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Artículo de método

Generación de un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en ratones por la exposición repetida del ozono

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DOI:

10.3791/56095

⸱

25 de agosto de 2017

 ,  ,  , 
1Cellular Biomedicine Group, Shanghai, 2Cellular Biomedicine Group, Cupertino, 3Department of Respiratory Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

En este artículo

Resumen

Este estudio describe la generación exitosa de un nuevo modelo animal de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) exponiendo repetidamente a ratones con altas concentraciones de ozono.

Resumen

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se caracteriza por flujo de aire persistente limitación y pulmón parenquimatosa la destrucción. Tiene una incidencia muy elevada en las poblaciones que envejecen. Las actuales terapias convencionales para EPOC foco principalmente en síntomas medicamentos; por lo tanto, es urgente el desarrollo de nuevas terapias. Modelos animales calificados de EPOC podrían contribuir a caracterizar los mecanismos subyacentes y pueden ser utilizados para detección de drogas nuevas. Modelos actuales de la EPOC, como el lipopolisacárido (LPS) o la elastasa pancreática porcina (PPE)-modelo de enfisema inducido, generar EPOC-como lesiones en los pulmones y vías respiratorias pero no de lo contrario se asemejan a la patogenia de la EPOC humana. Un humo de cigarrillo (CS)-modelo inducido sigue siendo uno de los más populares ya que no sólo simula EPOC-como lesiones en el sistema respiratorio, pero también se basa en uno de los principales materiales peligrosos que causa EPOC en los seres humanos. Sin embargo, los aspectos desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva del modelo CS-inducida dramáticamente limitan su aplicación en la detección de drogas de nuevo. En este estudio, hemos generado con éxito un nuevo modelo de EPOC mediante la exposición de ratones con altos niveles de ozono. Este modelo demostró lo siguiente: 1) disminuido volumen expiratorio forzado 25, 50 y 75/forzado capacidad vital (FEV25/FVC, FEV50/FVC y VEF75/FVC), indicando el deterioro de la función pulmonar; 2) alvéolos del pulmón ampliada, con destrucción parenquimatosa pulmonar; 3) reduce el tiempo de fatiga y la distancia; y 4) aumenta la inflamación. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que el modelo de exposición (OE) de ozono es un modelo confiable que es similar a los seres humanos debido a la sobreexposición de ozono es uno de los factores etiológicos de la EPOC. Además, sólo tomó 6-8 semanas, basados en nuestro trabajo anterior, para crear un modelo de OE, mientras que se requiere de 3 a 12 meses para inducir el modelo de humo de cigarrillo, lo que indica que el modelo de OE puede ser una buena opción para la investigación de la EPOC.

Introducción

Se ha estimado que la EPOC, incluyendo bronquitis crónica y enfisema podría ser la tercera causa de muerte en el mundo en el 20201,2. Se estima la potencial incidencia de EPOC en una población de más de 40 años 12.7% en los hombres y 8,3% en las mujeres dentro de los próximos 40 años3. No hay medicamentos están disponibles para revertir el deterioro progresivo en la EPOC pacientes4. Modelos animales confiables de la EPOC no sólo demandan la imitación del proceso patológico de la enfermedad pero también requieren un período de generación corto. Modelos actuales de la EPOC, incluyendo los LPS o un modelo de EPI-inducida, pueden inducir síntomas de enfisema5,6. Una sola administración o un reto de la semana de LPS o PPE resultados ratones o ratas en marcada neutrofilia en el lavado broncoalveolar (BALF), aumentos de mediadores proinflamatorios (p. ej., TNF-α y IL-1β) en suero, o BALF produce pulmón espacios de aire agrandado de destrucción parenquimatosas y límites aire5,6,7,8,9,10. Sin embargo, LPS o EPI no son causas de EPOC humana y así no imitan el proceso patológico11. Un modelo CS-inducida produce una limitación del flujo de aire persistente, destrucción de parénquima pulmonar y redujo la capacidad de ejercicio funcional. Sin embargo, un protocolo tradicional de CS requiere al menos 3 meses para generar un EPOC modelo12,13,14,15. Por lo tanto, es importante generar un nuevo modelo de animal más eficiente que cumpla los dos requisitos.

Recientemente, además del consumo de cigarrillo, contaminación del aire y la exposición ocupacional se han convertido en causas más comunes de EPOC16,17,18. El ozono, como uno de los principales contaminantes (aunque no es el componente principal de la contaminación atmosférica), directamente puede reaccionar con el tracto respiratorio y dañar el tejido pulmonar de los niños y jóvenes adultos19,20,21 ,22,23,24,25. Ozono, así como otros estimulantes, incluyendo LPS, PPE y CS, participan en un serio de vías bioquímicas de estrés oxidativo pulmonar y daños en el ADN y están vinculadas a la iniciación y la promoción de EPOC26,27. Otro factor es que los síntomas de algunos pacientes con EPOC se deterioran después de estar expuesto al ozono, lo que indica que el ozono puede interrumpir pulmón función18,28,29. Por lo tanto, nos genera un nuevo modelo de EPOC al exponer repetidamente ratones a altas concentraciones de ozono durante 7 semanas; Esto dio lugar a defectos de flujo de aire y daños parenquimatosos pulmonares similares a los de anteriores investigaciones30,31,32. Extendió el protocolo de OE a ratones hembra en este estudio y reproducir con éxito el enfisema en ratones machos en nuestros anteriores estudios30,31,32. Porque ha disminuido la mortalidad de la EPOC en los hombres aumentó en las mujeres en muchos países33, un modelo de EPOC en las mujeres es necesario para estudiar los mecanismos y desarrollar métodos terapéuticos para pacientes EPOC. La aplicabilidad del modelo OE para todos los géneros presta ayuda adicional a su uso como un modelo de EPOC.

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Protocolo

Nota: OE el modelo ha sido generado y utilizado en la investigación previamente divulgados 30 , 31 , 32. Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Jiaotong de Shanghai.

1. ratones

centro
  1. casa libre de patógeno, de 7 a 9 semanas de edad hembra ratones BALB/c en jaulas individuales ventiladas en un animal bajo control temperatura (20 ° C) y humedad (40-60%). Proporcionar un ciclo oscuro 12 h en el centro y 12 h de luz. Proporcionar alimento y agua ad libitum.

2. Ozono o exposición al aire

  1. generar ozono con un generador eléctrico en una caja de acrílico (e.g. plexiglás) sellado. Soplar el aire fuera de la caja con un ventilador pequeño a través de un tubo de ventilación de aire que se conecta en el interior y fuera de la caja. Monitorear la concentración de ozono en la caja usando una sonda de ozono. Espere hasta que la concentración de ozono en el cuadro de alcance 2,5 partes por millón (ppm).
    Nota: La sonda de ozono puede cambiar automáticamente el generador de ozono o apagar y puede mantener el nivel de ozono en la caja de 2,5 ppm.
  2. Colocar los ratones en la caja cuando el nivel del ozono llegue a 2,5 ppm. Mantener los ratones en el cuadro de 3 h cada vez para exponer al ozono.
    Nota: El cuadro puede mantener un nivel de 2,5 ppm de ozono durante 3 h desconectando automáticamente el generador de ozono o desactivar y soplar el CO 2 que es producido por los ratones fuera de la caja.
  3. Dar dos exposiciones de ozono (cada exposición duración 3 h) por semana (una vez cada 3 días) por 7 semanas, exponer los ratones de control al aire al mismo tiempo y en el mismo periodo.

3. La tomografía computada micro

  1. al final de la semana 7, anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0.8 ml/100 g) ajustar la dosis según situaciones individuales para ver que el ratón no responder a un pellizco del dedo del pie. Monitor y mantenga el ratón a una frecuencia constante de la respiración; y asegúrese de que no hay movimientos voluntarios existen durante los procedimientos de.
  2. Colocar los ratones anestesiados en la cámara de una tomografía micro computada (µCT).
  3. Calibrar el µCT usando el protocolo estándar y el fabricante ' instrucciones. Fijar el tubo de rayos x a 50 kV y la corriente en 450 μA.
    Nota: Tanto los rayos x y el detector giran alrededor de los ratones.
  4. Realizar el análisis µCT mediante la adquisición de 515 proyecciones con un tamaño de píxeles efectivos de 0,092 mm, un tiempo de exposición de 300 ms para una rebanada y una rebanada de 0,093 mm.
  5. Reconstruir el pulmón con las imágenes adquiridas mediante un software. Ajustar brillo de la imagen en escala de grises fijando el mínimo y máximo de la escala de grises en unidades Hounsfield-750 y-550, respectivamente.
    Nota: El software automáticamente calcula los volúmenes de la parenquimia de pulmón y el área de baja atenuación (LAA) 34 , 35.
  6. Calcular el porcentaje de LAA (LAA %) dividiendo el volumen LAA por el volumen pulmonar total.

4. prueba de la cinta de correr

  1. dan los ratones una adaptación de prueba a una velocidad de 10 m/min durante 10 min en una corriente cinta de la máquina. Nota: la electricidad siempre está apagado cuando el procedimiento se lleva a cabo.
  2. administrar un prueba de fatiga a los ratones.
    1. Calentar los ratones a una velocidad de 10 m/min por 5 min
    2. Aumentar la velocidad a 15 m/min durante 10 minutos
    3. Aumentar la intensidad del ejercicio: aumenta la velocidad de 5 m/min, a partir de 20 m/min, cada 30 min hasta ratones no puede continuar funcionando 36.
  3. Registrar el total de distancia corriente y tiempo de funcionamiento como distancia de fatiga y cansancio tiempo, respectivamente.

5. medidas de función pulmonar

  1. anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0.8 ml/100 g) ajustar la dosis según situaciones individuales para ver que el ratón no no responder a un pellizco del dedo del pie y espere hasta que los ratones han mantenido espontáneo respiración. Monitor y mantienen el ratón a una frecuencia constante de la respiración; y asegúrese de que no hay movimientos voluntarios existen durante los procedimientos de.
  2. Tracheostomize los ratones cuidadosamente y colocarlos en un pletismógrafo de cuerpo conectado a un ventilador controlado por ordenador.
    Nota: La ventilación es controlada mediante una válvula situada proximalmente al tubo endotraqueal. La configuración proporciona diferentes maniobras semiautomáticas, incluyendo la maniobra de la cuasi-estática presión volumen y la maniobra de flujo rápido del volumen de la.
  3. Imponer un promedio de frecuencia de 150 respiraciones/min hasta el ratón anestesiado mediante ventilación controlada por presión hasta un patrón de respiración regular la respiración y expiración completa en cada ciclo de respiración se obtiene.
  4. Realizar la maniobra de presión-volumen cuasi-estático con el dispositivo mediante la presión negativa generada en el pletismógrafo.
  5. Realizar la maniobra de volumen de flujo dentro de los lazos de la cuasi-estática de presión-volumen a grabar la FVC y el FEV. Inflar el pulmón + 30 cm H 2 O e inmediatamente después conectarlo a una presión altamente negativa para hacer valer la caducidad hasta el volumen residual es el VEF en el primer 25, 50 y 75 ms de la exhalación (FEV 25-30 cm H 2 O. expediente FEV 50 y 75 de la FEV, respectivamente). Rechazar las maniobras subóptimas. Para cada prueba con cada ratón, realizar un mínimo de tres maniobras aceptables para obtener una media fiable para todos los parámetros numéricos.

6. Colección de BALF

  1. tras anestesia terminal con pelltobarbitalum natricum ((1%, 1.8-2.4 ml/100 g) ajustar la dosis según situaciones individuales al ver que el ratón no responde a un pellizco del dedo del pie y perder el aliento), lavado del ratones con 2 mL de PBS a través de un tubo endotraqueal de 1 mm de diámetro y luego recuperar el BALF 10.
  2. Piscina las alícuotas obtenido el lavado y centrifugar a 4 ° C y 250 x g durante 10 minutos
  3. Recoger el sobrenadante para su uso inmediato y almacenar el resto a-80 ° C o líquido nitrógeno.
  4. Cuenta el número total de células usando un hemocitómetro.
  5. Resuspender el precipitado de células en PBS y luego giro (1.400 x g, 6 min) 250 μl de células resuspendidas en diapositivas utilizando una centrífuga de spinner diapositiva.
  6. Tinción de Wright se aplican a las células en el portaobjetos según el fabricante ' Protocolo s.
  7. 200 células por ratón; identificar las células como los macrófagos o neutrófilos, según morfología estándar, bajo 400 aumentos; y sus números de la cuenta.

7. Muestreo de sangre cardiaca

  1. recoger la sangre mediante punción cardiaca, carga en tubos de 1,5 mL y mantenerlo en hielo durante 30 minutos
  2. Centrifugar las muestras de sangre durante 5 min a 2.000 x g y 4 ° C.
  3. Transferir el sobrenadante (suero) a un tubo nuevo y conservarlo a-80 ° C o líquido nitrógeno.
  4. Preparar el suero de IL-1β, IL-10 y pruebas de detección de TNF-α utilizando los respectivos kits ELISA.

8. Análisis morfométrico de pulmón

  1. diseccionar los pulmones y el traquear de los ratones.
    1. Posición cada eutanasia ratón sobre un tablero quirúrgico inmediatamente después del sacrificio.
    2. a diseccionar el platisma y los músculos traqueales anteriores para visualizar y acceder a los anillos traqueales.
    3. Abierta a la torácica de la cavidad. Diseccionar los pulmones y la tráquea, pero no separar el corazón de los pulmones.
  2. Conectar el catéter endotraqueal a una jeringa con paraformaldehído al 4% a través de un tubo de polietileno PE90.
    PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxico. Use guantes y gafas de seguridad y utilizar la solución dentro de una campana de humos.
  3. Inflar el pulmón completamente con paraformaldehído al 4% (10 gotas, ~ 200 μL) a través del catéter endotraqueal. Quitar el corazón después de la terminación de la inflación.
  4. Mantener el pulmón en un tubo de 15 mL que contiene 10 mL de paraformaldehído al 4% para al menos 4 h.
  5. Incrustar el pulmón en parafina. Obtener secciones de 5 μm por el bloque de parafina de seccionamiento con un micrótomo rotatorio. Durante el seccionamiento, exponer la máxima superficie de tejido pulmonar dentro del área del árbol bronquial.
  6. Para el análisis morfométrico, realizar hematoxilina y eosina (H & E) manchas en las secciones de.
  7. Las secciones de la imagen con un microscopio de campo brillante vertical (objetivo, 20 X, tiempo de exposición, ms 1,667).
  8. Tienen dos investigadores cegados en el protocolo de tratamiento independientemente contar las secciones histológicas. Utilizar la intercepción lineal media (L m) como un parámetro para medir la distancia de la pared septal alveolar entre. Determinar el L m siguiendo estos pasos:
    1. Abra las imágenes de las secciones en Photoshop y dibujar una cuadrícula de la retícula en la imagen con líneas largas de cinco 550 μm.
    2. Contar el número de alvéolos a través de la línea de la red.
    3. Calcular el L m dividiendo la longitud de la línea de la cuadrícula el número de alvéolos. Para la cuantificación, imagen de cinco secciones por ratón. Adquirir diez imágenes de cada sección (una imagen por campo) y evaluar al azar. Durante la selección del terreno, evitar los campos de las vías respiratorias y los vasos moviendo un campo adelante o en otra dirección.
      Nota: Los datos se presentan como la media ± SEM Se realizó una prueba de t no pareada para comparación entre ratones expuestos al aire y los ratones expuestos al ozono. Tres animales de cada grupo se utilizaron para calcular la diferencia significativa. Un valor de p < 0.05 se consideró significativo.

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Resultados

Ejemplos de imágenes 3D µCT de cada grupo se muestran en la figura 1un. Los ratones expuestos al ozono tenían un volumen pulmonar total significativamente mayor (figura 1a y b) y LAA % (figura 1c) de los ratones de control expuestos al aire. La capacidad pulmonar y LAA % seguían elevadas después de seis semanas de la exposición de ozono

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Discusión

En este estudio, presentamos un método confiable para la generación de un nuevo modelo de EPOC. En comparación con otros modelos (es decir, LPS o modelos de EPI), este modelo de OE recapitula el proceso patológico de pacientes con EPOC. Porque el humo del cigarrillo es el principal material peligroso que causa EPOC en pacientes humanos con40, el modelo CS sigue siendo el más popular EPOC modelo41,42. Sin embargo, el modelo CS requ...

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Divulgaciones

Z.W.S. y W.W. son empleados actuales y los titulares de opciones sobre acciones del grupo de Biomedicina celular (NASDAQ: CBMG). Otros autores declaran que no tienen intereses que compiten.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Sr. Boyin Qin (Shanghai pública Health Clinical Center) para la asistencia técnica para la evaluación µCT en el presente Protocolo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ratones BALB/cSlac Laboratory Animal,Shanghai, ChinaN/ABALB/c hembra de 7 a 9 semanas de edad.
Jaulas ventiladas individualesSuhang, Shanghai, ChinaNúmero de modelo: MU64S7Las jaulas se utilizaron para alojar ratones en el animalario.
Sellado de la caja de metacrilatoSuhang, Shanghai, ChinaN/ALa caja se utilizó" para contener el generador de ozono. Los ratones fueron expuestos al ozono dentro de la caja.
Generador eléctricoSander Ozonizador, Uetze-Eltze, AlemaniaModelo 500 El dispositivo se utilizaba para generar ozono.
Sonda de ozonoATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Gran Manchester, Reino UnidoOzono 300El dispositivo se utilizó para monitorear y controlar la generación de ozono.
Pelltobarbitalum natricumSigma, St. Louis, MO, EE.UU.P3761Los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum.
Micro-Tomografía ComputarizadaGE Healthcare, Londres, ON, CanadáRS0800639-0075Este dispositivo se utilizó para adquirir imágenes del pulmón.
Micro-view 2.01 ABA software GEHealthcare, Londres, ON, CanadáMicro-view 2.01 Este dispositivo se utilizó para reconstruir el pulmón y analizar el volumen de la OAI del pulmón.
Máquina de cinta de correr Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, ChinaDSPT-208Esta máquina fue utilizada para la prueba de fatiga.
Pletismógrafo corporaleSpira™ Sistema de Maniobras Forzadas, EMMS, Edimburgo, Reino UnidoSistema de Maniobras ForzadasEste dispositivo se utilizó para evaluar la función pulmonar de la espirometría.
VentiladoreSpira™ Sistema de Maniobras Forzadas, EMMS, Edimburgo, Reino UnidoSistema de Maniobras ForzadasEste dispositivo se utilizó para evaluar la función pulmonar de la espirometría.
Centrífuga giratoria deslizanteDenville Scientific, Holliston, MA, EE. UU. C1183 Se utilizaba para hacer girar las células BALF en portaobjetos.
Tinción de WrightHanhong, Shanghái, ChinaRE04000054  Se utilizó para teñir macrófagos y neutrófilos en el BALF suspendido.
HemocitómetroHausser Scientific, Horsham, PA, EE.UU. 4000Se utilizaba para contar células.
IL-1 y beta;Abcam, Cambridge, MA, EE. UUAB100704Se utilizaron para probar los factores respectivos en suero.
IL-10Abcam, Cambridge, MA, USAab46103Se utilizaron para probar los factores respectivos en el suero.
TNF-y alfa;Abcam, Cambridge, MA, EE. UU. ab100747Se utilizaron para probar los factores respectivos en suero.
Paraformaldehído Sigma, St. Louis, MO, EE.UUP6148El pulmón fue inflado con un 4% de paraformaldehído.
ParafinaHualing, Shanghái, China56#Se utilizaba para incrustar el pulmón.
Microtomo rotatorioLeica, Wetzlar,  Hesse, AlemaniaRM2255Se utilizaba para seccionar el pulmón.
Hgaematoxilina y eosina (H& E) solución de tinciónSolarbio, Pekín, ChinaG1120H& Para el análisis morfométrico se realizó tinción E.
Microscopio vertical de campo claroOlympus, Center Valley, PA, EE. UUCX41Se utilizó para obtener imágenes de la H& E portaobjetos de tinción.
Adobe Photoshop 12Adobe, San José, CA, EE. UUAdobe Photoshop 12Se utilizó para contar el número de alvéolos en el H& E Imágenes manchadas.
Prisma GraphPad 5Graphpad Software Inc., San Diego, CAPrisma GraphPad 5Se utilizó para el análisis de datos y la producción de figuras.
En este estudio se utilizaron ratones . . . .

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