Muchas enfermedades oculares visión-que amenaza se asocian a microvasos retiniana disfuncional. Por lo tanto, la medición de las respuestas de la arteriola retiniana es importante investigar los mecanismos fisiopatológicos subyacentes. Este artículo describe un protocolo detallado para ratón arteriola retiniana aislamiento y preparación para evaluar los efectos de sustancias vasoactivas en el diámetro vascular.
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Artículo de método
Pasos de preparación para la medición de la reactividad en ratón arteriolas retinianas Ex Vivo
En este artículo
Resumen
Resumen
Insuficiencia vascular y alteraciones en la perfusión retiniana normal están entre los principales factores para la patogenesia de varios avistar-que amenaza enfermedades oculares, como retinopatía diabética, retinopatía hipertensiva y, posiblemente, glaucoma. Por lo tanto, las preparaciones microvasculares retinianas son herramientas fundamentales para estudios fisiológicos y farmacológicos delinear los mecanismos fisiopatológicos subyacentes y diseño de terapias para las enfermedades. A pesar del amplio uso de modelos murinos en investigación oftálmica, escasean los estudios sobre la reactividad vascular retiniana en esta especie. Una de las principales razones para esta discrepancia es los procedimientos de aislamiento difícil debido al pequeño tamaño de estos vasos sanguíneos retinianos, que es ~ ≤ 30 μm de diámetro luminal. Para evitar el problema de aislamiento directo de estos microvasos retinianas para estudios funcionales, se estableció una técnica de aislamiento y preparación que permite estudios ex vivo de la vasoactividad de retina de ratón bajo condiciones fisiológicas cerca . Aunque la preparación experimental actual se refiere específicamente a las arteriolas retinianas de ratón, esta metodología puede ser fácilmente empleada para microvasos de ratas.
Introducción
Alteraciones en la perfusión retiniana han sido implicados en la patogenia de varias enfermedades oculares, como retinopatía diabética, retinopatía hipertensiva y el glaucoma1,2,3. Así, estudios para medir la reactividad vascular en la retina son importantes para entender la fisiopatología de estas enfermedades y desarrollar el nuevo tratamiento se acerca.
Debido a la posibilidad de manipulación de genes en el genoma del ratón, el ratón se ha convertido en un modelo animal ampliamente utilizado para los estudios del sistema cardiovascular
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Protocolo
Los procedimientos experimentales de este estudio fueron aprobados por el Animal cuidado Comité de Renania-Palatinado, Alemania. Cuidado de los animales conforme a las directrices institucionales y la Asociación para la investigación en visión y Oftalmología (ARVO) declaración para el uso de animales en oftálmica y la visión. Los animales fueron tratados según la Directiva 2010/63/UE para experimentos con animales. Hombres ratones C57BL/6J (el Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME, Estados Unidos) 3-4 meses de edad se utilizaron para los experimentos. Los animales fueron alojados bajo condiciones estándar (temperatura de 23 ± 2 ° C, humedad rango 55 ± 10% y 12 h de cicl....
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Resultados
U-46619 produjo vasoconstrictor dependiente de la concentración de respuestas en arteriolas retinianas de tipo salvaje ratones C57Bl/6J del fondo de la. En una concentración de 10-6 M, reducción del diámetro luminal fue ≈50% de diámetro de descanso. Figura 9A muestra una curva de respuesta de concentración representativa de una arteriola retiniana. En las arteriolas preconstricted con U46619, administración acumulativa de acetilcolina evocados depe.......
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Discusión
La medición de las respuestas vasculares en la retina del ratón es difícil debido al pequeño tamaño de los vasos sanguíneos retinianos. Con la técnica presentada, arteriolas retinianas se visualizan por microscopia de luz transmitida. Esto es posible, porque la retina aislada es translúcida. La ventaja de la técnica es la alta resolución óptica. La resolución espacial calculada es 11 px/μm. Sin embargo, la resolución real de este sistema óptico que utiliza la luz blanca es entre 200 y 300 nm, que se explica por el límite.......
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Divulgaciones
Los autores tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la und Ernst Berta Grimmke Stiftung y la Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (el perro).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tijeras de acero | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Tijeras de ojo | Geuder | G-19390 | 1x rectas, 10,5 cm |
| Pinzas de precisión, rectas con puntas finas | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x tipo 4 |
| Pinzas de precisión, rectas con puntas extrafinas | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x |
| tijeras de capsulotomía tipo 5 Vannas | Geuder | 19760 | 1x recta, 77 mm |
| Student Vannas Tijeras de resorte Fine | Science Tools | 91501-09 | 1x curvado, |
| Barraquer Portaagujas | Geuder | G-17500 | 1x curvo, 120 mm |
| Aguja | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 30 G |
| (para la producción de micropipetas) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1,2 x 0,8 mm; diámetro exterior/interior) |
| Sutura de nailon | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Placa de cultivo celular Nunclon | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm de diámetro |
| Placa de cultivo celular Nunclon | Thermo Fisher Scientific | 172931 1x 100 mm de diámetro | |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesivo | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Nombre | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Equipo | |||
| Bomba pericíclica (CICLOTECA II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Extractor de pipetas vertical modelo 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscopio (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Objetivo de inmersión en agua LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Cámara digital (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Cámara de perfusión | de fabricación propia | 1 vez | |
| Name | Company | >Número de catálogo | >Comentarios |
| Medicamentos y soluciones | |||
| Etanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Cloruro de calio (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Fosfato de dihidrógeno de calio (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Sulfato de magnesio (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Hidrogenocarbonato de sodio (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucosa monohidratada | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-didesoxi-9α,11α-metanoepoxi prostaglandina F2&alfa; (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Cloruro de acetilcolina | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
Referencias
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coheren....
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Reimpresiones y permisos
