Summary
Deze studie beschrijft de succesvolle generatie voor een nieuwe diermodel van chronische obstructieve longziekte (COPD) door muizen aan hoge concentraties van ozon herhaaldelijk bloot te leggen.
Abstract
Chronische obstructieve longziekte (COPD) wordt gekenmerkt door aanhoudende luchtstroom beperking en Long parenchymal vernietigen. Het heeft een zeer hoge incidentie in populaties veroudering. De huidige conventionele therapieën voor COPD focus vooral op symptoom-aanpassen drugs; de ontwikkeling van nieuwe therapieën is dus dringend noodzakelijk. Gekwalificeerde diermodellen van COPD kunnen bijdragen aan het karakteriseren van de onderliggende mechanismen en kunnen worden gebruikt voor nieuwe drug screening. Huidige modellen van de COPD, zoals lipopolysaccharide (LPS) of de varkens Pancreas elastase (PPE)-geïnduceerde emfyseem model, genereren van COPD-achtige letsels in de longen en de luchtwegen, maar doen niet anders lijken op de pathogenese van menselijke COPD. Een sigarettenrook (CS)-geïnduceerde model blijft een van de populairste, omdat het niet alleen COPD-achtige letsels in de luchtwegen simuleert, maar het is ook gebaseerd op één van de belangrijkste gevaarlijke materialen die COPD veroorzaakt bij de mens. Echter beperken de tijdrovend en arbeidsintensief aspecten van het CS-geïnduceerde model drastisch de toepassing ervan in nieuwe drug screening. In deze studie werd gegenereerd we met succes een nieuw model van de COPD door muizen tot hoge niveaus van ozon bloot te leggen. Dit model het volgende aangetoond: 1) geforceerde expiratoire 25, 50 en 75/forced vital capaciteit van het volume daalde (FEV25/FVC, FEV50/FVC en FEV75/FVC), met vermelding van de achteruitgang van de longfunctie; 2) uitgebreide Long longblaasjes met Long parenchymal vernietiging; 3) verminderde vermoeidheid tijd en afstand; en 4) verhoogd van ontsteking. Samen genomen, blijkt deze gegevens dat de ozonlaag blootstelling (OE) model een betrouwbare dierlijk model dat is vergelijkbaar met mensen omdat ozon overbelichting is één van de etiologische factoren van COPD. Bovendien, duurde het slechts 6-8 weken, gebaseerd op onze eerdere werk, een OE om model te maken, terwijl het 3 tot 12 maanden voor het opwekken van het model van sigarettenrook, die aangeeft dat de OE-model zou kunnen een goede keuze voor COPD onderzoek zijn vereist.
Introduction
Er wordt geschat dat COPD, emfyseem en chronische bronchitis, misschien wel de derde belangrijkste doodsoorzaak in de wereld in 20201,2. De potentiële incidentie van COPD in een populatie ouder dan 40 jaar wordt geschat op 12,7% bij mannen en 8,3% bij vrouwtjes binnen de komende 40 jaar3. Geen medicijnen zijn momenteel beschikbaar voor het omkeren van de progressieve verslechtering van COPD patiënten4. Betrouwbare diermodellen van COPD niet alleen eisen de nabootsing van de ziekte pathologisch proces maar ook vereisen een korte generatie periode. Huidige COPD-modellen, met inbegrip van de LP's of een PPE-geïnduceerde model, kunnen veroorzaken emfyseem-achtige symptomen5,6. Eenmalige toediening of een week-lange uitdaging van LPS of PPE muizen of ratten resulteert in duidelijke neutrophilia in de bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF), verhogingen pro-inflammatoire mediatoren (b.v., TNF-α en IL-1β) in de BALF of serum, produceert Long parenchymal vernietiging, uitgebreide luchtruimten, en grenzen luchtstroom5,6,7,8,9,10. Echter LPS of PPE zijn geen oorzaken van menselijke COPD en dus doen niet na te bootsen de pathologische proces11. Een CS-geïnduceerde model geproduceerd een persistente luchtstroom beperking, Long parenchymal vernietiging en verminderde functionele oefening capaciteit. Een traditionele CS-protocol vereist echter ten minste 3 maanden voor het genereren van een COPD model12,13,14,15. Het is dus belangrijk voor het genereren van een nieuwe, efficiëntere diermodel die voldoet aan de twee eisen.
Onlangs, naast het roken van sigaretten, luchtverontreiniging en beroepsmatige blootstelling meer voorkomende oorzaken van COPD16,17,18zijn geworden. Ozon, als een van de belangrijkste verontreinigende stoffen (hoewel niet de belangrijkste component van luchtverontreiniging) kan direct reageren met de luchtwegen en beschadiging van het longweefsel voor zowel kinderen en jonge volwassenen19,20,21 ,22,23,24,25. Ozon, evenals andere stimulatoren waaronder LPS, PPE en CS, zijn betrokken in een ernstig van biochemische pathways van pulmonaire oxidatieve stress en DNA-beschadiging en zijn gekoppeld aan de inleiding en de bevordering van COPD26,27. Een andere factor is dat de symptomen van sommige COPD-patiënten verslechteren na wordt blootgesteld aan ozon, die aangeeft dat ozon Long functie18,28,29kan verstoren. Dus, we een nieuw model van de COPD gegenereerd door herhaaldelijk bloot muizen aan hoge concentraties van ozon voor 7 weken; Dit resulteerde in de luchtstroom gebreken en longschade parenchymal lijken op die van eerdere onderzoeken30,31,32. Wij uitgebreid het OE-protocol tot vrouwelijke muizen in deze studie en gereproduceerd met succes de emfyseem waargenomen bij mannelijke muizen in onze eerdere studies30,31,-32. Omdat COPD sterfte gedaald bij mannen maar verhoogd bij vrouwen in vele landen33, een COPD-model bij vrouwtjes is nodig om te studeren van de mechanismen en methoden te ontwikkelen therapeutische voor vrouwelijke COPD patiënten. De toepasbaarheid van het model van de OE voor alle geslachten leent verdere steun aan het gebruik ervan als een COPD-model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: de OE-model heeft zijn gegenereerd en gebruikt in reeds gerapporteerde onderzoek 30 , 31 , 32. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Shanghai Jiaotong University.
1. muizen
- huis pathogenen vrije, 7 - tot 9-week-oude vrouwelijke BALB/c muizen in individuele geventileerde kooien in een dier faciliteit onder gecontroleerde temperatuur (20 ° C) en luchtvochtigheid (40-60%). Bieden een 12 uur licht en 12 uur donker cyclus in de faciliteit. Voedsel en water ad libitum.
2. Ozon of Air blootstelling
- genereren ozon met een elektrische generator in een doos (bijvoorbeeld Perspex) acryl afdichting. Het blazen van de lucht uit de doos met behulp van een kleine lucht blower door een air vent buis die gekoppeld is aan de binnenkant als buitenkant van de doos. De concentratie van ozon in de doos met behulp van een sonde van ozon te volgen. Wacht tot de concentratie van ozon in het vak 2,5 delen per bereikt miljoen (ppm).
Opmerking: De sonde ozon kan automatisch schakelen tussen de ozon-generator in- of uitschakelen en kunt het beschermingsniveau ozon in het vak 2,5 ppm. - Plaatst de muizen in het vak wanneer de hoeveelheid ozon 2,5 ppm bereikt. Laat de muizen in het vak voor 3U telkens om hen bloot te stellen aan ozon.
Opmerking: Het vak kan handhaven een ozon 2,5 ppm gedurende de 3 uur door de ozon generator automatisch over te schakelen in- of uitschakelen en waait de CO 2 die wordt geproduceerd door de muizen uit de doos. - Geven twee ozon posities (elke blootstelling gedurende 3U) per week (een keer om de 3 dagen) voor 7 weken; de controle muizen in de lucht tegelijkertijd en voor dezelfde periode bloot.
3. Micro-berekend tomografie
- anesthetize aan het einde van week 7, de muizen met een intraperitoneale injectie pelltobarbitalum chloorverbinding (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) aanpassen van de dosis volgens individuele situaties om te zien dat de muis niet reageren op een teen snuifje. Monitor en houd de muis op een regelmatige ademhaling frequentie; en zorg ervoor dat geen vrijwillige bewegingen bestaan gedurende de procedures.
- Plaats van de narcose muizen in de kamer van een micro-berekend tomografie (µCT).
- Kalibreren de µCT met behulp van het standaard protocol en de fabrikant ' s instructies. De röntgenbuis vastgesteldop 50 kV en de stroom bij 450 µA.
Opmerking: Zowel de röntgenfoto en de detector draaien rond de muizen. - De µCT analyses uit te voeren door de overname van 515 prognoses met een effectieve pixelgrootte van 0.092 mm, een belichtingstijd van 300 ms voor één segment, en de dikte van een segment van 0.093 mm.
- Reconstrueren de longen met de verworven beelden met behulp van een software. De grijswaarden beeld helderheid aanpassen door de vaststelling van het minimum en het maximum van de grijswaarde op Hounsfield-eenheden,-750 en-550, respectievelijk.
Opmerking: De software wordt automatisch berekend met de volumes van de Long parenchym en de lage-demping gebied (LAA) 34 , 35. - Bereken het percentage van LAA (LAA %) door het verdelen van het LAA-volume door het volume van de totale longkanker.
4. Loopband Test
- geven de muizen een aanpassing bij een snelheid van 10 m/min gedurende 10 minuten op een lopende loopband machine. Opmerking testen: de elektriciteit is altijd af wanneer de procedure wordt gevoerd.
- beheren een vermoeidheid test met de muizen.
- De muizen met een snelheid van 10 m/min gedurende 5 minuten opwarmen
- De snelheid verhogen tot 15 m/min gedurende 10 minuten
- Verhogen de trainingsintensiteit: verhoging van de snelheid door 5 m/min, vanaf 20 m/min, elke 30 min tot muizen kan niet worden uitgevoerd 36.
- De totale uitgevoerd afstand en tijd als vermoeidheid afstand en tijd van de vermoeidheid, respectievelijk opnemen.
5. pulmonaire functie metingen
- Anesthetize de muizen met een intraperitoneale injectie pelltobarbitalum chloorverbinding (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) aanpassen van de dosis volgens individuele situaties om te zien dat de muis doet niet reageren op een snuifje teen en wachten tot de muizen hebben volgehouden spontane ademhaling. Monitor en houd de muis op een regelmatige ademhaling frequentie; en zorg ervoor dat geen vrijwillige bewegingen bestaan gedurende de procedures.
- Zorgvuldig de muizen tracheostomize en plaats ze in de plethysmograph van een lichaam dat is aangesloten op een computer gestuurde ventilator.
Opmerking: Ventilatie wordt beheerd via een ventiel proximally gelegen aan de Endotracheale tube. De instelling biedt verschillende semi-automatische manoeuvres, met inbegrip van de manoeuvre van de quasi-statische druk-volume en de manoeuvre van de snelle stroom volume. - Leggen gemiddeld ademhaling frequentie van 150 adem/min aan de narcose muis via druk-gecontroleerde ventilatie tot een regelmatige ademhaling patroon en volledige vervaldatum bij elke ademhaling cyclus wordt verkregen.
- De quasi-statische druk-volume-manoeuvre uitvoeren met het apparaat met behulp van de negatieve druk gegenereerd in de plethysmograph.
- Voeren de snelle stroom volume manoeuvreren binnen de quasi-statische druk-volume-lussen om de FVC- en de FEV te registreren. Opblazen van de longen naar + 30 cm H 2 O en onmiddellijk daarna verbinding maken het tot een zeer negatieve druk om af te dwingen verlopen totdat het restvolume op-30 cm H 2 O. Record de FEV in de eerste 25, 50 en 75 ms van uitademing (FEV 25 is FEV 50 en FEV 75, respectievelijk). Verwerpen de suboptimaal manoeuvres. Voor elke test met elke één muis, voeren een minimum van drie aanvaardbaar manoeuvres te verkrijgen van een betrouwbare gemiddelde voor alle numerieke parameters.
6. BALF collectie
- na terminal anesthesie met pelltobarbitalum chloorverbinding ((1%, 1.8-2.4 ml/100 g) aanpassen van de dosis volgens individuele situaties om te zien dat de muis niet op een snuifje teen reageren en verliezen van de adem), lavage de muizen met 2 mL PBS via een 1 diameter mm endotracheale buis en vervolgens ophalen de BALF 10.
- Zwembad de opgehaalde lavage aliquots samen en centrifugeer ze bij 4 ° C en 250 x g gedurende 10 minuten
- Verzamelen het supernatant voor onmiddellijk gebruik en opslaan van de rest op-80 ° C of vloeibare stikstof.
- Telling van het totale aantal cellen met behulp van een hemocytometer.
- Resuspendeer de cel pellet in PBS en vervolgens draai (1.400 x g, 6 min) 250 µL van de geresuspendeerde cellen op dia's met behulp van een centrifuge dia. kringveld.
- Toepassing Wright kleuring aan cellen op de dia's volgens de fabrikant ' s-protocol.
- 200 cellen per muis tellen; de cellen worden geïdentificeerd als neutrofiele granulocyten, macrofagen volgens standaard morfologie, onder 400 X vergroting; en hun getallen tellen.
7. Cardiale bloedmonsters
- verzamelen van bloed via cardiale punctie, laden in 1.5-mL buizen, en houd het op ijs voor 30 min.
- Centrifugeren van de bloedmonsters voor 5 min op 2.000 x g- en 4 ° C.
- Het supernatant (serum) overbrengen naar een nieuwe buis en sla deze op-80 ° C of vloeibare stikstof.
- Het serum voorbereiden IL-1β, IL-10 en TNF-α detectietests met behulp van de respectieve ELISA kits.
8. Long Morfometrische analyse
- ontleden de longen en de tracheas van de muizen.
- Plaats elke euthanized muis op een chirurgische bord onmiddellijk achter offer.
- Ontleden weg de platysma en anterior tracheale spieren om te visualiseren en toegang tot de tracheale ringen.
- Open van de thoracale holte. Ontleden van de longen en de luchtpijp, maar niet het hart van de longen doen scheiden.
- De Endotracheale katheter verbinden met een injectiespuit met 4% paraformaldehyde door een PE90 polyethyleen buis.
Let op: Paraformaldehyde is giftig. Draag handschoenen en veiligheidsbril en gebruik van de oplossing in een zuurkast. - Blazen de longen volledig met behulp van 4% paraformaldehyde (10 druppels, ~ 200 µL) via de Endotracheale katheter. Verwijderen van het hart na de voltooiing van de inflatie.
- Behouden de Long in een tube van 15 mL met 10 mL 4% paraformaldehyde voor ten minste 4 h. De Long inbedden
- in paraffine. 5-µm secties verkrijgen door paraffine blok met rotary microtome segmenteren. Tijdens de afdelen, bloot de maximale oppervlakte van longweefsel binnen het gebied van de bronchiale boom.
- Voor Morfometrische analyse, verrichten haematoxyline en eosine (H & E) kleuring op de baanvakken.
- Beeld van de secties met een helder-veld rechtop Microscoop (objectief, 20 X; belichtingstijd, 1.667 ms).
- Hebben twee onderzoekers verblind bij het protocol van behandeling onafhankelijk tellen de histologische secties. Gebruik de gemiddelde lineaire snijpunt (L m) als parameter voor het meten van de afstand van de Inter alveolaire septal wall. Bepalen van de L-m met behulp van de volgende stappen uit:
- de beelden van de secties in Photoshop opent en tekent u een tasje-raster in de afbeelding met de lange lijnen vijf 550 µm.
- Het aantal longblaasjes over de rasterlijn. De L-m berekenen
- door de lengte van de rasterlijn te delen door het aantal longblaasjes. Afbeelding voor kwantificering, vijf secties per muis. Verwerven van tien beelden van elke sectie (één afbeelding per veld) en willekeurig te beoordelen. Tijdens veldselectie, velden van airways en vaartuigen te voorkomen door het bewegen van één veld vooruit of in een andere richting.
Opmerking: De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± S.E.M. Een VN-gepaarde t-test werd uitgevoerd ter vergelijking tussen lucht-blootgesteld muizen en muizen ozon-blootgesteld. Drie dieren van elke groep werden gebruikt voor het berekenen van de significant verschil. Een p-waarde van < 0.05 werd beschouwd als belangrijke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorbeelden van 3D µCT beelden van elke groep worden weergegeven in Figuur 1een. De ozon-blootgesteld muizen had een aanzienlijk grotere totale Long volume (Figuur 1een en b) en LAA % (Figuur 1c) dan deed de muizen controle lucht-blootgesteld. Het volume van de longen en de LAA % bleef verhoogde na zes weken van ozon blootstelling31,32. Verhoogde Long volume en LAA % vertegenwoordigen het fenotype van emfyseem. Voorbeelden van longkanker alveolaire uitbreiding in Figuur 2een illustreren de vorming van emfyseem. Een toename van de gemiddelde lineaire snijpunt (Lm) werd waargenomen in ozon-blootgesteld muizen (Figuur 2,b), die bevestigd dat Long parenchymal vernietiging vond plaats na blootstelling van ozon.
Longfunctie werd gemeten door de luchtstroom tarief parameters, weergegeven als FEV25/FVC, FEV50/FVC en FEV75/FVC. De resultaten toonden dat alle parameters die in ozon-blootgesteld muizen (Figuur 3a-c daalde) consistent met de typische Long functionele defecten in COPD patiënten4,37waren. Om verdere evaluatie van de OE-model, voerden we een tolerantie inspanningstest die vervangen voor de 6-min walk from Hotel test (6MWT)38,39, die wordt gebruikt bij het beoordelen van wijzigingen in de hoedanigheid van functionele oefening bij COPD patiënten. De ozon-blootstelling aanzienlijk daalde de vermoeidheid tijd en vermoeidheid afstand (Figuur 4een en b).
Om aan te pakken van de pathogenese van COPD in de OE-model, werden de macrofagen en neutrofielen gerekend vanaf de BALFs van de muizen; pro-inflammatoire cytokines (IL-1β en TNF-α) en anti-inflammatoire cytokines (IL-10) werden ontdekt in de muis sera. De ozon-blootgesteld muizen toonde een aanzienlijke toename van ontstekingscellen, met inbegrip van de macrofagen en neutrofielen (Figuur 5a-c), evenals een significante afname van de IL-10 en een toename van IL-1β en TNF-α (Figuur 6a-c ). Alle gegevens blijkt dat de OE model gerecapituleerd menselijke COPD-achtige symptomen.
Figuur 1. Ozon blootstelling stegen het volume van de Long en de LAA % gedetecteerd door µCT. (a) representatieve 3D afbeeldingen tonen de longen van lucht - of ozon-blootgesteld muizen op 7 weken na de respectieve blootstelling. (b) afzonderlijke totale Long volumes van de twee groepen werden gehaald uit de 3D-beelden voor statistieken. Ozon-blootgesteld muizen toonde een aanzienlijke toename in totale Long volume. (c) de individuele en de gemiddelde LAA % van de twee groepen. Ozon-blootgesteld muizen toonde een aanzienlijke stijging in LAA %. De rode kleur duidt LAA (voxels met dichtheden van 2,550-2.700 Hounsfield eenheden). De luchtpijp en de bronchi rood weergegeven in deze figuur werden verwijderd om te berekenen van de Long LAA. De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± S.E.M. ** P < 0,01, *** P < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Ozon blootstelling verhoogd de Lm. (a) representatieve microfoto van longkanker alveolaire ruimtes in HE gebeitste secties van lucht-blootgesteld of ozon-blootgesteld muizen. (b) afzonderlijke waarden van Lm werden gekwantificeerd van de Long-secties van de twee groepen voor statistieken. Een toename van de Lm werd waargenomen in muizen ozon-blootgesteld. De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± S.E.M. ** P < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Ozon blootstelling daalde pulmonaire functie. (a-c) Voor zowel de lucht-blootgesteld en de ozon-blootgesteld muizen, de individuele FEV in de eerste 25, 50 en 75 ms van snel verlopen (FEV25, FEV50en FEV75, respectievelijk), evenals de FVC, waren allemaal gelogd. De percentages van FEV25, FEV50en FEV75 tot FVC werden afzonderlijk berekend. FEV25/FVC, FEV50/FVC en FEV75/FVC alle daalde aanzienlijk in ozon-blootgesteld muizen. De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± S.E.M. * P < 0,05, ** P < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Ozon blootstelling daalde vermoeidheid tijd en afstand van de vermoeidheid. (a) individuele lopen tijden voor lucht - of ozon-blootgesteld muizen werden geregistreerd. Ozon-blootgesteld muizen toonde een significante afname in de tijd van de vermoeidheid. (b) afzonderlijke lopende afstanden van de twee groepen werden geregistreerd. Ozon-blootgesteld muizen tentoongesteld een significante afname van de vermoeidheid afstand. De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± S.E.M. * P < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Ontstekingscellen gerekend vanaf BALF. (a) individuele en de gemiddelde cijfers van totaal aantal cellen (totaal) in de lucht - of ozon-blootgesteld muizen. (b) de individuele en de gemiddelde aantallen macrofagen (MAC) in de twee groepen. (c) de individuele en de gemiddelde aantal neutrofielen (NEU) in de twee groepen. De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± S.E.M. * P < 0,05, ** P < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Inflammatoire en anti-inflammatoire cytokine detectie in serum. (a) individuele en de gemiddelde waarden van de hoeveelheid van de IL-10 in de lucht - of ozon-blootgesteld muizen. (b) de individuele en de gemiddelde waarden van de hoeveelheid van de IL-1β in de twee groepen. (c) de individuele en de gemiddelde waarden van het bedrag van TNF-α in de twee groepen. De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± S.E.M. * P < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie presenteren we een betrouwbare methode voor het genereren van een nieuw model van COPD. In vergelijking met andere modellen (dat wil zeggen, LP's of modellen beschermingsmiddelen), recapituleert dit model OE de pathologische proces van COPD patiënten. Omdat sigarettenrook het belangrijkste gevaarlijke materiaal dat ervoor zorgt dat COPD in menselijke patiënten40 is, blijft het CS-model de meest populaire COPD model41,42. Het CS-model vereist echter een 3 - tot 12-maand R & D periode voor nieuwe geneesmiddelen. Vergeleken met het CS-model, vermindert het huidige model van de OE de generatie periode tot 6-8 weken. We hebben emfyseem bij mannelijke muizen waargenomen na 6 weken van blootstelling aan ozon in onze eerdere studies30,31,-32. In deze studie, wij het OE-protocol toegepast op vrouwelijke muizen voor 7 weken en een vrouwelijke OE-model gegenereerd. Want het is gemeld dat COPD sterfte bij mannen daalde maar verhoogd bij vrouwen in sommige landen33, is het noodzakelijk te bestuderen van de pathogene mechanismen en benaderingen te ontwikkelen genezen voor vrouwelijke COPD patiënten met behulp van een vrouwelijke COPD-model. We weten dat de bovengenoemde COPD modellen (dat wil zeggen, LPS, PPE en CS) in zowel mannelijke en vrouwelijke dieren43 werken kunnen. Het doel van dit werk was voor te stellen een extra COPD-model dat zowel de pathologische proces van COPD patiënten recapituleert en een zeer korte generatie-periode vereist.
De belangrijkste stap voor het genereren van dit model was het blootstellen van de muizen ozon (op een niveau van 2,5 ppm) twee maal per week (een keer om de 3 dagen) voor 6-8 weken (in deze studie, gebruikten we 7 weken, hoewel we niet dosis escalatie proberen). Door het beheersen van de kritieke parameters van de frequentie van de blootstelling en de ozonconcentratie, wij met succes gereproduceerd emfyseem in mannelijke C57BL/6 muizen31,32, mannelijke BALB/c muizen30en vrouwelijke BALB/c muizen (de huidige studie). Het fenotype van emfyseem het gevolg is van blootstelling aan ozon, met de beperking van de luchtstroom en de Long parenchymal vernietiging vergelijkbaar met de veranderingen in COPD patiënten44,45.
Er zijn nog steeds beperkingen aan deze studie. Bijvoorbeeld omdat de pathogenese van menselijke COPD gerelateerd is aan de anatomie van de longen, moet een ideale COPD-model worden gegenereerd bij dieren die een pulmonaire anatomische structuur die vergelijkbaar is met die van de mens. In vergelijking met grote dieren, bezitten kleine dieren nog minder uitgebreide airway vertakking dan mens46. We moeten toegeven dat het zou zinvoller voor het genereren van een COPD-model in grote dieren. Het is echter zeer moeilijk om grootschalige modellen in dieren. Een andere beperking van dit model is de klinische relevantie. Hoewel vaststaat dat ozon kan met de luchtwegen reageren en Long weefsel19,22 schade, en hoewel er is bewijs dat de symptomen van sommige COPD-patiënten na blootstelling aan ozon28 verslechteren, ozon is niet de belangrijkste oorzaak van COPD bij patiënten. We zijn echter nog steeds voorstellen en met behulp van dit model OE omdat zowel ozon en CS leiden schade aan de luchtwegen tot door inducerende ontsteking en tot oxidatieve stress26,27 leiden. Dus, een nieuwe drug die kan genezen van COPD in de OE model kan assumably werken ook in het CS-model en dus mogelijk worden ontwikkeld voor COPD patiënten.
Toepassingen van de OE-model zijn niet beperkt tot het ontcijferen van de moleculaire en cellulaire mechanismen van COPD. Onze twee recente artikels onderzocht ook de doeltreffendheid van N-Acetylcysteïne (NAC)31 en NaHS32 (een exogene donor van H2S) bij de behandeling van COPD door exogene toediening van de twee geneesmiddelen aan de OE-model. In de eerste studie vonden we een omkering van de luchtweg hyper-reactievermogen en een vermindering van de luchtweg smooth spiermassa na de toediening van NAC. Deze effecten kunnen wijzen op de basis voor de potentiële klinische voordelen van NAC in COPD patiënten31. In de tweede studie van de OE-model vonden we dat de toediening van exogene NaHS omgekeerd Long ontsteking en gedeeltelijk teruggedraaid de kenmerken van emfyseem. Dus, met dit model van OE, we toonden in een voorbereidend onderzoek dat NaHS ontwikkeld kunnen worden als een potentiële kandidaat van de drug voor COPD patiënten32. De OE-model heeft daarom toepassingsmogelijkheden voor zowel mechanisme onderzoek en drug screening voor COPD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Z.W.S. en W.W. zijn huidige medewerkers en aandeel optiehouders van de cellulaire biologie-groep (NASDAQ: CBMG). De andere auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs wil dankbaarheid uitspreken aan de heer Boyin Qin (Shanghai publiek Clinical gezondheidscentrum) voor de technische hulp bij de evaluatie van de µCT in dit protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mice | Slac Laboratory Animal,Shanghai, China | N/A | 7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study. |
| Individual ventilated cages | Suhang, Shanghai, China | Model Number: MU64S7 | The cages were used for housing mice in the animal facility. |
| Sealing perspex-box | Suhang, Shanghai, China | N/A | The box was used to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box. |
| Electric generator | Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany | Model 500 | The device was used for generating ozone. |
| Ozone probe | ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK | Ozone 300 | The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone. |
| Pelltobarbitalum natricum | Sigma, St. Louis, MO, USA | P3761 | Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum. |
| Micro-Computed Tomography | GE Healthcare, London, ON, Canada | RS0800639-0075 | This device was used for acquiring images of the lung. |
| Micro-view 2.01 ABA software | GE Healthcare, London, ON, Canada | Micro-view 2.01 | This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung. |
| Treadmill machine | Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China | DSPT-208 | This machine was usd for fatigue test. |
| Body plethysmograph | eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK | Forced Manoeuvres System | This device was used to test spirometry pulmonary function. |
| Ventilator | eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK | Forced Manoeuvres System | This device was used to test spirometry pulmonary function. |
| Slide spinner centrifuge | Denville Scientific, Holliston, MA, USA | C1183 | It was used to spin BALF cells onto slides. |
| Wright Staining | Hanhong, Shanghai, China | RE04000054 | It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF. |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, Horsham, PA, USA | 4000 | It was used to count cells. |
| IL-1β | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab100704 | They were used to test the respective factors in serum. |
| IL-10 | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab46103 | They were used to test the respective factors in serum. |
| TNF-α | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab100747 | They were used to test the respective factors in serum. |
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO, USA | P6148 | The lung was inflated by 4% paraformaldehyde. |
| Paraffin | Hualing, Shanghai, China | 56# | It was used to embed the lung. |
| Rotary Microtome | Leica, Wetzlar, Hesse, Germany | RM2255 | It was used for sectioning the lung. |
| Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution | Solarbio, Beijing, China | G1120 | H&E staining was done for morphometric analysis. |
| Upright bright field microscope | Olympus, Center Valley, PA, USA | CX41 | It was used to image the H&E staining slides. |
| Adobe Photoshop 12 | Adobe, San Jose, CA, USA | Adobe Photoshop 12 | It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images. |
| GraphPad prism 5 | Graphpad Software Inc., San Diego, CA | GraphPad prism 5 | It was used for data analysis and production of figures. |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
- Chapman, K. R., et al. Epidemiology and costs of chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 27, 188-207 (2006).
- Afonso, A. S., Verhamme, K. M., Sturkenboom, M. C., Brusselle, G. G. COPD in the general population: prevalence, incidence and survival. Respir Med. 105, 1872-1884 (2011).
- Rabe, K. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am J Respir Crit Care Med. 176, 532-555 (2007).
- Ogata-Suetsugu, S., et al. Amphiregulin suppresses epithelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. Biochem Biophys Res Communi. 484, 422-428 (2017).
- Oliveira, M. V., et al. Characterization of a Mouse Model of Emphysema Induced by Multiple Instillations of Low-Dose Elastase. Front Physiol. 7, 457 (2016).
- Vernooy, J. H., Dentener, M. A., van Suylen, R. J., Buurman, W. A., Wouters, E. F. Long-term intratracheal lipopolysaccharide exposure in mice results in chronic lung inflammation and persistent pathology. Am J Respir Cell Mol Biol. 26, 152-159 (2002).
- Birrell, M. A., et al. Role of matrix metalloproteinases in the inflammatory response in human airway cell-based assays and in rodent models of airway disease. J Pharm Exp Ther. 318, 741-750 (2006).
- Gamze, K., et al. Effect of bosentan on the production of proinflammatory cytokines in a rat model of emphysema. Exp Mol Med. 39, 614-620 (2007).
- Vanoirbeek, J. A., et al. Noninvasive and invasive pulmonary function in mouse models of obstructive and restrictive respiratory diseases. Am J Respir Cell Mol Biol. 42, 96-104 (2010).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 1-15 (2008).
- Huh, J. W., et al. Bone marrow cells repair cigarette smoke-induced emphysema in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301, 255-266 (2011).
- Schweitzer, K. S., et al. Adipose stem cell treatment in mice attenuates lung and systemic injury induced by cigarette smoking. Am J Respir Crit Care Med. 183, 215-225 (2011).
- Guan, X. J., et al. Mesenchymal stem cells protect cigarette smoke-damaged lung and pulmonary function partly via VEGF-VEGF receptors. J Cell Biochem. 114, 323-335 (2013).
- Gu, W., et al. Mesenchymal stem cells alleviate airway inflammation and emphysema in COPD through down-regulation of cyclooxygenase-2 via p38 and ERK MAPK pathways. Sci Rep. 5, 8733 (2015).
- Cordasco, E. M., VanOrdstrand, H. S.
- Berend, N. Contribution of air pollution to COPD and small airway dysfunction. Respirology. 21, 237-244 (2016).
- DeVries, R., Kriebel, D., Sama, S. Outdoor Air Pollution and COPD-Related Emergency Department Visits, Hospital Admissions, and Mortality: A Meta-Analysis. COPD. 14 (1), 113-121 (2016).
- Penha, P. D., Amaral, L., Werthamer, S. Ozone air pollutants and lung damage. IMS Ind Med Surg. 41, 17-20 (1972).
- Stern, B. R., et al. Air pollution and childhood respiratory health: exposure to sulfate and ozone in 10 Canadian rural communities. Environ Res. 66, 125-142 (1994).
- Tager, I. B., et al. Chronic exposure to ambient ozone and lung function in young adults. Epidemiology. 16, 751-759 (2005).
- Romieu, I., Castro-Giner, F., Kunzli, N., Sunyer, J. Air pollution, oxidative stress and dietary supplementation: a review. Eur Respir J. 31, 179-197 (2008).
- Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54, 5185-5197 (2015).
- Chu, H., et al. Comparison of lung damage in mice exposed to black carbon particles and ozone-oxidized black carbon particles. Sci Total Environ. 573, 303-312 (2016).
- Jin, M., et al. MAP4K4 deficiency in CD4(+) T cells aggravates lung damage induced by ozone-oxidized black carbon particles. Environ Toxicol Pharmacol. 46, 246-254 (2016).
- Brusselle, G. G., Joos, G. F., Bracke, K. R. New insights into the immunology of chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 378, 1015-1026 (2011).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, K., Loridas, S. Pulmonary oxidative stress, inflammation and cancer: respirable particulate matter, fibrous dusts and ozone as major causes of lung carcinogenesis through reactive oxygen species mechanisms. Int J Environ Res Public Health. 10, 3886-3907 (2013).
- Medina-Ramon, M., Zanobetti, A., Schwartz, J. The effect of ozone and PM10 on hospital admissions for pneumonia and chronic obstructive pulmonary disease: a national multicity study. Am J Epidemiol. 163, 579-588 (2006).
- Lee, I. M., Tsai, S. S., Chang, C. C., Ho, C. K., Yang, C. Y. Air pollution and hospital admissions for chronic obstructive pulmonary disease in a tropical city: Kaohsiung, Taiwan. Inha Toxicol. 19, 393-398 (2007).
- Triantaphyllopoulos, K., et al. A model of chronic inflammation and pulmonary emphysema after multiple ozone exposures in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 300, 691-700 (2011).
- Li, F., et al. Effects of N-acetylcysteine in ozone-induced chronic obstructive pulmonary disease model. PLoS ONE. 8, e80782 (2013).
- Li, F., et al. Hydrogen Sulfide Prevents and Partially Reverses Ozone-Induced Features of Lung Inflammation and Emphysema in Mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 55, 72-81 (2016).
- Rycroft, C. E., Heyes, A., Lanza, L., Becker, K. Epidemiology of chronic obstructive pulmonary disease: a literature review. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 7, 457-494 (2012).
- Washko, G. R., et al. Airway wall attenuation: a biomarker of airway disease in subjects with COPD. J Appl Physiol. 107, 185-191 (2009).
- Yamashiro, T., et al. Quantitative assessment of bronchial wall attenuation with thin-section CT: An indicator of airflow limitation in chronic obstructive pulmonary disease. AJR Am J Roentgenol. 195, 363-369 (2010).
- Tang, X., et al. Arctigenin efficiently enhanced sedentary mice treadmill endurance. PLoS ONE. 6, e24224 (2011).
- Schmidt, G. A., et al. Official Executive Summary of an American Thoracic Society/American College of Chest Physicians Clinical Practice Guideline: Liberation from Mechanical Ventilation in Critically Ill Adults. Am J Respir Crit Care Med. 195, 115-119 (2017).
- ATS Committee on Proficiency Standards for Clinical Pulmonary Function Laboratories. ATS statement: guidelines for the six-minute walk test. Am J Respir Crit Care Med. 166, 111-117 (2002).
- Shigemura, N., et al. Autologous transplantation of adipose tissue-derived stromal cells ameliorates pulmonary emphysema. Am J Transplant. 6, 2592-2600 (2006).
- Bchir, S., et al. Concomitant elevations of MMP-9, NGAL, proMMP-9/NGAL and neutrophil elastase in serum of smokers with chronic obstructive pulmonary disease. J Cell Mol Med. , 1-12 (2016).
- Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opin Drug Discov. 9, 629-645 (2014).
- Perez-Rial, S., Giron-Martinez, A., Peces-Barba, G. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Arch Bronconeumol. 51, 121-127 (2015).
- Antunes, M. A., et al. Effects of different mesenchymal stromal cell sources and delivery routes in experimental emphysema. Respir Res. 15, 118 (2014).
- Celli, B. R., MacNee, W., Force, A. E. T. Standards for the diagnosis and treatment of patients with COPD: a summary of the ATS/ERS position paper. Eur Respir J. 23, 932-946 (2004).
- U.S. Preventive Services Task Force. Screening for chronic obstructive pulmonary disease using spirometry: U.S. Preventive Services Task Force recommendation statement. Ann Intern Med. 148, 529-534 (2008).
- Ward, R. E., et al. Design considerations of CareWindows, a Windows 3.0-based graphical front end to a Medical Information Management System using a pass-through-requester architecture. Proc Annu Symp Comput Appl Med Care. , 564-568 (1991).
