Muchas enfermedades oculares visión-que amenaza se asocian a microvasos retiniana disfuncional. Por lo tanto, la medición de las respuestas de la arteriola retiniana es importante investigar los mecanismos fisiopatológicos subyacentes. Este artículo describe un protocolo detallado para ratón arteriola retiniana aislamiento y preparación para evaluar los efectos de sustancias vasoactivas en el diámetro vascular.
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Artículo de método
Pasos de preparación para la medición de la reactividad en ratón arteriolas retinianas Ex Vivo
En este artículo
Resumen
Resumen
Insuficiencia vascular y alteraciones en la perfusión retiniana normal están entre los principales factores para la patogenesia de varios avistar-que amenaza enfermedades oculares, como retinopatía diabética, retinopatía hipertensiva y, posiblemente, glaucoma. Por lo tanto, las preparaciones microvasculares retinianas son herramientas fundamentales para estudios fisiológicos y farmacológicos delinear los mecanismos fisiopatológicos subyacentes y diseño de terapias para las enfermedades. A pesar del amplio uso de modelos murinos en investigación oftálmica, escasean los estudios sobre la reactividad vascular retiniana en esta especie. Una de las principales razones para esta discrepancia es los procedimientos de aislamiento difícil debido al pequeño tamaño de estos vasos sanguíneos retinianos, que es ~ ≤ 30 μm de diámetro luminal. Para evitar el problema de aislamiento directo de estos microvasos retinianas para estudios funcionales, se estableció una técnica de aislamiento y preparación que permite estudios ex vivo de la vasoactividad de retina de ratón bajo condiciones fisiológicas cerca . Aunque la preparación experimental actual se refiere específicamente a las arteriolas retinianas de ratón, esta metodología puede ser fácilmente empleada para microvasos de ratas.
Introducción
Alteraciones en la perfusión retiniana han sido implicados en la patogenia de varias enfermedades oculares, como retinopatía diabética, retinopatía hipertensiva y el glaucoma1,2,3. Así, estudios para medir la reactividad vascular en la retina son importantes para entender la fisiopatología de estas enfermedades y desarrollar el nuevo tratamiento se acerca.
Debido a la posibilidad de manipulación de genes en el genoma del ratón, el ratón se ha convertido en un modelo animal ampliamente utilizado para los estudios del sistema cardiovascular4. Sin embargo, debido al pequeño tamaño de los vasos sanguíneos retinianos (≤ 30 μm), medición de la reactividad vascular en la retina del ratón es difícil. Por ejemplo, técnicas estereoscópica para la medición en vivo están limitadas en su resolución óptica y por lo tanto, sólo permiten para detectar exactamente cambios en diámetro o sangre flujo en sangre pequeñas de menos de ≤ 30 μm de diámetro cuando está equipado con sofisticado dispositivos adicionales, tales como un microscopio confocal usando colorantes fluorescentes o la adaptación óptica escaneo luz oftalmoscopio5,6. Por otra parte, la interpretación de en vivo medidas encaminadas a identificar locales señalización mecanismos en los vasos sanguíneos retinianos pueden confundirse por anestésicos, cambios en la presión arterial sistémica y la influencia de los vasos sanguíneos retrobulbares.
Por lo tanto, hemos desarrollado un método para medir las respuestas de los vasos sanguíneos retinianos ratón con óptica de alta resolución ex vivo. La técnica aquí presentada permite la visualización de arteriolas retinianas mediante transmisión microscopia ligera. Este método, que también puede ser utilizado en ratas, proporciona acceso a las ventajas del gene targeting tecnología en investigación vascular ocular.
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Protocolo
Los procedimientos experimentales de este estudio fueron aprobados por el Animal cuidado Comité de Renania-Palatinado, Alemania. Cuidado de los animales conforme a las directrices institucionales y la Asociación para la investigación en visión y Oftalmología (ARVO) declaración para el uso de animales en oftálmica y la visión. Los animales fueron tratados según la Directiva 2010/63/UE para experimentos con animales. Hombres ratones C57BL/6J (el Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME, Estados Unidos) 3-4 meses de edad se utilizaron para los experimentos. Los animales fueron alojados bajo condiciones estándar (temperatura de 23 ± 2 ° C, humedad rango 55 ± 10% y 12 h de ciclos de luz/oscuridad) y tenían acceso a ratón estándar chow y agua ad libitum.
1. aislamiento de Retina de ratón
- Colocar los instrumentos de disección sobre la mesa de preparación y comprobar si todos los instrumentos están completos para permitir una rápida preparación.
- El ratón de sacrificio por inhalación de CO2 .
- Decapitar el ratón con tijeras de acero, corte el cráneo sagitally en dos mitades con el mismo par de tijeras y quitar la piel y el cerebro usando las tijeras de ojo (figura 1).
- Cortar el hueso del cráneo para dejar solo el hueso orbital usando tijeras de ojo.
- La órbita de transferencia en una bandeja de disección con tampón Krebs-Henseleit helada.
- Mantener el plato de la disección en el hielo o cambiar el tampón cada 10 minutos.
- Cortar el hueso orbital usando tijeras de ojo y retire suavemente el globo ocular junto con el tejido orbital usando tipo precisión 4 pinzas y tijeras de Vannas estudiante primavera (figura 2).
- Retire suavemente la glándula de Harder, tejido conectivo y los músculos extraoculares con tipo precisión 5 pinzas y tijera Vannas, teniendo cuidado de no para dañar la rama principal de la arteria oftálmica.
- Ligar las ramas orbitarias de la arteria oftálmica y finalmente el extremo proximal de la rama principal de la arteria oftálmica con suturas de Nylon 10-0 (figura 3).
- Transferencia del globo del ojo en una placa Petri que contiene etanol al 70% para 10 s uso tipo 4 pinzas de precision. Coloque el globo del ojo en el plato de disección y cambiar el búfer con solución fresca de Krebs. La córnea aparece blanquecina después de la exposición de etanol.
- Punción de la córnea periférica con una aguja de 30 calibre y diseccionar la córnea utilizando tijera Vannas. Suavemente cortar el tejido del iris, coloque un punto agudo de la tijera Vannas entre la coroides y la retina y corte la coroides y la esclera. Dejar algún tejido escleral alrededor del nervio óptico (figura 4).
2. montaje de la Retina en la cámara de perfusión
Nota: La cámara de perfusión utilizada para experimentos de arteriola retiniana es hecho en casa. Consiste en un depósito transparente con un tubo interior y la salida (figura 5). Uno de los extremos de un tubo de silicona se pega a la parte inferior de la cámara con histoacryl adhesiva y el otro extremo conectado a una llave de tres vías. Conecte una jeringa que contiene tampón Krebs fresca de la llave de tres vías y llene el tubo con tampón.
- Tome una micropipeta de vidrio con un sostenedor de la aguja y empuje en el extremo del tubo en la parte inferior de la cámara de perfusión. Entonces rompe la punta de la micropipeta con tijeras tipo 4 para obtener una propina de 100 μm de diámetro.
- En la punta de la micropipeta y lavarlo a través de la jeringa conectada al tubo. Tenga cuidado de que el capilar no está obstruido por escombros. En caso de obstrucción, quitar, lavar la tubería e inserte otra micropipeta.
- Llene la cámara de perfusión con tampón Krebs frío y poner la cámara en un microscopio estéreo.
- Coloque una plataforma de plástico transparente en la cámara de perfusión. Esta plataforma tiene una sangría de 1,8 mm de ancho para el nervio óptico y la arteria oftálmica y se coloca en dos alambres de acero de 1,6 mm de diámetro. Luego, coloque un anillo de acero inoxidable de 2,8 mm de diámetro interior y 4,0 mm de diámetro exterior en la plataforma.
- Transferir la retina con el nervio óptico y arteria oftálmica adjuntada de la sala de disección en la cámara de perfusión con cuidado con una cuchara. Este paso es importante para evitar el potencial de estiramiento de los tejidos ya que puede ser perjudicial para el experimento.
- Cortar la parte suturada del extremo proximal de la arteria oftálmica, coloque dos lazos preformados de sutura de nylon 10-0 en la micropipeta y cannulate la arteria oftálmica con la micropipeta. Atar la arteria para la micropipeta (figura 6) y colocar la retina en la plataforma transparente usando pinzas de punto fino.
- Suavemente Abra el capsula anterior lente con dos pinzas de punta fina, tire de la lente y corte el capsula entera de la lente usando microscissors.
- Posteriormente, hacer cuatro incisiones radiales en la retina de mitad de la distancia de la plana de las igualdades al nervio óptico y coloque un anillo de acero inoxidable en la retina para fijarlo a la parte inferior. La retina está lista para el experimento (figura 7).
3. preparación de las arteriolas retinianas para el experimento
- Coloque la cámara de perfusión bajo un microscopio de luz. El objetivo es una lente de objetivo 100 X inmersión en agua.
- Conecte las mangueras de dos para en - y hacia fuera - flujo a una bomba pericíclicas y circular de la cámara con tampón Krebs oxigenada con 95% O2 y gas con 5% CO2 a 37 ° C. Utilice una tasa de flujo entre 100 y 120 mL/min.
- Conecte el tubo de silicona, que está conectado con la micropipeta, a un depósito de silicona manguera mediante una llave de tres vías. Luego, llenar el depósito con tampón Krebs a una altura correspondiente a 50 mm Hg pero no ha abierto la llave de tres vías.
- Mire a través de los objetivos del microscopio y foco en la superficie retiniana. Búsqueda de los vasos sanguíneos o células de sangre rojas. Es posible que los vasos sanguíneos se derrumbado totalmente, a veces solamente que algunas células de sangre rojas son visibles.
- Cuando se encuentra un vaso sanguíneo, se centran en él y abrir la llave de tres vías. El diámetro del vaso debe aumentar inmediatamente y los glóbulos rojos ya sea centrifugada, si se trata de una arteriola, o centripetally en caso de una vénula. Las arteriolas son más pequeñas en diámetro en comparación con vénulas del mismo orden.
- Una vez que encuentra un vaso sanguíneo con una pared bien visible, puede ser empleado para los experimentos después de un período de equilibrio de 30 min (figura 8). Durante el período de equilibrio, las arteriolas desarrollan solamente débil tono intrínseco lo que resulta en menos del 10% de reducción del diámetro luminal.
4. realizar el experimento
- Probar la viabilidad de los vasos con el tromboxano mimética 9,11-dideoxy-9α, 11α-methanoepoxy prostaglandina F2α (U46619) añadiendo a la solución del baño. Este agente constricts arteriolas retinianas de ratón de aproximadamente el 50% del diámetro de reclinación a concentraciones ≥ 10-6 M.
- Una vez el barco es viable lavar al agonista de la bañera por la bomba de circulación y fuente buffer Krebs fresca en el baño.
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Resultados
U-46619 produjo vasoconstrictor dependiente de la concentración de respuestas en arteriolas retinianas de tipo salvaje ratones C57Bl/6J del fondo de la. En una concentración de 10-6 M, reducción del diámetro luminal fue ≈50% de diámetro de descanso. Figura 9A muestra una curva de respuesta de concentración representativa de una arteriola retiniana. En las arteriolas preconstricted con U46619, administración acumulativa de acetilcolina evocados depe...
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Discusión
La medición de las respuestas vasculares en la retina del ratón es difícil debido al pequeño tamaño de los vasos sanguíneos retinianos. Con la técnica presentada, arteriolas retinianas se visualizan por microscopia de luz transmitida. Esto es posible, porque la retina aislada es translúcida. La ventaja de la técnica es la alta resolución óptica. La resolución espacial calculada es 11 px/μm. Sin embargo, la resolución real de este sistema óptico que utiliza la luz blanca es entre 200 y 300 nm, que se explica por el límite...
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Divulgaciones
Los autores tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la und Ernst Berta Grimmke Stiftung y la Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (el perro).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tijeras de acero | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Tijeras de ojo | Geuder | G-19390 | 1x rectas, 10,5 cm |
| Pinzas de precisión, rectas con puntas finas | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x tipo 4 |
| Pinzas de precisión, rectas con puntas extrafinas | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x |
| tijeras de capsulotomía tipo 5 Vannas | Geuder | 19760 | 1x recta, 77 mm |
| Student Vannas Tijeras de resorte Fine | Science Tools | 91501-09 | 1x curvado, |
| Barraquer Portaagujas | Geuder | G-17500 | 1x curvo, 120 mm |
| Aguja | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 30 G |
| (para la producción de micropipetas) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1,2 x 0,8 mm; diámetro exterior/interior) |
| Sutura de nailon | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Placa de cultivo celular Nunclon | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm de diámetro |
| Placa de cultivo celular Nunclon | Thermo Fisher Scientific | 172931 1x 100 mm de diámetro | |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesivo | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Nombre | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Equipo | |||
| Bomba pericíclica (CICLOTECA II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Extractor de pipetas vertical modelo 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscopio (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Objetivo de inmersión en agua LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Cámara digital (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Cámara de perfusión | de fabricación propia | 1 vez | |
| Name | Company | >Número de catálogo | >Comentarios |
| Medicamentos y soluciones | |||
| Etanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Cloruro de calio (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Fosfato de dihidrógeno de calio (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Sulfato de magnesio (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Hidrogenocarbonato de sodio (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucosa monohidratada | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-didesoxi-9α,11α-metanoepoxi prostaglandina F2&alfa; (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Cloruro de acetilcolina | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
Referencias
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
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Reimpresiones y permisos
