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Establecimiento de un imitador valiosa de la enfermedad de Alzheimer en modelo Animal de rata por la inyección Intracerebroventricular de proteína Beta amiloide compuesta

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DOI:

10.3791/56157

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29 de julio de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Traditional Chinese Medicine, Chengde Medical College, 2Shijiazhuang Obstetrics and Gynecology Hospital, 3Hebei Province Key Research Office of Traditional Chinese Medicine Against Dementia, 4Hebei Province Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research and Development, 5Institute of Basic Medical Research of Basic Medical School

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se trata de un protocolo para imitar la enfermedad de Alzheimer en ratas mediante la evaluación de deterioro de la memoria espacial, cambios patológicos neuronales, neuronal amiloide beta proteína (Aβ) carga y combinado de la agregación de los enredos de neurofibrillary, inducida por la inyección de Aβ25-35 con tricloruro de aluminio y recombinantes humanos transformar el factor de crecimiento β1.

Resumen

Enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad irreversible y progresiva del cerebro que lentamente destruye la memoria y se acompaña por el cambio de pérdida y estructura de la neurona. Con el aumento de pacientes con EA en todo el mundo, la patología y el tratamiento de la enfermedad se ha convertido en un foco en la industria farmacéutica internacional. Así, el establecimiento del modelo animal para imitar el anuncio en el laboratorio es de gran importancia.

Aquí, describimos un protocolo detallado para el establecimiento de un imitador de AD en un animal de rata modelo aunque la inyección intracerebroventricular de amiloide beta proteína 25-35 (Aβ25-35) combinado con tricloruro de aluminio (AlCl3) y núcleo talámico anterodorsal inyección de recombinantes humanos transformar el factor de crecimiento β1 (RHTGF-β1) a las ratas. Se midieron los marcadores relacionados de AD, incluyendo: memoria espacial, estructura neuronal y subestructura, Aβ neuronal y la producción de ovillos neurofibrilares (NFT). Este modelo de rata muestra deterioro de la memoria espacial, estructura neuronal y cambios patológicos de la subestructura, carga Aβ intracelular neuronal y agregación de NFT y proporciona a un imitador cerca del desorden neuronal de la estructura y función del clínico Pacientes con EA. Así, la actual AD rata modelprovides una herramienta valiosa en vivo para explorar la función neuronal, patología neuronal y screening de drogas de AD.

Introducción

Es bien sabido que el anuncio es una enfermedad neurodegenerativa crónica y progresiva, con pérdida de memoria gradual como el síndrome clínico principal. En la patología general, hay atrofia del tejido nervioso, neuronas y sinapsis pérdida, así como neuronales trastornos función y estructura subcelulares, que todos participan en el desarrollo y la manifestación clínica de AD1,2. Se informa que cuando los animales fueron intracerebroventricularly inyectado con Aβ, algunos neurotóxicos se producen eventos en el cerebro que implican pérdida de neuronas, alteración de la homeostasis del calcio, apoptosis de la neurona y de sobreproducción de especies reactivas de oxígeno3. Sin embargo, múltiples factores intervienen en la patogenia de la EA y por lo tanto es indispensable establecer un mejor modelo de anuncio.

Aquí se describe un protocolo detallado para el establecimiento de un en vivo imitador AD modelo a través de la inyección intracerebroventricular de Aβ25-35 y AlCl3, combinado con la inyección de núcleo talámico anterodorsal de RHTGF-β1 a las ratas. Esta rata modelhighly imita la función neuronal humana y histopathogenesis de la EA, incluyendo deterioro de la memoria, pérdida de neuronas y daños a la estructura, apoptosis, carga intracelular de Aß y NFT agregación4,5,6 , 7 , 8 , 9. el Aβ depositado el AlCl3 impide formación de Aß soluble, y RHTGF-β1 puede promover la producción de Aß depositado y facilitar AD ocurrencia10. Este ataque de varios factores a la neurona está de acuerdo con la patogenia múltiple de AD.

Todo el experimento abarcó 86 días: la figura 1 muestra una línea de tiempo del diseño experimental, con el momento de cirugía animal, proyección del modelo animal, la prueba de memoria espacial animales y preparación de la muestra. En el primer día de operación, RHTGF-β1 se microinyectados en el núcleo talámico anterodorsal. En el segundo día de operación, Aβ25-35 y AlCl3 fueron microinyectados en el ventrículo lateral diariamente por 14 días consecutivos por la mañana y 5 días consecutivos en la tarde, respectivamente. Todas las ratas podían recuperar para 45 días después de la operación. El laberinto acuático de Morris fue utilizado para las ratas del exitoso modelo con deterioro de la memoria y para evaluar la memoria espacial de ratas. Las ratas experimentaron 4 días consecutivos de laberinto de agua de formación con 2 ensayos por día y el día 4 de entrenamiento, las ratas se evaluaron con el funcionamiento de laberinto de agua de Morris para el deterioro de la memoria. Todas las ratas continúan alimentar 37 días después de la proyección del modelo animal. La memoria espacial de ratas fue probada en el laberinto acuático de Morris en 7 días consecutivos, desde el día 79 a 85 días después de la operación. Todas las ratas fueron sacrificadas por decapitación en día 86 para preparación de muestras de cerebro.

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Figura 1. Timeline del diseño experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

Este procedimiento fue conforme a las regulaciones de administración de Animal Experimental emitida por el Comité Estatal de ciencia y tecnología de China el 31 de octubre de 198811. Los científicos deben seguir las directrices establecidas y aprobadas por los organismos reguladores del animal institucionales y nacionales.

Nota: Animal y regentes: ratas de Sprague-Dawley macho de cuatro meses (300-350 g) fueron suministradas para este experimento. Todas las ratas fueron alojadas en grupos (cuatro o cinco por jaula) a una temperatura de 23 ± 1 ° C con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Agua y los alimentos estaban disponibles ad libitum. Las ratas fueron aclimatadas a las condiciones de la vivienda por 7 días antes de que el procedimiento fue realizado. Aβ25-35 fue disuelto en solución salina al DMSO 1% a 1 mg/mL y ultrasonicada durante 5 minutos en un oscilador ultrasónico hasta que se disuelva completamente. AlCl3 y RHTGF-β1 se disolvieron en solución salina al 1% y 0.1 mg/mL, respectivamente. Rojo Congo, nitrato de plata y otros productos químicos fueron de grado analítico y fueron adquiridas de fuentes comerciales ordinarias.

1. quirúrgico

Nota: 20 ratas Sprague-Dawley macho fueron microinyectadas con Aβ composited en el ventrículo lateral y núcleo talámico anterodorsal y señaladas como el grupo tratado con Aβ composited. Otro 20 ratas fueron sometidos a la misma operación pero recibieron solución salina microinyección de 0.1% DMSO y señalan como el grupo sham operado.

  1. Anestesiar las ratas con isoflurano 100% por inhalación y luego frenar en un aparato estereotáctica cerebral.
  2. Afeitarse la piel en el vértice de la cabeza con tijeras quirúrgicas y desinfectar con yodoforo. Luego, cubre toallas desechables quirúrgicos en la cabeza.
  3. Hacer una incisión en la piel de la cabeza a lo largo de la calvaria longitudinal mediana con bisturís quirúrgicos y tijeras.
  4. Separar el tejido subcutáneo y fascia, limpie la bóveda craneal con un algodón seco estéril para detener el sangrado y marca el vértice con un rotulador.
  5. Se refieren a la rata cerebral estereotáctica mapa12; teniendo en cuenta el vértice como punto de origen, marque los tres puntos, el núcleo talámico anterodorsal (ad) (posterior (P): 2,0 mm para el bregma, lateral (L): 1,4 mm a la línea media) para la inyección de RHTGF-β1 y la fijación de un tornillo, el ventrículo lateral (LV) área ( posterior (P): 0.8m m a bregma; lateral (L): 2,0 mm a la línea media) para la inyección de Aβ25-35 y AlCl3 y el segundo tornillo de fijación de lugar (frontal (F): 2,0 mm para el bregma, lateral (L): 1,5 mm a la línea media).
  6. Suavemente Taladre tres orificios de 1 mm de diámetro con un taladro del hueso flexible, señalado en los anteriores tres puntos del cráneo (1.5. paso). No atornille más profundo que es necesario para evitar apuñalar el tejido cerebral.
  7. Detener el sangrado y limpiar la superficie del cráneo repetidamente con algodón seco estéril.
  8. Inserte una aguja vinculada a la bomba de inyección de micro, para el cerebro a 4.6 mm de profundidad y suavemente inyectar 1 μL RHTGF β1 (10 ng) en el área de anuncio. Estancia la aguja 2 min después de la inyección y lentamente tire de la aguja (1 archivo suplementario).
  9. Fije los dos tornillos en el cráneo, señalado en los puntos de anuncio y el segundo tornillo de fijación de lugar de calavera (que fueron señalados en 1.5. paso) con un destornillador pequeño. No atornille más profundo que es necesario para evitar apuñalar el tejido cerebral.
  10. Montar el sistema de implantación de cánula (2 archivo suplementario), inserte la cánula simulada en la cánula guía después de la desinfección por alta presión.
  11. Inserte la cánula de acero inoxidable tubo guía al cerebro a 4,6 mm área de LV a través del agujero del cráneo (archivo suplementario 3), con la ayuda del titular de la cánula del aparato estereotáxicas de ratas.
  12. Mezcle el material base de la dentadura con agua base de la dentadura en proporción de 1,5 g por 1 mL, poner la pasta para cubrir el pedestal plástico de la cánula guía y dos tornillos para inmovilizar la cánula guía y hasta la cubierta de la incisión de la piel entera para evitar la infección de la piel.
  13. En el día 2 de la operación, anestesiar las ratas con inhalación isoflurano con la máquina de anestesia de pequeños animales. Extraer la cánula dummy, inserte la cánula interna en la cánula guía y atornille el tornillo de fijación para inmovilizar la cánula interna.
  14. Fijar la tubería de polietileno que une la bomba de microinyección a la cánula interna y regular la velocidad de la inyección de 1 μL/min Microinject la Aβ25-35 o AlCl3 a VI.
  15. Microinject 4 μg (1 μL) Aβ25-35 diariamente durante 14 días en la mañana y 3 μL AlCl3 (1%) diario durante 5 días por la tarde bajo anestesia isoflurano.
  16. Espere 5 minutos después de finalizar la inyección, suavemente sacar la cánula interna y vuelva a insertar la cánula simulada en la cánula de la guía.
  17. El día 15 después de la cirugía (que corresponde al último día de la inyección de Aβ25-35) desmantelar el sistema de implantación de la cánula. Suavemente retirar el sólido material base de la dentadura con tijeras quirúrgicas y pinzas, destornille los dos tornillos, sacar la cánula guía y desinfectar la herida con betadine. Rellene el agujero del cráneo con cemento óseo y sutura la piel con un método de sutura interrumpida simple.
  18. Realizar la misma operación con el grupo sham operado y microinject 0.1% solución salina de DMSO.
  19. Enfermería posoperatoria
    1. 2 ratas por jaula de la casa después de la operación y proporcionar comida para 30 días.
      Nota: 18 ratas en el grupo sham operado sobrevivió (90% tasa de éxito de operación) y 19 ratas en el composited Aβ grupo tratado sobrevivió (tasa de éxito de 95% de la operación).

2. detección de ratas modelo de éxito y evaluación de la memoria espacial con laberinto acuático de Morris

  1. Laberinto acuático de Morris
    Nota: El laberinto acuático de Morris se utilizó para evaluar la memoria espacial de rat13. El laberinto acuático de Morris es un tanque circular de acero inoxidable con diámetro de 120 cm y 50 cm de profundidad. Se realizó la prueba del laberinto de agua, basado en el paradigma de "estándares de oro", en Behavioral Neuroscience, según J. Nunez14.
    1. Ennegrecer el agua de la piscina con unas gotas de colorante de alimento.
    2. Mantener la profundidad del agua en 31,5 cm y la temperatura de 23 ± 1 ° C.
    3. Establecer una plataforma de plexiglás transparente circular de 1,5 cm por debajo de la superficie del agua.
    4. Mantienen que todas las señales espaciales por el laberinto de agua son invariables durante las pruebas del laberinto de agua.
    5. Dividir la piscina en 4 cuadrantes iguales por líneas imaginarias para la recogida de datos descriptivos.
    6. Colocar la plataforma en el primer cuadrante (Q1) del laberinto de agua.
    7. Captura de la rata nadando comportamientos (medidos por la latencia, la trayectoria o el número de cruce) a través de una cámara de video, sobre el laberinto de agua vinculado a un software analítico de gráficos computarizados.
  2. Proyección para las ratas modelo de éxito para el grupo tratado con Aβ composited
    1. En el día 45 de la cirugía, realizar el laberinto acuático de Morris formación durante 4 días consecutivos para las ratas del exitoso modelo con deterioro de la memoria y recoge la relación de proyección (SR).
      Nota: El SR se define como la latencia promedio de cada rata tratada con Aβ mezclado y el grupo sham-operado de ratas para encontrar la plataforma oculta bajo el agua superficial en el día 4 de agua formación de laberinto. "A" es la latencia media de cada rata tratada con Aβ composited para encontrar la plataforma y "B" es la latencia promedio del grupo operado simulada de las ratas para encontrar la plataforma, el día 4 del laberinto de agua de formación, en la siguiente ecuación:
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      Cuando SR era más grande que 0.2 para una rata composited tratados de Aß, la rata fue mirada como una rata de éxito del modelo con memoria deteriorada de rata tratada con Aβ composited15. Se calculó el rendimiento de memoria intradía a los datos de 2 ensayos por el valor medio de las ratas para encontrar la plataforma. El proceso de la prueba de laberinto de agua de Morris fue diseñado de modo que las ratas podían nadar en el tanque de laberinto y buscar la plataforma dentro de 60 s. Si una rata no se encontró la plataforma oculta dentro de 60 s, entonces la rata se puso en la plataforma con la mano del experimentador. Cuando llegó a una rata en la plataforma (independientemente o asistida), la rata se dejó permanecer allí durante 20 s. Luego, la rata fue quitada del tanque y permite una recuperación física 10 s entre los 2 ensayos.

3. examen neurona

  1. En 86 post cirugía, bajo anestesia isoflurano, eutanasia a las ratas por decapitación (figura 1).
  2. Pon el cerebro en hielo y suavemente separar los dos hemisferios en el rafe. Tome el hemisferio izquierdo del quiasma óptico y fijar en formaldehído al 4% para la observación de la luz Microcopia de hematoxilina de neurona y eosina (HE), rojo Congo o nitrato de plata mancha (ver las secciones 4-6). Fijar la zona de hipocampo CA1 del hemisferio derecho en glutaraldehído 2.5% para la observación de Microcopia electrónica (sección 7).
  3. Proceso del cerebro para la preparación de la muestra de luz/electrón Microcopia, como se describió anteriormente16,17.

4. neurona manchas

  1. Desparafinizar cada diapositiva (20 min) con gradiente alcohol (alcohol 100%, 95%, 90%, 80% y 70%) a agua destilada en una campana de humos.
  2. Mancha durante 3 minutos con hematoxilina (0.5% w/v) y luego enjuague con agua del grifo para quitar el tinte independiente de toboganes.
  3. Enjuague con 0,1% de ácido clorhídrico en alcohol durante 1 s para quitar el color de los núcleos sin manchas.
  4. Sumergir en solución de amoníaco 0,5% por 2 min hasta el fondo azul se convierte.
  5. Mancha durante 1 min con eosina 1%.
  6. Deshidratar durante 5 minutos con gradiente alcohol (alcohol 70%, 80%, 90%, 95% y 100%).
  7. Claro en el xileno y montar con medio de montaje resinosas.
  8. Observar y contar las neuronas vivas de la tinción de por 0,125 mm en el medio CA1 del hipocampo y 0,0352 mm2 en la corteza cerebral en un aumento de 400 x con un microscopio óptico por una persona cegada al diseño experimental.

5. rojo Congo para ensayo de carga de Aß de neurona

  1. Desparafinizar cada diapositiva (20 min) con gradiente alcohol (alcohol 100%, 95%, 90%, 80% y 70%) a agua destilada en una campana de humos.
  2. De la mancha por 20 min con rojo Congo (rojo de Congo 0.5 g, 80 mL de alcohol de metilo, trinitricum de 20 mL) de solución.
  3. Enjuague en agua destilada durante 5 minutos.
  4. Diferenciar rápidamente con solución de alcohol al 80% alcalina (0,2 g alcohol 100 mL hidróxido de potasio) para 3 s.
  5. Enjuague dos veces, cada uno por 5 min con agua destilada.
  6. Contratinción en hematoxilina de Gill durante 3 minutos.
  7. Enjuague en agua corriente durante 2 minutos.
  8. Inmersión en agua de amoníaco (añadir unas gotas de hidróxido de amonio al agua y mezcle bien) durante 30 s o hasta que las secciones se vuelven azules.
  9. Enjuague en agua corriente durante 5 minutos.
  10. Deshidratar con alcohol degradado (alcohol 70%, 80%, 90%, 95% y 100%).
  11. Claro en el xileno y montar con medio de montaje resinosas.
  12. Observar y contar las células teñidas con rojo Congo en un aumento de 400 x, con un microscopio óptico por una persona cegada al diseño experimental.

6. nitrato de plata coloración para el análisis de la formación de NFT de neurona

  1. Desparafinizar cada diapositiva (20 min) con gradiente alcohol (alcohol 100%, 95%, 90%, 80% y 70%) a agua destilada en una campana de humos.
  2. Sumergir en solución de nitrato de plata al 20% y el agente tapado por 20 min en la oscuridad.
  3. Lavar en agua destilada dos veces, 5 minutos cada vez.
  4. Sumergir en solución amoniacal de plata. Gota solución de amoníaco en solución de nitrato de plata al 20% y añadir hasta que la solución va de turbidez a la aclaración. Al mismo tiempo, agitar la solución con una varilla de vidrio durante 15 min y luego en el hidróxido de amonio diluido de 1% por 2 min.
  5. Colocar el portaobjetos en la solución de trabajo en desarrollo de 3-7 minutos hasta que el bloque negro en el axón puede ser observado.
  6. Sumerja en la solución de amoníaco 0,1% diluido durante 1 minuto y luego enjuague con agua durante 1 minuto.
  7. Disponer con tiosulfato de sodio 5% por 2 min y luego enjuagar con agua durante 5 minutos.
  8. Deshidratar con alcohol degradado (alcohol 70%, 80%, 90%, 95% y 100%).
  9. Claro en el xileno y montar con medio de montaje resinosas.
  10. Observar y registrar la celda para la mancha de nitrato de plata en un aumento de 400 x con un microscopio óptico por una persona cegada al diseño experimental.

7. hippocampal Neuron ultraestructura medición

  1. Corte del hipocampo de rata CA1 en varios cubos de hielo (1 x 1 x 1 m3) y colocar en glutaraldehído al 2.5% durante 2 h a 4 ° C.
  2. Enjuague los cubos con PBS tres veces (pH 7.2, 10 minutos cada vez).
  3. Arreglar los cubos en 1% ácido ósmico durante 2 h a 4 ° C.
  4. Enjuague los cubos en agua bidestilada 3 x (10 min cada vez).
  5. Deshidratar con alcohol degradado 50%, 70% y 90% (10 min cada uno), 100% dos veces (15 min cada vez).
  6. Reemplazar por el óxido de propileno propileno óxido: resina de dos veces (15 min cada vez), 1:1 (60 min cada vez a temperatura ambiente) y óxido de propileno: resina 1:4 (60 min. cada vez a temperatura ambiente). Remoje en resina (120 min, a temperatura ambiente).
  7. Incrustar en EPON 812 y polimerizar (5 h/35 ° C, 5 h/60 ° C, 5 h/80 ° C).
  8. Corte las secciones Semifinos (1 μm), tinción por azul de metileno y localizar al microscopio.
  9. Mancha las secciones ultra delgadas (50 nm) con plomo y de acetato de uranilo o citrato.
  10. Examinar bajo un microscopio JEM-1400 y recolectar imágenes.

Resultados

Todos los datos se presentan como media ± de para calcular el análisis estadístico se utilizó el paquete SEM. SAS/STAT. Se analizaron las diferencias de grupo en latencia para encontrar la plataforma en la adquisición de memoria y prueba volver a aprender de memoria por dos análisis de varianza (ANOVA) con medidas repetidas. Las diferencias de grupo en el ensayo de sonda y el número de neuronas fueron analizadas por ANOVA de una vía seguido de prueba de rango múltiple de Duncan. p < 0.05 fue considerado estadísticamente significativo18.

Detección del exitoso modelo ratas con deterioro de la memoria para el grupo tratado con Aβ compuesto:

Los resultados en figura 2AA1 y 2AA2 muestran que el grupo sham-operado de ratas siempre nadaron libremente y las ratas del grupo tratado con Aβ composited (figura 2AB1, AB2) siempre nadó alrededor del perímetro de piscina en piscina adaptable en el Laberinto acuático de Morris. Durante los 4 días de proyección para ratas de modelo de deterioro de memoria, todas las ratas tenían progresivamente disminuyendo tiempos para encontrar la plataforma oculta (latencia) (figura 2B). El día 4 de agua de Morris laberinto de entrenamiento, si el SR fue más de 0.2 (que fue basada en la latencia de cada rata tratada con Aβ composited y el grupo sham-operado de ratas para encontrar la plataforma), entonces la rata tratada con Aβ composited era considerada un éxito rata de modelo con deterioro de la memoria. 18 de las 19 ratas (94.70%) que sobrevivió a la operación que pasó las modelo exitosa proyección. 6 ratas de cada grupo fueron seleccionados para los siguientes experimentos.

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Figura 2 . Proyección para las ratas del exitoso modelo con deterioro de la memoria en el grupo tratado con Aβ composited usando el agua de Morris laberinto formación. (A) la natación adaptación trayectoria de ratas en el laberinto acuático de Morris. (AA1–AA2) Grupo operado de farsa; (AB1–AB2) Grupo tratado con Aβ composited. Latencia media (B) encontrar la plataforma durante 4 días consecutivos de la prueba de detección en el agua Morris laberinto de entrenamiento para el grupo sham operado y el grupo tratado con Aβ composited.  Figura ha sido modificada de referencia 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Aβ composited había causado rata memoria adquisición y volver a aprender las debilitaciones de la memoria:

La adquisición de memoria de rata determinó durante la prueba de navegación posicionamiento día 1 y 2 de la prueba de laberinto de agua de Morris, que correspondió a 79 y 80 post cirugía de. Durante los 2 días de la adquisición de memoria prueba, todas las ratas exhiben latencia progresivamente decreciente para encontrar la plataforma. Como se muestra en la figura 3, los Estados latentes del grupo tratados con Aβ composited para encontrar la plataforma fueron 360.67% y % de 558.28 (F (1, 5) = 238.67, p < 0.01) mayores que los del grupo sham-operado el día 1 y 2 del agua de Morris laberinto de prueba, respectivamente. Esto indica que la Aβ composited puede inducir deficiencia de adquisición de memoria en ratas.

La rata memoria nuevo aprendizaje fue probada por la prueba el día 4, 5 y 6 de la prueba de laberinto de agua Morris, que correspondió a 82, 83 y 84 post cirugía de reversión. Como se muestra en la figura 3, los Estados latentes del grupo tratados con Aβ composited para encontrar la plataforma fueron 306.20% 650.16% y 936.92% más tiempo que el grupo sham-funcionado (F (1, 5) = 138.76, p < 0.01). Esto demuestra que la Aβ composited puede elevar la memoria re-aprendizaje deterioro en ratas (figura 3).

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Figura 3 . Aβ composited causado rata memoria adquisición y volver a aprender las debilitaciones de la memoria. La prueba de navegación posicionamiento fue utilizada para evaluar la adquisición de la memoria por 2 días consecutivos, logro el día 1 y 2 de la natación en la prueba de laberinto de agua de Morris. Estos fueron realizados en 79 y 80 post cirugía. La revocación de la prueba fue utilizada para evaluar memoria reaprendizaje por 3 días consecutivos natación puntuación el día 4, 5 y 6 en la prueba de laberinto de agua Morris, que correspondió al día 82, 83 y 84 de la operación. Las parcelas de gráfico de línea muestran la latencia media para encontrar la plataforma para cada grupo el día 1, 2, 4, 5 y 6 en la prueba del laberinto de agua de Morris. Los datos se analizaron por ANOVA de dos vías (día x grupo) con medidas repetidas. Media ± SEM. n = 6. ** p < 0.01, vs grupo Sham-funcionado. Figura ha sido modificada de referencia 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aβ composited había causado deterioro de retención de la memoria de rata:

La retención de memoria ratas se midió por la prueba de la sonda el día 3 de prueba laberinto del agua de Morris, que correspondió a 81 post cirugía. En la retención de la memoria del día 1 ensayo, el grupo tratado con Aβ composited tomó menos tiempo de natación, natación de distancia y cruzando número en Q1 dentro de 60 s, que correspondió al 32.14% 30.11% y 78.95% (p < 0,01), respectivamente, que los de la Grupo operado simulada (figura 4A, 4B). Estos resultados muestran que la Aβ composited puede producir deterioro de la retención de memoria en ratas.

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Figura 4 . Composited Aß producido deterioro de retención la memoria rata. La prueba de la sonda se utilizó para evaluar la retención de la memoria 1 dia nadar logro el día 3 en la prueba del laberinto de agua Morris, que se llevó a cabo en 81 post cirugía. (A) tiempo de natación, natación de distancia y cruzando número en Q1 dentro de 60 s en la prueba de la sonda (no plataforma). Datos fueron analizados por ANOVA de una vía con la prueba de rango múltiple. Media ± SEM. n = 6. ** p < 0.01, vs el grupo Sham-funcionado. (B) la piscina la trayectoria de ratas en el ensayo de la sonda. Grupo Sham operado (A), mostrando la mayor piscina de tiempo y distancia en el cuadrante blanco (Q1). Grupo tratado con Aβ Composited (B), mostrando menos natación tiempo y distancia en cuadrante blanco (Q1). Figura ha sido modificada de referencia 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aβ composited había influenciado velocidad de nado de rata:

La rata de velocidad de natación se calculó mediante la prueba de plataforma visible el día 7 de prueba de laberinto de agua de Morris, que correspondió al día 85 post cirugía. La rata de velocidad, basado en el cálculo de la distancia y el tiempo que paso en la plataforma, de cada grupo en la piscina de la natación la natación no fue significativamente diferente. Por lo tanto, las diferencias individuales en la rata de velocidad de natación podrían ser excluidas, lo que indica que la motivación y las habilidades motoras eran esencialmente intactas en todas las ratas (figura 5).

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Figura 5 . Aβ composited influenciado velocidad de natación de la rata. La rata de velocidad de natación se calculó mediante la plataforma visible de prueba en el día 7 de la prueba del laberinto de agua Morris, que se llevó a cabo en el día 85 después de la operación. La rata de natación de velocidad de cada grupo no fue significativamente diferente. Datos fueron analizados por ANOVA de una vía con la prueba de rango múltiple. Media ± SEM. n = 6. Figura ha sido modificada de referencia 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aβ composited había causado cambio morfológico Neuronal de la rata:

Todas las ratas murieron por decapitación en día 86 de la cirugía. La inspección visual encontró que una superficie amarilla o una fina o contraída corteza cerebral apareció en varios compuestas ratas tratados con Aβ. Comparado con el grupo sham-funcionado (figura 6AA2), observación de microscopía óptica del grupo tratados con Aβ composited por él manchados, encuentran cambios patológicos de la neurona del hipocampo, como la degeneración Neurofibrilar, neuronophagia, picnosis nuclear y nuclear marginación (figura 6AB2). Además, la parte de la corteza cerebral en el grupo tratado con Aβ composited reveló la necrosis colliquative típico, que se caracteriza por alteración de las membranas celulares, núcleos fragmentados e infiltración de células inflamatorias extensas en la región necrótica ( Figura 6A B3). Esto indica que la Aβ composited puede resultar en lesiones patológicas estructurales neuronales en ratas.

Además de los cambios patológicos de la estructura neuronal, en comparación con el grupo sham-funcionado, la cuenta de neurona disminuyó también significativamente en el hipocampo y la corteza cerebral (a excepción de la muestra de necrosis colliquative) de los compuestos Grupo tratado con Aβ. El número de neuronas fue 63.86% (p < 0.01) más bajo que el grupo sham-operado en secciones CA1 hipocampales de 0,125 mm y 55.46% (p < 0.01) inferior en las secciones de la corteza cerebral de 0.0352 mm2 (Figura 6B), que sugiere que la Aβ composited puede resultar en un recuento de la neurona disminuida.

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Figura 6 . Aβ composited causó cambio morfológico neuronal rata. (A) imágenes representativas de hippocampal y cerebrales de las neuronas corticales teñidas con. (A1–B1) Hipocampo 40 x; (A2–B2) Hipocampo CA1 400 x; (A3–B3) Corteza cerebral x 400. (A1–A3) Grupo operado de farsa; (B1–B3) Grupo tratado con Aβ composited; muestra pérdida neuronal marcada degeneración Neurofibrilar (→), neuronophagia (←), picnosis nuclear (↗), marginación nuclear (↙) en hipocampo, necrosis colliquative típico (★), interrumpida las membranas celulares, gran cantidad de infiltrado de células inflamatorias en la corteza cerebral en la parte del grupo tratado con Aβ composited. Barra de escala de A1, B1 = 10 μm; Barra de escala de A2, A3, B2, B3 = 100 μm. (B) números de neuronas con tinción de en el hipocampo y la corteza cerebral, que se contaron bajo un microscopio óptico (400 x). Cada volumen representa la media ± SEM de 9 campos de visión de 3 muestras independientes (n = 3). ** p < 0.01, vs grupo Sham-funcionado.  Figura ha sido modificada de referencia 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La microscopia electrónica observa la ultraestructura subcelular de las neuronas del hipocampo. La subestructura de las neuronas hippocampal en el grupo tratado con Aβ composited (figura 7B1 – B4) destruyeron significativamente, mostrando Edema mitocondrial y rotura cristae, densidad de electrones mitocondrial aumentada, dilatados bruto retículo endoplasmático, Polirribosomas depolimerizadas y polymicrotubules, algunos densidad postsináptica (PSD), muchos lisosomas secundarios y sedimento de lipofuscina en el citoplasma, en comparación con el grupo sham-funcionado (Figura 7A1 – A4). La membrana nuclear era crudo y hundidos, la eucromatina se condensó y desnaturalizado, las capas de la envoltura de myelin fueron sueltas o fibras y axones internas y degeneración, fueron atenuadas.  Estos resultados demuestran que la Aβ composited puede producir daños a la sub-estructura neurona en ratas.

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Figura 7 . Estructura subcelular de neuronas hippocampal evaluados por observación en el microscopio electrónico. A1 -A4: Grupo Sham-funcionado. Barra de escala de A1 = 4 μm, con 12, 000 x; Barra de escala de A2 = 3 μm, 15, 000 x; Barra de escala de A3 = 5 μm, 10, 000 x; Barra de escala de A4 = 1 μm, con 35, 000 x. (B1–B4) Grupo tratado con Aβ composited. (B1) Neurona y pyknosis nuclear (←), condensación de eucromatina o degeneración (#), inflamación de pies de astrositos (*), las mitocondrias electrones alta densidad (▲), vaina de mielina capas sueltas o atenuación (→); (B2) GFAP mayor las mitocondrias electrones alta densidad (▲), vaina de mielina capas sueltas o (atenuación), lisosomas secundarios mayor (↑), picnosis del pericitos, condensación de eucromatina del pericitos o degeneración (☆), inflamación de pies de astrositos (*), densidad electrónica alta mitocondrias (▲), lipofuscin (↓), vaina de mielina capas sueltas o atenuación (→). B4: neurotransmisor excitatorio más (#), electrones alta densidad o lesión de membrana mitocondrias (▲), menos sinapsis. Barra de escala de B1, B2 = 10 μm, 5, 000 x; Barra de escala de B3 = 5 μm, 8, 000 x; Barra de escala de B4 = 1 μm, 40, 000 x. Figura ha sido modificada de referencia 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Composited Aß causada carga de Aß en las neuronas de rata:

Tinción de rojo Congo fue utilizado para detectar la carga de Aß en las neuronas. Los resultados muestran que la Aβ composited en particular puede inducir la carga intracelular de Aß en la rata hipocampo y corteza cerebral (figura 8A). El número positivo de células con Aβ rojo teñido de rojo Congo en el hipocampo y la corteza cerebral del grupo tratados con Aβ composited es 8.05 - y 4.09 veces (p < 0.01) mayor que los del grupo sham-funcionado (figura 8B). Esto demuestra que Aβ composited puede aumentar la carga de Aß de neurona en ratas.

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Figura 8 . Aβ composited causado carga Aβ en rata neuronas. (A) imágenes representativas de neurona positiva de Aβ manchada por el rojo Congo en el hipocampo y cerebral corticales. (A1–B1) Hipocampo CA1 400 x; (A2–B2) Corteza cerebral x 400. (A1–A2) Grupo operado de farsa; (B2deB1–) Compuestos grupo tratados con Aβ, muestra más Aß células mancharon de rojo Congo positivo. Barra de escala = 10 μm, 400 x. (B) números positivos de neuronas Aβ manchados por el rojo Congo en el hipocampo y la corteza cerebral, que se contaron bajo un microscopio óptico (400 x). Cada volumen representa la media ± SEM de 9 campos de visión de 3 muestras independientes (n = 3). ** p < 0.01, vs grupo Sham-funcionado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Composited Aß causada deposición de NFT en neuronas de rata:

Tinción de nitrato de plata se utilizó para la detección de la deposición de NFT en las neuronas. Los resultados demuestran que Aβ composited notablemente puede causar la deposición intracelular de NFT en la rata hipocampo y corteza cerebral (figura 9A). El número positivo de células con NFT marron manchado por nitrato de plata en el hipocampo y la corteza cerebral del grupo tratados con Aβ composited es 9.75 - y 4.82 veces (p < 0.01) mayor que los del grupo sham-funcionado (figura 9B ). Esto demuestra que la Aβ composited puede aumentar la agregación de NFT de neurona en ratas.

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Figura 9 . Composited Aß causa agregación de NFT en rata neuronas. (A) imágenes representativas de las neuronas NFT positivo manchadas de nitrato de plata en hipocampo y corteza cerebral. (A1–B1) Hipocampo CA1 400 x; (A2–B2) Corteza cerebral x 400. (A1–A2) Grupo operado de farsa; (B2deB1–) Grupo tratado con Aβ composited. mostrando el NFT más positivo células mancharon por nitrato de plata en el grupo tratado con compuestos. Barra de escala = 10 μm, 400 x. Neuronas (B) NFT positivo números de mancharon de nitrato de plata en hipocampo y corteza cerebral, que se contaron bajo un microscopio óptico (400 x). Cada volumen representa la media ± SEM de 9 campos de visión de 3 muestras independientes (n = 3). ** p < 0.01, vs grupo Sham-funcionado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Es bien conocido que la pérdida de memoria y el aprendizaje son importantes síntomas clínicos en pacientes de AD2. El procedimiento descrito aquí es un método en vivo para el estudio de AD; hemos adaptado un protocolo publicado anteriormente que probaron un medicamento para aliviar el déficits de memoria y lesiones neuronales en un modelo de rata4. Nuestro protocolo proporciona información importante para obtener datos valiosos, así como una tasa de supervivencia alta de animales que modelo con éxito operación, déficits de memoria, lesiones de la neurona, carga de Aß y deposición de NFT, para imitar el anuncio (en el presente experimento, la tasa de supervivencia y tasa de éxito del modelo de operación son más del 90%). Estas ratas de éxito del modelo se utilizaron para medir su memoria espacial con el test de laberinto de agua de Morris. El ensayo de navegación posicionamiento halló que la Aβ composited puede causar deterioro de adquisición de la memoria de rata; el ensayo de sondeo halló que la Aβ composited puede disminuir la retención de la memoria de rata; y la revocación de la prueba que la Aβ composited puede resultar en reaprender la debilitación de la rata. Estos datos de prueba del laberinto de agua Morris muestran que la Aβ composited puede inducir memoria espacial de la rata. En general, inyectando las ratas intracerebroventricularly con Aβ25-35 en combinación con AlCl3 y TGF-β1 creó un viable y creíble en vivo AD-como modelo para el laboratorio.

Estudios previos han demostrado que el volumen del cerebro en pacientes con EA es 10% menor que la de individuos sanos. Diferentes atrofias pueden encontrarse en el hemisferio cerebral por observación visual. El grado de atrofia cortical está relacionado positivamente con el deterioro de memoria19. En la histología, la gran cantidad de pérdida de neuronas y grave patología morfológica alterar directamente la función de memoria en pacientes de AD20. En el presente estudio, observación microscópica de luz/electrón encontró que las ratas microinyectadas con Aβ composited muestran dramáticos cambios neuropatológicos, incluyendo pérdida de la neurona y la interrupción de la estructura neuronal y subcelular. Este resultado corrobora el trastorno de memoria espacial de la rata inducido por Aß composited y es similar al estado de pacientes con EA.

Es bien sabido que la carga Aβ cerebral y agregación de NFT se consideran las características más importantes de histopathogenic en AD. Puede destruir la estructura neuronal, alterar la señalización neuronal, interrumpir la función neuronal y causar demencia avanzada17. El presente modelo animal encontrado carga de Aß y agregación de NFT en cerebro, que de acuerdo con el estado del paciente de AD. Por lo tanto, las lesiones de la neurona presente en ratas inducidas por Aβ composited pueden utilizarse como un modelo para estudiar la patología neuronal y estrategia de tratamiento de la EA.

Los siguientes son ejemplos de la investigación efectos de la droga en modelos de rata de AD: Zhao et al., informado que ambos flavonoides de escutelaria tallos y hojas (SSF) y Scutellaria barbata (SBF) puede atenuar el deterioro de la memoria de rata y apoptosis inducida por composited Aβ8,9. Guo et al., también informó de que SBF puede inhibir la agregación de NFT y tau proteína excesiva fosforilación en el lado Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 y Thr231 y disminuir la expresión de proteína y de mRNA GSK-3β, CDK5 y PKA en ratas tratados con Aβ composited21 . Al mismo tiempo, Shang et al., también han informado de que SBF puede suprimir la proliferación astrositos y microglia y menor Aβ1-40, Aβ1-42, y β-sitio APP unirse enzima 1 (BACE1) expresión del mRNA en el cerebro de Aβ composited ratas22. Basado en los resultados anteriores, nuestro modelo animal es ventajosa sobre otros modelo de AD-como, que implican más la función neuronal y desorden de la estructura.

Con respecto a otro modelo de AD-como inyección intracerebroventricular solo de Aß a las ratas puede causar déficits de memoria ratas, pérdida neuronal y proliferación de neurogliocyte, pero puede o no tener depósito de Aß y NFT23. Ratas expuestas a dosis altas Al parecen tener un alto índice de éxito, mimic AD y un modelo animal rentable, con deterioro de la memoria, pérdida neuronal, proliferación de neurogliocyte y placa senil (SP) y agregación de NFT en el cerebro. Sin embargo, la dosis alta de Al puede causar lesiones de hígado de rata y anorexia, acompañado de disminución de peso24. La de rata es otro modelo de AD-como. Las ratas envejecidas muestran déficits de memoria, cambios patológicos de la estructura neuronal/subestructura, deposición de lipofuscina, pero sin carga de Aß y agregación de NFT. Las ratas de más de 24 meses de edad son consideradas de edad para este modelo y por lo tanto requiere un período más largo de alimentación y así el costo es mayor de17,25. Ratones transgénicos SAMP8 y aplicación son el imitador más cercano a AD y más modelos ideales para la investigación de AD. Pero ambos modelos animales tienen un precio más alto y se limitan a utilizar en el laboratorio26,27. En comparación con los modelos animales anteriores, nuestro modelo de composited modelo animal tratada con Aβ tiene un menor costo y alto rendimiento, lo que es una herramienta ideal para el estudio de AD.

En conclusión, la inyección intracerebroventricular de Aβ25-35 combinado con AlCl3 y TGF-β1 a ratas ofrece un modelo animal valioso en vivo para entender mejor el deterioro de la memoria espacial, lesiones neuronales, carga de Aß y deposición de NFT AD subyacente. Este modelo proporciona un rápido y relativamente simple protocolo experimental con un animal de alta sobrevive tarifa y tasa de éxito alta modelo de operación, así como una alta tasa de duplicación, que demostró para ser más económico. El presente modelo animal es un modelo eficaz para imitar el anuncio y puede validar aún más por ser utilizado para imitar varias otras enfermedades.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El proyecto fue apoyado por la Fundación de Ciencias naturales Provincial de Hebei (no. C2009001007, H2014406048), la Administración Provincial de Hebei de la medicina tradicional China (Nº 05027) y el proyecto de construcción del tema clave de la Universidad Provincial de Hebei, China.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Rata Sprague-DawleyBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, ChinaSCXK (Jing) 2012-0001300– Laberinto de agua Morris de 350 g
Academia China de Ciencias Médicas e Instituto de Investigación Médica de la Unión de Pekín, ChinaNo
Anestesia móvil para animales pequeñosRWD Life Science Co., Ltd. ChinaR580
Aparato estereotáxico cerebralRWD Life Science Co., Ltd. China68001
Taladro de hueso flexibleShanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. ChinaBW-sD908
Microscopio electrónico de transmisiónJapan Co., Ltd. JapónJEM-1400
microinyección de dos canalesRWD Life Science Co., Ltd. ChinaRWD202
EM micrótomoHitachi Co., Ltd. ChinaH-7650
Cánula ficticiaRWD Life Science Co., Ltd. China620010.D.0.64 veces; I.D.0.0.45mm/M3.5
http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html
cánula guíaRWD Life Science Co., Ltd. China621010.D.0.40mm/M3.5
Cánula internaRWD Life Science Co., Ltd. China622010.D.0.41× I.D.0.25mm/figure-materials-1M3.5
Apriete la tuercaRWD Life Science Co., Ltd. China625010.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5
Tornillo de fijaciónRWD Life Science Co., Ltd. China62514M1.2× L2.0mm (100BAO)
El destornilladorRWD Life Science Co., Ltd. China6299945 * 1mm
PE TubingRWD Life Science Co., Ltd. China62302
Beta amiloide 25-35Sigma Aldrich Co. EE. UU.SCP0002-5MG
Factor de crecimiento transformante humano recombinante-β 1PeproTech Inc. EE. UU.100-21
Tricloruro de aluminioTianjin Kemiou Reactivo químico Co., Ltd. China3011080
Congo rojoTianjin Kemiou Reactivo químico Co., Ltd. China3010016
Nitrato de plataSinopharm Reactivo Chcmical Co., Ltd. China20150720
Material base para dentaduras postizasShanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. China 20170609
Bomba de

Referencias

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