Inyección pronuclear de (PN) del cluster regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) y sistema CRISPR asociados 9 proteína nucleasa (CRISPR/Cas9) es un método altamente eficiente para la producción de transgénicos hámsters sirios dorados. Adjunto, describimos el protocolo detallado de la inyección del PN para la producción de hamsters de gene knockout con el sistema CRISPR/Cas9.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Producción de hámsters sirios dorados genéticamente por inyección Pronuclear del complejo CRISPR/Cas9
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La técnica de inyección pronuclear (PN) fue establecida en ratones para introducir material genético extraño en los pronúcleos de embriones en estadío de una célula. El material genético introducido puede integrar en el genoma embrionario y generar animales transgénicos con información genética extranjera después de transferencia de los embriones inyectados para favorecer a las madres. Tras el éxito en ratones, inyección de PN se ha aplicado con éxito en muchas otras especies animales. Recientemente, inyección de PN se ha empleado con éxito para introducir reactivos gene-modificar actividades, tales como el sistema CRISPR/Cas9, para lograr modificaciones genéticas específicas en varios laboratorios y especies animales de la granja. Además de dominar el conjunto especial de microinyección habilidades para producir animales genéticamente modificados mediante la inyección de PN, los investigadores deben entender la fisiología de la reproducción y el comportamiento de las especies objetivo, debido a que cada especie presenta único desafíos. Por ejemplo, embriones de hámster sirio dorado tienen único manejo requisitos en vitro que técnicas de inyección de PN no fueron posibles en esta especie hasta descubrimientos recientes de nuestro grupo. Con nuestro protocolo de inyección de PN de especies modificadas, hemos tenido éxito en producir varios knockout del gen (KO) y knockin hámsteres (KI), que se han utilizado con éxito para enfermedades humanas modelo. Aquí describimos el procedimiento de inyección de PN para entregar el CRISPR/Cas9 complejo a los cigotos del hámster, condiciones de manejo de embriones, procedimientos de transferencia de embrión, y cría necesaria para producir genéticamente modificado hámsteres.
Introducción
El hámster sirio dorado (Mesocricetus auratus) es uno de los roedores más ampliamente utilizados para la investigación biomédica. Según el Departamento de agricultura de Estados Unidos, se utilizaron hámsters aproximadamente 100.000 en los Estados Unidos en 2015, representando el 13% de uso animal, laboratorio total entre las especies cubiertas por la ley de Bienestar Animal (http://www.aphis.usda.gov; acceso 10 de marzo de 2017).
El hámster ofrece varias ventajas sobre otros roedores en el estudio de un número de enfermedades humanas. Por ejemplo, los adenocarcinomas ductal pancreático histopatología de amina N-nitrosobis(2-oxopro....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Los procedimientos descritos en este protocolo fueron aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de Utah State University (protocolo IACUC: 2484). Hamsters en este protocolo son el adultos (6-10 semanas de edad) LVG cepa hámsters sirios dorados. Los hámsteres están alojados en el vivero en el centro de Bioinnovation, Utah State University. Temperatura ambiente se encuentra a 23 ° C, humedad se establece en 40-50%, y se establece el ciclo de luz 14:00 (luz: oscuridad). Siempre que sea posible, procedimientos de manipulación y surugical de embriones deben realizarse con técnicas estériles.
1. sgRNA y Cas9/sgRNA ribonucle....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La eficiencia del protocolo descrito en la producción de transgénicos hamsters depende de los resultados de los siguientes dos pasos críticos: la tasa de nacidos vivos de hembras receptoras y del número de cachorros vivos con el previsto modificaciones genéticas. La tasa de nacidos vivos es resultado directo de la calidad del embrión y la habilidad de la persona realizando la inyección de PN y procedimientos de transferencia de embrión. Para asegurarse de que no se comprometa el potencial.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Para aprovechar mejor el potencial de hámsters sirios dorados como modelos de enfermedades humanas, hemos desarrollado un protocolo de inyección de PN para entregar un CRISPR/Cas9 complejo para el genoma de hámster. El protocolo de inyección PN optimiza varias variables claves, incluyendo el medio de cultivo de embriones, la temperatura y longitudes de onda de luz13. También existen varios procedimientos de manejo de animales hamster específicos que deben seguir para la realización con éxito de ge.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
ZW tiene intereses financieros en Auratus Bio, LLC., una empresa de biotecnología especializada en la creación de animales modificados genéticamente para investigación biomédica y las aplicaciones agrícolas.
Agradecimientos
Investigación en esta publicación fue apoyada por los institutos nacionales de alergias y enfermedades infecciosas (NIAID) de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número 1R41OD021979 (a ZW) y por una beca de investigación de última generación BioGreen 21 Programa, República de Corea, subsidio no. PJ01107704 (a ZW) y subsidio no. PJ01107703 (a IK). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud o BioGreen 21. Agradecemos a Dr. Nikolas Robl para editar el manuscrito.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 μ g/μ L (~6.1 μ M) |
| GeneArtTM Kit de síntesis de precisión | Invitrogen | A29377 | Para la síntesis de sgRNA |
| Albúmina a partir de suero humano | Sigma | A1653 | Para medio de cultivo |
| Iluminador | Nikon | NI-150 | Para transferencia de embriones |
| Incubadora | New Brunswick | Galaxy 14S | Para cultivo de embriones |
| Microforge | Narishige | PB-7 | Para la fabricación de agujas de inyección |
| Microscopio | Nikon | ECLIPSE Ti-S | Para microinyección |
| Microscopio | invitrogen | SMZ745T | Para la transferencia de embriones |
| Aceite mineral | Sigma | M1840 | Mantener en la oscuridad |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | Para la superovulación |
Referencias
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
