de bloque) y pulse la cuadrícula de este bloque. Sólo mueva la cuadrícula de este bloque hasta que se alinee perfectamente con los puntos de bloque y presione F5 para alinear las características en este bloque seleccionado. Repita el movimiento de la rejilla y la alineación F5 hasta que los puntos estén perfectamente circundados. Haga lo mismo para cada uno de los 16 bloques hasta que todas las rejillas estén en su lugar.
  11. Analizar y guardar los datos. Seleccione todos los bloques (Crtl +A) y luego analizar los datos (Alt + A). Guarde los resultados del análisis (Ctrl + U) como un archivo .gpr.
  12. Abra el archivo .gpr guardado en un programa de hoja de cálculo y analizar la intensidad de cada punto basado en la fluorescencia después de la resta de fondo local (F532-B532).

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Resultados

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Impresión, Desarrollo y Análisis de Array:

La impresión de un microarray de sialoglycan con múltiples muestras de glicanos y curvas de IgG de IgG humana en 16 bloques diferentes requiere una calibración completa para asegurar que todas las muestras se impriman lo más uniformemente posible en los 16 bloques por diapositiva y todas las diapositivas en la misma tirada. Por lo tanto, se requieren experimentos de calibración múltiples...

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Discusión

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Una fabricación exitosa de microarray de glycan requiere una planificación cuidadosa e incluye varios pasos importantes en el protocolo. Estos incluyen: (1) la planificación de los diseños de bloques y placas que definen todos los parámetros subsiguientes ( por ejemplo, distancias, espaciado, cantidad de muestras e impresión); (2) limpiar los pasadores y asegurar la integridad del pasador, lo cual es crítico para controlar la homogeneidad del punto; (3) mantener una alta humedad durante la impresión, fundamenta...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado en parte por un Premio de Investigación de Desarrollo de Carrera del Fondo de Investigación de Cáncer de Israel, una subvención de la Iniciativa Nacional de Nanotecnología de Israel y el Helmsley Charitable Trust para un Área de Tecnología Focal en Nanomedicines para Theranostics Personalizada (VP-K) Institutos de Salud R01GM076360 (a XC).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sialoglicanos que contienen amina primariaGlycohub, Inc., Davis, CA, EE. UU. (http://www.glycohub.com/services)Póngase en contacto con info@glycohubusa.com para solicitudes de compuestosGlicanos impresos
Fosfato monosódico monohidratadoSigmaS9638Componente tampón de impresión
Fosfato disódico heptahidratadoSigmaS9390Componente tampón de impresión
Fosfato solución salina tamponadaHy-LabsBP-507/500DTampón de impresión/tampón de incubación/lavado
Tris-baseSigma T1503Reactivo de bloqueo de portaobjetos
GlycerolSigmaG-7893Componente de tampón de impresión
EtanolaminaThermo-Fisher Scientific0700/08Reactivo de bloqueo de portaobjetos
Ovoalbúmina (Grado V)SigmaA5503Proteína bloqueadora de deslizamiento
Tween-20SigmaP7949Detergente de lavado de portaobjetos
Alexa 555-HydrazideThermo-Fisher ScientificA20501MPMarker en matriz
ChromPure IgG humana, molécula enteraJackson Immunoresearch009-000-003Componente de impresión
Biotinilado- SNAVector LaboratoriesB-1305Planta Lectina – unión Sia-alpha2–
Laboratorios de vectoresBiotinilados-MALIIB-1265Lectina vegetal – unión Sia-alpha2 –
Chicken-anti Neu5Gc IgYBioLegend146903Detección primaria
Cy3-StreptavidinJackson Immunoresearch016-160-0848Unión a biotina
Cy3-anti IgG humanaJackson Immunoresearch109-165-088Detección secundaria contra IgG humana
Cy3-anti Chicken IgYJackson Immunoresearch703-165-155Secundaria detección contra pollos IgY
Muestras de sueros humanosBanco de SangreDetección primaria
Nitrógeno comprimido (Grado 5)Herramienta general para desempolvar/secar
Portaobjetos recubiertos de epoxiCorrederas Corning40044Portaobjetos
Recubiertos de epoxiPolyAn2D 104-00-221Diapositivas. En este tipo de portaobjetos, la superficie es más hidrofóbica (en comparación con los portaobjetos de extracción de núcleo), por lo tanto, el tampón de impresión de glicanos necesitaría complementarse con 0,005% Tween-20 para obtener 100 µ Manchas de tamaño m.
Placa de microtitulación de 384 pocillosGenetix2070Plancha de impresión
VWR marcador de laboratorioVWR52877-310Etiquetado de portaobjetos
Tubo de tinciónArrayItMSTHerramienta de revelado de portaobjetos
Baño de tinciónVWR25608-904 Herramienta derevelado de
portaobjetos Portavasos portaobjetosVWR631-9321 Herramienta
de revelado de portaobjetosEscáner GenePixDispositivos moleculares4000BEscáner de diapositivas
LM-60 NanoPrinterArrayItLM-60Pines de impresora
Array ArrayIt946MP3Pines de impresión
Módulo ProPlateGrace Bio-LabsP37004Módulo de revelado de diapositivas
Agua destiladaBio-Lab2321020500Necesario para el arrayer y el humidificador
Multi Pippete Electrónico, 8 Canales, rango de volumen 2-125 μ LThermo-Fisher Scientific (Matrix)MA-2131 Impact2 Equalizer 384Multi pippete para la distribución de muestras en una placa de 384 pocillos
de 6 enlaces de 3 enlaces Israelí

Referencias

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