Aquí describimos un método común para inducir lesión hepática crónica en ratones por la alimentación de una dieta de deficiencia de colina y suplementada con ethionine (CDE). Demostramos la vigilancia de la salud, la perfusión hepática, aislamiento y conservación. Un curso de tiempo de seis semanas puede informar sobre la lesión del higado, pathohistology, fibrosis, inflamación y las respuestas de células progenitoras hepáticas.
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Artículo de método
El murino colina deficientes, suplementada con Ethionine (CDE) dieta de modelo de la lesión hepática crónica
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Resumen
Resumen
Enfermedades crónicas del hígado, como hepatitis viral, enfermedad del higado alcohólica o enfermedad del hígado graso no alcohólico, se caracterizan por la inflamación continua, progresiva destrucción y regeneración de la célula progenitora de parénquima hepático, hígado proliferación y fibrosis. La fase final de cada enfermedad crónica del hígado es la cirrosis, principal factor de riesgo para el desarrollo de carcinoma hepatocelular. Para estudiar procesos de regulación de la progresión, el establecimiento y la iniciación de la enfermedad, varios modelos animales se utilizan en laboratorios. Aquí describimos un curso de seis semanas de tiempo del deficiencia de colina y suplementada con ethionine (CDE) ratón modelo, que implica la alimentación de seis semanas de edad ratones C57BL/6J machos deficientes en colina chow y 0.15% DL-ethionine-suplido de agua potable. Vigilancia de la salud animal y una curva de pérdida de peso de cuerpo típicas son explicados. El protocolo demuestra el examen macroscópico de una colección de hígado y la sangre CDE tratados por punción cardiaca para análisis posterior del suero. A continuación, la técnica de perfusión hepática y colección de diferentes lóbulos hepáticos para evaluaciones estándar son evaluaciones de la histología hepática muestra, incluyendo por hematoxilina y eosina o Sirius rojo stainings, detección inmunofluorescente de poblaciones de la célula hepática así como perfiles de transcriptoma del microambiente hepático. Este modelo de ratón es conveniente para estudiar inflamatoria fibrogénicos y células progenitoras hepáticas dinámica inducida por la enfermedad hepática crónica y puede ser utilizado para probar a posibles agentes terapéuticos que pueden modular estos procesos.
Introducción
El hígado es el órgano metabólico glandular más grande del cuerpo y tiene muchas funciones complejas. Funciones clave para el hígado incluyen desintoxicación, digestión, metabolismo, almacenamiento de nutrientes esenciales, producción de componentes de proteína del plasma de la sangre y la inmunidad mediada por células de Kupffer o macrófagos residentes. El hígado tiene una gran capacidad para regenerar incluso si se pierde hasta el 70-90% de su masa total. En caso de lesión del higado aguda, tal como se ve después de una hepatectomía parcial o acetaminophen envenenamiento, proliferan los hepatocitos sanos restantes para reparar el daño en un proceso altamente coordinado1. Sin embargo, cuando los hepatocitos se lesionan crónico debido a la infección viral a largo plazo, alcohólica o no alcohólica hígado graso, el microambiente inflamatorio desencadena la activación de células radiadas hepáticas fibrosis de conducción y la proliferación de las células progenitoras hepáticas (LPCs) con el potencial de diferenciarse en cholangiocytes o hepatocitos2,3,4,5. El origen exacto, suerte de diferenciación de LPCs, su contribución a la regeneración hepática y hepatocarcinogenesis han sido temas de intenso debate y probablemente dependen de la severidad de la lesión y contexto2. El orden de los acontecimientos tempranos asociados de regeneración se discute también polémico, con algunos investigadores indicando que la activación de las células radiadas hepáticas y la remodelación de la matriz es esencial para la generación de un LPC favoreciendo nicho6, mientras que otros Informe que expansión de LPC y la llamada reacción Ductular deben gatillo fibrogenesis7. Hay numerosos modelos animales para el estudio de aspectos específicos de la lesión y la regeneración, en un intento de comprender los factores subyacentes que regulan la progresión de la enfermedad y en última instancia, desarrollar nuevas estrategias de tratamiento para pacientes8.
El modelo dietético de deficiencia de colina y suplementada con ethionine (CDE) fue originalmente desarrollado para su uso en ratas y más tarde modificado para la inducción de lesión hepática crónica en ratones9,10. La deficiencia dietética de colina resultado deteriorada ensamblaje y secreción de lipoproteínas de baja densidad muy. Combinado con el hepatocarcinógeno DL-ethionine, este régimen conduce a exceso de grasa hepático carga, inflamación continua, fibrosis periportal, respuesta LPC y a largo plazo a hepatocelular carcinoma desarrollo11,12 . Sin embargo, lo importante es que, las cepas de ratón diferente exhiben patrones distintivos de inflamatoria, fibrogénicos y LPC respuesta dinámica13. Este protocolo describe la cepa de ratón de inducción en ratones C57BL/6J, los más utilizados endogámica de lesión hepática crónica.
En la investigación de la enfermedad hepática crónica, análisis típicos incluyen evaluaciones histológicas por hematoxilina y eosina como Sirius rojo tinción para visualizar depósitos de colágeno, inmunohistoquímica o detección inmunofluorescente de poblaciones de la célula hepática, Análisis transcriptómico del microambiente hepático que coordina los cambios celulares inducidos por complejo factor de crecimiento y citocinas redes14,15,16,17 y , 18.
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Protocolo
1. animales de experimentación
todos los estudios en animales se describen en esta investigación fueron aprobados por el Comité de ética de Animal de la Universidad de Curtin (número: AEC_2014_28) antes del inicio de la experimentos y realizado de acuerdo con el código australiano para el cuidado y uso de animales.
- Animales
- usar seis semanas de edad ratones C57BL/6J machos para los experimentos.
- Diseño experimental
- después de su llegada a las instalaciones de animales, permiten ratones para aclimatarse durante cuatro días antes del inicio de cualquier experimentos. Ratones de la casa de
- en ropa de cama de paja de trigo, que ha sido agotado de tallos y granos visibles y ratones en ciclos de 12 horas día y noche en individualmente ventiladas jaulas. Cambio ropa de cama en los días tres y siete, entonces después de eso a la semana. Dieta
- ratones proporcionan acceso ad libitum a la deficiencia de colina y agua potable con 0.15% de DL-ethionine. Mantener el DL ethionine-suplementos de agua a 4° C y reemplazar el agua potable cada segundo día para asegurar la frescura y alentar a beber. Reponer el deficiencia de colina chow cada segundo día con un cambio completo de chow una vez por semana.
- Ratones observamos en reposo y durante la manipulación. Señales estándar de monitor de la salud animal, incluyendo apariencia general, postura, interacción social, aseo personal, condición de la capa y el peso corporal.
- Pesar ratones diariamente durante las dos primeras semanas del experimento para los animales que más del 20% pérdida de peso del cuerpo son sacrificados para limitar el sufrimiento indebido. Esto es típicamente el caso en menos del 5% de los animales. Después de dos semanas, puede reducirse la frecuencia de peso tres veces a la semana (por ejemplo, el lunes, el miércoles, el viernes).
- Aislamiento y perfusión de hígado
- anestesiar ratones en puntos de tiempo indicado (en este estudio uno, dos y seis semanas en la dieta CDE) con ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) por inyección intraperitoneal. Prueba el reflejo pedal retirada para asegurar adecuada anestesia.
- Mojar la piel con etanol al 70% y hacer una incisión del midline vertical en la pared abdominal hasta el diafragma usando las tijeras de Mayo. La caja torácica puede quitarse para facilitar el acceso al corazón.
- Recoger sangre por punción cardiaca lenta usando 25 x 1/2 " aguja de pared regular para evitar el colapso del corazón. Permitir que la sangre coagule en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente para obtener muestras de suero después de la centrifugación a 2.000 x g por 10 min. Más tarde, medir niveles de la aminotransferasa de alanina de suero por procedimientos estándar 12.
- Mover el estómago y el intestino delgado hacia el lado y exponer la vena porta. De un plumazo con tijeras de Mayo para permitir que los fluidos salir y perfusión del hígado con tampón de fosfato estéril salino (pH = 7,4) de canular la vena porta con 27 x 1/2 " aguja de pared regular. Un hígado blanqueado uniformemente indica perfusión exitosa de todos los lóbulos hepáticos.
- Cuidadosamente separar el hígado y colocarlo en un plato de petri utilizando pinzas y tijeras de Mayo. Eliminar el tejido sobrante, no hígado y la vesícula biliar.
- Preservación del hígado
- después de que el peso total del hígado se ha registrado, cortar un pequeño lóbulo en varios trozos pequeños de unos pocos milímetros cuadrados, transferirlas a tubos estériles y snap-congelación en nitrógeno líquido para posteriormente RNA y extracción de proteínas, según protocolos estándar. Rápido-congele estas piezas de tejido tan pronto como sea posible después de la colección de órganos para evitar cualquier degradación de tejido.
- Recoger un lóbulo en 10% formalina tamponada neutra para posterior procesamiento y la inclusión en parafina, según protocolos estándar de.
- Colocar un lóbulo en un molde lleno de corte óptimo temperatura cryomatrix incrustación de resina y snap-congelación en nitrógeno líquido.
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Resultados
Largo tiempo de seis semanas de la lesión hepática crónica inducida por el CDE, los parámetros fueron evaluados los días 7 (fase de inducción), 14 y 21 (fase del establecimiento) y 42 (fase de mantenimiento). En comparación con ratones control, los ratones tratados con CDE perdieron hasta un 20% de su peso corporal inicial en una fase de adaptación inicial y tienden a recuperar el peso en las fases de establecimiento y mantenimiento (figura 1)
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Discusión
Enfermedad del higado crónica a menudo es una enfermedad silenciosa con la mayoría de los pacientes están asintomáticos y es uno de los principales contribuyentes a la morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Alcoholismo crónico y la infección del virus de la hepatitis C son las principales causas. Lesión hepática crónica se caracteriza por la inflamación hepática, fibrosis y en casos graves cirrosis, carcinoma y falta de hígado en última instancia. Actualmente no existe cura disponible y aunque se han logrado avances i...
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Divulgaciones
No hay nada que ser revelada por los autores.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la salud nacional y el Consejo de investigación médica (NHMRC) de Australia (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Los autores quieren agradecer al personal del Instituto de investigación de innovación de Curtin salud para asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratones machos C57BL/6J de seis semanas de edad | Centro de Recursos Animales de Australia Occidental, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 kg de paja de trigo cortada al vapor | Alimentos especializados, Glen Forrest, WA, Australia | N/A Agua | |
| para riego botella de 1000ml (Baxter) | Casa Quirúrgica, Perth, WA, Australia | ||
| Dieta deficiente en colina, modificada (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, Nueva Gales del Sur, Australia | E5139-25G | |
| Inyección de Ketamil | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, Nueva Gales del Sur, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 inyección | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, Nueva Gales del Sur, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Aguja de pared regular | Terumo Australia Pty Limited, Nueva Gales del Sur, Australia | NN-2713R Jeringas | |
| Terumo 1ml y 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, Nueva Gales del Sur, Australia | 1018242, compuesto 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Formalina neutra tamponada | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Etanol absoluto anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Correderas Superfrost Plus | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | ||
| Dako Protein Block, sin suero | Dako Australia Pty Limited, Norte de Sídney, Nueva Gales del Sur, Australia | Diluyente de anticuerpos Dako X090930-2 | |
| Dako Australia Pty Limited, Norte de Sídney, Nueva Gales del Sur, Australia | s0809 | ||
| rata anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, EE. UU. | M0701 | Dilución 1/200 |
| anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, Norte de Sídney, Nueva Gales del Sur, Australia | Z0622 | dilución 1/300 |
| Cabra anti-conejo (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | Dilución 1/500 |
| Cabra anti-rata IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | dilución 1/500 |
| con DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, EE. UU.   | ab150681 y emsp; |
Referencias
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration - mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39(2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
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