Extracción de muestras y cuantificación cromatográfica simultánea de doxorrubicina y mitomicina C siguiendo la combinación del fármaco en nanopartículas en ratones con tumores

Summary

Este protocolo describe un proceso analítico eficaz y práctico de la extracción de muestra y determinación simultánea de múltiples fármacos, doxorrubicina (DOX), mitomycin C (MMC) y un metabolito DOX cardio tóxico, doxorubicinol (DOXol), en lo biológico muestras de un modelo de tumor de mama preclínicos tratadas con nanopartículas formulaciones de combinación de fármacos sinérgicos.

Abstract

Quimioterapia de combinación se utiliza con frecuencia en la clínica para el tratamiento del cáncer; sin embargo, los efectos adversos asociados al tejido normal pueden limitar su beneficio terapéutico. Combinación de fármacos basados en nanopartículas se ha demostrado para mitigar los problemas planteados por la terapia de la combinación libre de drogas. Nuestros estudios previos han demostrado que la combinación de dos fármacos contra el cáncer, doxorrubicina (DOX) y mitomicina C (MMC), produce un efecto sinérgico contra ambos murino y células de cáncer de mama en vitro. DOX y MMC Co cargados de lípidos de polímero híbrido nanopartículas (DMPLN) omite varias bombas transportador de eflujo que confieren multirresistencia y demostraron mayor eficacia en modelos de tumores de mama. En comparación con las formas de solución convencional, tal eficacia superior de DMPLN fue atribuida a la farmacocinética sincronizada de DOX y MMC y biodisponibilidad intracelular creciente de drogas dentro de las células del tumor de nanocarrier PLN.

Para evaluar la farmacocinética y la bio-distribución de co administra DOX y MMC en solución libre y formas de nanopartículas, un método simple y eficiente Análisis de múltiples fármacos con alto rendimiento de fase inversa de la cromatografía líquida (HPLC) fue desarrollado. En contraste con métodos previamente divulgados que analizan individualmente DOX o MMC en el plasma, este nuevo método HPLC es capaz de cuantificar simultáneamente DOX, MMC y un metabolito importante de DOX cardio tóxico, doxorubicinol (DOXol), en diversas matrices biológicas ( por ejemplo, sangre, tumor de mama y el corazón). Una doble punta de prueba fluorescente y ultravioleta absorbente 4-methylumbelliferone (4-MU) se utilizó como estándar interno (I.S.) para la detección de un solo paso de múltiples análisis de drogas con longitudes de onda de detección diferentes. Este método fue aplicado con éxito para determinar la concentración de DOX y MMC por enfoques de solución y nanopartículas en sangre entera y tejidos varios en un modelo Murino ortotópico mama tumor. El método analítico que se presenta es una herramienta útil para el análisis clínico previo de entrega basados en nanopartículas de combinaciones de fármacos.

Introduction

La quimioterapia es una modalidad de tratamiento primario para muchos tipos de cáncer, pero a menudo se asocia con efectos adversos graves y eficacia limitada debido a la resistencia a los medicamentos y otros factores^1,2,3. Para mejorar el resultado de la quimioterapia, se han aplicado regímenes de combinación de fármacos en la clínica basada en consideraciones tales como la no superposición de toxicidades, diferentes mecanismos de acción de los fármacos y drogas no-cross resistencia^{4,5 ,}

Protocol

todos los experimentos en animales fueron aprobados por el cuidado Comité de Universidad red de Salud Animal del Instituto de cáncer de Ontario y realizados de acuerdo con el Consejo Canadiense sobre directrices de cuidado Animal.

1. preparación de muestras biológicas

1. recoger la sangre, los órganos principales y tumor de mama en momentos predeterminados después de la administración intravenosa (i.v.) de drogas que contienen formulaciones (p. ej., DMPLN, DOX liposómica)
   1. inyectar un i.v. de ratón con tumores de mama con una formulación que contiene el medicamento preparada.
   2. Anestesiar e....

Results

Dos medicamentos contra el cáncer, DOX y MMC, así como el metabolito DOX, DOXol, fueron detectado simultáneamente sin ninguna interferencia biológica bajo las mismas condiciones HPLC de gradiente aplicada utilizando 4-MU como el I.S. para los detectores de UV y fluorescencia. DOX, MMC, DOXol y 4 MU estaban bien separados unos de otros con tiempos de retención de 5,7 min para MMC, 10,4 min DOXol, 10,9 min 4-MU y min 11,1 para DOX (figura 2). Cada medicamento e.......

Discussion

En comparación con otros métodos cromatográficos que permitan la detección de especies de un solo medicamento a la vez, el presente Protocolo HPLC es capaz de cuantificar simultáneamente tres compuestos de la droga (DOX, MMC y DOXol) en la misma matriz biológica sin necesidad de cambiar la fase móvil. Este método de preparación y el análisis se ha aplicado con éxito para determinar la farmacocinética y bio-distribución de dos sistemas de entrega de medicamentos basados en nanopartículas (es decir, la DOX y DMPLN.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Doxorrubicina	Polymed Theraeutics	111023	medicamento contra el cáncer
Mitomicina C	Polymed Theraeutics	060814	medicamento contra el cáncer
Doxorrubicinol (DOXol)	Toronto Research Chemicals	D558020	Metabolito de la
sal sódica DOX 4-metilobelifelona	Sigma-Aldrich	M1508	Estándar interno
Ácido mirístico	Sigma-Aldrich	544-63-8	Materiales para nanopartículas híbridas polilipídicas
Polioxietileno (100) Espectro de estearato		M1402	Materiales para nanopartículas híbridas polilipídicas
Polioxietileno (40) Estearato	Sigma-Aldrich	P3440	Materiales para nanopartículas híbridas polilipídicas
Pluronic F68 (PF68)	BASF Corp.	9003-11-6	Materiales para nanopartículas híbridas polilipídicas
Ultrasonicación (UP100H)	Hielscher, Tecnología de ultrasonidos	NA	Preparación de nanopartículas
Baño de agua (ISOTEMP 3016HS)	Fisher Scientific	NA	Preparación de nanopartículas
Doxorrubicina liposomal  (Caelyx)	Janssen	Comprado en la farmacia Princess Margaret Hospital	Formulación de nanopartículas clínicamente aprobada
Metanol con grado de HPLC	Caledon Chemicals	6701-7-40	Composición de fase móvil
de HPLC Clasificación de HPLC H2O	Caledon Chemicals	8801-7-40	Composición de fase móvil de HPLC
Acetonitrilo con grado de HPLC	Caledon Chemicals	1401-7-40	HPLC composición de fase móvil
ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich	302031	composición de fase móvil de HPLC
0,45 μ m Membrana de nylon Papel de filtro Whatman		WHA7404004	HPLC Preparación de fase móvil
Jeringas de plástico de 1 cc	Becton, Dickinson and Company	2606-309659 Inyección de	tratamiento
Jeringas de plástico de 5 cc	Becton, Dickinson and Company	2608-309646 Colecciones de	tejidos
30G 1/2 Agujas Becton	, Dickinson and Company	305106	Inyección de tratamiento
25G 5/8 Agujas	Becton, Dickinson and Company	305122	Colecciones de tejidos
Estéril 0,9% solución salina	Universidad de Toronto Marca de la casa 1011	Perfusión de tejidos
13 ml Tubo cónico de fondo redondeado	SARSTEDT	62.515.006	Prolyprolene, homogeneización de tejidos
Medio Esencial Mínimo Alfa (MEM)	Gibco	12571063	Medio celular
1 x Tampón de fosfato solución salina	Gibco	10010023	Homogeneización
de tejidos Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100 ML	Homogeneización de tejidos
Ácido fórmico	Caledon Chemicals	1/5/3840	Ajuste el pH para la extracción Solvente
Heparina de sodio Tubos de plástico rociados Becton	, Dickinson and Company	367878	Extracción de sangre
Balanza de pesaje analítico	Sartorius	CPA225D	Medidores
pH NA	Fisher Scientific	13-637-671	accumet BASIC
Mezclador de vórtice	Fisher Scientific	02-215-365	Muestras de vórtice a la velocidad deseada
1,5 ml  tubo de microcentrífuga	Fisherbrand	2043-05408129	Prolyprolene
Modelo 1000 homogeneizador	Fisher Scientific	08-451-672	Homogeneización de tejidos
centrífuga 5702R	Eppendorf	5702R Preparación de	la extracción
Sistema de evaporador calentado	Glas-Col	NA	Reconstitución de muestras
HPLC Rosca de tornillo Viales DIKMA		5320	Inyección de muestras de HPLC
Tapones de rosca de HPLC con septos de silicona blanca de PTFE	DIKMA	5325	Inyección de muestras de
HPLC Inserto de polipropileno HPLC	Agilent Technologies	5182-0549	Volumen máximo 250 μ l, inyección de muestras por HPLC
Xbridge C18 Column	Waters Corporation	186003117	Bomba de gradiente para análisis de fármacos
	Waters Corporation	W600	Muestreador
automático de análisis de	Waters Corporation	W2707	Análisis
de drogas Detector de matriz de fotodiodos	Waters Corporation	W2998	Análisis de drogas
Multi λ detector de fluorescencia	Waters Corporation	W2475	Análisis de medicamentos
EMPOWER 2	Waters Corporation	NA	Software de análisis de datos
Scientist	Micromath	NA	Análisis farmacocinético
Female Balb/c	Ratones Jackson Laboratory	001026	Células
cáncer de mama EMT6/WT	Proporcionado por el Dr. Ian Tannock; Instituto del Cáncer de Ontario	NA	In vivo