Artículo de método

Desarrollo de un modelo humano de preclínico de osteoclastogénesis de monocitos de sangre periférica cultivadas conjuntamente con líneas de células de cáncer de mama

DOI:

10.3791/56311

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13 de septiembre de 2017

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1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST), IRCCS

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe el desarrollo de un en vitro preclínicos modelo humano de osteoclastogénesis de monocitos de sangre periférica con líneas de celulares de cáncer de mama para imitar la interacción de osteoclastos células de cáncer. El modelo podría utilizarse para mejorar nuestra comprensión de la formación de metástasis ósea y mejorar las opciones terapéuticas.

Resumen

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La interferencia entre células tumorales y las células óseas en el microambiente óseo es fundamental para comprender el mecanismo de formación de metástasis ósea. Hemos desarrollado un en vitro totalmente humano modelo preclínico de cocultivo de células de cáncer de mama y monocitos en la diferenciación a osteoclastos. Hemos optimizado un modelo de osteoclastogénesis a partir de una muestra de sangre periférica de donantes sanos. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) primero fueron separadas por centrifugación de gradiente de densidad, sembradas a una densidad alta e inducidas a distinguir mediante la adición de dos factores de crecimiento (GFs): receptor activador del factor nuclear-κB ligando (RANKL) y macrófagos factor estimulante de colonias (MCSF). Las células se dejan en cultivo durante 14 días fijos y analizadas por análisis aguas abajo. En las metástasis óseas osteolíticas, uno de los efectos de la llegada de células de cáncer de hueso es la inducción de la osteoclastogénesis. Así nos desafió a nuestro modelo con co-cultivos de células de cáncer de mama para estudiar el poder de diferenciación de las células del cáncer con respecto a los GFs. Una forma sencilla de estudiar la interacción de la célula osteoclasto de cáncer debe realizar co-cultivos indirectas basadas en el uso de medio condicionado obtenidos de cultivos de células de cáncer de mama y se mezcla con medio fresco. Esta mezcla se utiliza para inducir la diferenciación de los osteoclastos. También hemos optimizado un método de cultura cooperación directa en que el cáncer de células en diferenciación de monocitos compartan el medio y secretadas factores de intercambio. Se trata de una mejora significativa sobre el método original de cultura cooperación indirecta como los investigadores pueden observar las interacciones recíprocas de los dos tipos celulares y realizar análisis posteriores de las células cancerosas y osteoclastos. Este método nos permite estudiar el efecto de las drogas en el microambiente óseo metastásico y a líneas celulares de semillas que no sean las derivadas de cáncer de mama. El modelo también puede utilizarse para estudiar otras enfermedades como la osteoporosis u otras condiciones de hueso.

Introducción

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El hueso es un sitio común de metástasis para los diferentes tipos de tumores primarios como el cáncer de próstata, de pulmón y de mama, con 20-25% de pacientes que desarrollan metástasis óseas en el curso de la enfermedad1,2,3. En particular, el 70% de pacientes con cáncer de mama llevar evidencia de la metástasis del hueso en muerte4. Tumor y células estromales interacción es esencial para la progresión del cáncer en cáncer primario y lesiones secundarias. En el microambiente óseo, metástasis óseas osteolíticas del cáncer de mama dependen de la creación de un círculo vicioso patológico que se produce entre las células cancerosas, las células óseas y el microambiente óseo. Las células cancerosas alteran equilibrio óseo, aumento de resorción de hueso5,6,7.

En condiciones normales y patológicas, los osteoclastos son las células responsables de resorción del hueso, mientras que los osteoblastos, en depósito de nueva matriz, son responsables de la formación de hueso nuevo8. Actividad de los osteoclastos está regulada por los osteoblastos a través de la expresión de RANKL, que se une a su receptor RANK en la superficie de los osteoclasta, inducir la fusión de los osteoclasta, un proceso necesario para la diferenciación a osteoclastos maduros. La inducción de la osteoclastogénesis aumenta la resorción del hueso. Un gran número de estudios en vivo ha mejorado significativamente nuestra comprensión del hueso metástasis formación9,10,11. Las células de cáncer de mama desde el tumor primario y en el microambiente óseo perturban la homeostasis del hueso, promoción de la osteoclastogénesis y8de la resorción del hueso. En este escenario, todas las interacciones moleculares que se producen entre las células cancerosas y osteoclastos son de crucial importancia. Como ya se mencionó, el mecanismo de formación de metástasis de hueso ha sido dilucidado en modelos de ratones en vivo . Sin embargo, además de la necesidad de la aprobación de todos en vivo los experimentos con animales por el Comité de ética, hay varios otros inconvenientes para realizar en vivo experimentos incluyendo métodos desperdiciadores de tiempo y altos costos. Varios autores han combinado modelos en vivo y en vitro preclínicos de osteoclastogénesis usando una línea murina de osteoclastos antes llamado RAW246.79,10,11. Los inconvenientes de este modelo provienen del hecho de que las células ya se han comprometido a convertirse en los osteoclastos y no son de origen humano. Por estas razones, investigación traslacional podría beneficiarse grandemente de la disponibilidad de en vitro modelos preclínicos plenamente humana para estudiar interacciones de celular de cáncer de hueso.

Hemos optimizado un método de osteoclastogénesis en vitro a partir de muestras de sangre periférica12,13. Los osteoclastos derivan de monocitos, que están presentes, aunque en un grado pequeño, en muestras de sangre periférica. Las células mononucleares se separan primero de los eritrocitos y granulocitos en sangre por gradiente de densidad Ficoll; luego se seleccionan gracias a su capacidad para adherirse al sustrato de plástico, a diferencia de los linfocitos. Después de la siembra, las células se cultivan durante 14 días. MCSF y RANKL son GFs requeridos por monocitos diferenciar primero en macrófagos y luego en osteoclastos14,15. MCSF es necesario para toda la duración del ensayo, mientras que el RANKL se utiliza para inducir el proceso de diferenciación en las etapas finales de la osteoclastogénesis. En la fase temprana de la diferenciación, MCSF ayuda a monocitos proliferar y sobrevivir14,15. Durante la segunda parte de la osteoclastogénesis, las células se fusionan y maduran como osteoclastos, que muestra la distribución característica de F actina en anillos y expresan marcadores específicos tales como la fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP) y del receptor de calcitonina (CTR) 14 , 15. nuestro método consiste en Añadir MCSF a la cultura de monocitos para los primeros 7 días de la experiencia y una combinación de MCSF y RANKL de días 7 a 14. Al final del experimento, se analizan la osteoclastogénesis contando las células diferenciadas, como se detalla a continuación.

Los cultivos de monocitos inducidos a distinguir por GFs forman la base de nuestro modelo preclínico. Hemos optimizado un sistema de cocultivo sin GFs para entender mejor el poder de la osteoclastogenic de las células de cáncer de mama. Primero desarrollamos un modelo de co-cultivos indirectas mediante la adición de un medio (80% α-medio esencial mínimo (MEM-α) y 20% acondicionado medio recogieron de un cultivo de células de cáncer de mama que sobre 90% confluente de células experimentaban diferenciación12 . El medio condicionado (no recogido en las condiciones de privación de suero) se recogió después de 24 horas y mezclados con medio fresco en una proporción de 1:4. El medio condicionado había inducido diferenciación osteoclasta significativo con respecto al control negativo. Sin embargo, como la información sobre la interacción recíproca entre células cancerosas y las células óseas se pierde cuando usando co-cultivos indirectas, hemos mejorado nuestro sistema mediante la realización directas co-cultivos. Siembran las células cancerosas en 0.4 μm inserta y los colocaba en los pozos donde las células mononucleares fueron plateadas. Usando este método, las células comparten el mismo medio e intercambian de proteínas secretadas. Así creamos un modelo preclínico plenamente humano de osteoclastogénesis inducida por las células de cáncer13.

Este sistema es extremadamente versátil y puede ser utilizado para fines de investigación, por ejemplo, en estudios farmacológicos investigar el papel de los fármacos en la metástasis del hueso. Nuestro modelo permite estudiar la eficacia y mecanismos de acción de tratamientos dirigidos a hueso o fármacos antitumorales en el microambiente óseo en presencia de células de cáncer13. Diseño de los experimentos con los correctos controles, es decir, las células cancerosas y osteoclastos cultivados individualmente, resulta más fácil comprender el impacto de la cultura de cooperación en la actividad de la droga. Este enfoque se vuelve aún más interesante cuando la droga en estudio apunta ambos cáncer células y osteoclastos, por ejemplo, everolimus16. Este modelo puede utilizarse también para identificar nuevas vías de interacción entre las células cancerosas y las células óseas.

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Protocolo

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osteoclastos humanos fueron distinguidos de PBMCs de donantes sanos que dieron consentimiento informado para participar en el estudio. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de ética local, conforme a las normas éticas establecidas en la declaración de Helsinki de 1964.

1. diferenciación de osteoclastos

Nota: recoger buffy o sangre periférica de donantes humanos sanos en EDTA. No use menos de 20 mL de sangre periférica. Buffy coats son preferibles porque tienen una mayor abundancia de células mononucleares. Realizar los siguientes pasos en una campana de cultivo estériles para tejidos.

  1. Sangre EDTA diluido 1:1 con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Resuspender bien.
  2. Capa en los medios de separación de linfocitos (PBS de la sangre: linfocitos separación los medios de comunicación, 2:1) en tubos de 50 mL.
    1. Pipeta de 30 mL de sangre diluida en PBS en un tubo de 50 mL.
    2. Suavemente la arpillera de 15 mL de medio de separación de linfocitos en la parte inferior del tubo de 50 mL.
  3. Centrifugar a 757 × g por 10 min a temperatura ambiente (sin frenos).
  4. Recolección de células mononucleares:
    1. recoger la capa blanca de células mononucleares con una pipeta de 5 mL sin agitar y colocar en un nuevo tubo de 50 mL.
    2. Diluir las PBMCs recogidos con 20 mL de PBS.
  5. Lavar las PBMCs:
    1. centrífuga a 225 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    2. Eliminar el sobrenadante por inversión del tubo. Repetir una vez.
  6. Lisis RBC:
    Nota: Si el precipitado de células es de color rojo, tratar las células con solución tampón de lisis de eritrocitos (véase Tabla de materiales).
    1. Poner el tubo de 50 mL en hielo.
    2. Añadir 5 mL de buffer de lisis de eritrocitos.
    3. Esperar 3-5 minutos para completar la lisis del eritrocito. El tiempo varía según el grado de contaminación de eritrocitos.
    4. Detener la reacción añadiendo 20 mL de PBS.
    5. Centrifugar a 225 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante por inversión del tubo.
      Nota: Opcional: si se realiza la lisis RBC, lave las PBMCs como se describe abajo.
  7. Lavado PBMCs:
    1. Añadir 20 mL de PBS y centrifugue a 225 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    2. Eliminar el sobrenadante por inversión del tubo.
  8. Resuspenda las células en α-MEM completo (suplementado con glutamina 1% (concentración inicial 100 X) y 10% suero bovino fetal).
  9. Contar las células con una cámara de Neubauer.
    1. Diluir la muestra 1: 100 en ácido acético glacial y 10 μl de la dilución para contar células.
    2. Contar por lo menos dos veces y calcular la media de repeticiones para obtener el número medio total de las células recogidas.
  10. Las células de la placa:
    1. placa de células a una concentración de 750.000 PBMCs por cm 2.
    2. Almacenar células plateadas en una incubadora a 37 ° C en una atmósfera de 5% CO 2.
      Nota: Diseño replica el experimento para incluir controles negativos, que son células que son tratadas con α-MEM completo normal sin MCSF o RANKL GFs. Recuerde realizar cada condición en al menos 3 técnicas. Realizar al menos 3 repeticiones biológicas.
  11. Cambiar el medio suplementado con GFs:
    1. esperar aproximadamente 3 horas después de la siembra de células y luego quitarlo del medio con una pipeta (200-1.000 μl) para eliminar desechos, células sueltas y eritrocitos de.
      Nota: Tenga cuidado al cambiar el medio para evitar el desprendimiento celular.
    2. Agregar nuevo completo α-MEM suplementado con 20 ng/mL de MCSF (500 μL/pocillo).
      Nota: Cuando el co-cultivo con células de cáncer, células de semilla el cáncer el día después de la siembra de PBMC.
  12. Cambiar el medio cada 2-3 días (α-MEM suplementado con 20 ng/mL de MCSF):
    1. descartar el medio de una pipeta de 200-1.000 μl.
    2. Agregar nuevo medio natural por una pipeta de 200-1.000 μl.
  13. 6-7 días después de la siembra de la célula, añadir 20 ng/mL de RANKL a α completa-MEM + MCSF.
  14. Cambiar al medio (α completa-MEM + MCSF + RANKL) cada 2-3 días:
    1. descartar el medio con una pipeta de 200-1.000 μl.
    2. Agregar nuevo medio con una pipeta de 200-1.000 μl. Detener la inducción de la diferenciación 14 días después de la siembra celular.
    3. Medio de desechar y lavar dos veces con PBS.
  15. Fijar las células con paraformaldehido:
    1. dejar seco de las células.
    2. Añadir paraformaldehído al 4% (véase Tabla de materiales).
    3. Incubar por 20 min a temperatura ambiente.
  16. Descartar paraformaldehido y lavar dos veces con 500 μl de PBS.
    PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; por favor, use guantes, máscara y anteojos.
  17. Permitir que las células se sequen.
  18. Trampa realizar tinción según el fabricante ' instrucciones (véase Tabla de materiales).
  19. Contar osteoclasta-como las células manualmente al microscopio con aumento 10 X; NA 0.30.
    Nota: Osteoclasta-como las células se denominan células TRAP + polycarion con al menos 4 núcleos.

2. Cultivos celulares de cáncer de

Nota: los experimentos pueden realizarse con diferentes tipos de líneas de células de adenocarcinoma de mama como SCP2 17, una línea de células de osteotropic origina de triple negativo humano línea de células de cáncer de mama (MDA-MB-231) y la línea hormonal positivo receptor celular MCF7.

  1. Las células de la cultura como una monocapa en frascos de 75 cm 2.
    1. Las células cancerosas de 1.000.000 de semillas en un frasco de 75 cm 2.
    2. Almacenar las células a 37 ° C en medio completo α-MEM suplementado con 1% glutamina y 10% suero bovino fetal en una atmósfera de 5% CO 2.
  2. Separar las células en una confluencia de alrededor del 90%:
    1. descartar el medio de lavado con PBS y añadir 2-3 mL de tripsina 1 X PBS.
    2. Incubar células durante 3-5 min a 37 ° C.
    3. Recoger las células separadas del frasco de 75 cm 2 por una pipeta de 10 mL, agregar 8 mL de medio completo para detener la reacción enzimática.
    4. Centrifugar a 225 x g por 5 min
  3. Lave las células de cáncer:
    1. añadir 10 mL de PBS.
    2. Centrifugar a 600 x g por 5 min
  4. Contar las células cancerosas con una cámara de Neubauer.
    1. Contar las células cancerosas por lo menos dos veces y calcular la media de repeticiones para obtener el número medio total de las células recogidas.

3. Directa co-cultivos de células cancerosas de un nd monocitos que experimentan diferenciación a osteoclastos

  1. de semilla de las células cancerosas en insertos (poro diámetro 0.4 μm):
    1. de semilla de las células cancerosas en una concentración de 4.000 células por cm 2.
    2. Incubar a 37 ° C y 5% CO 2.
      Nota: Semilla del cáncer las células el día después de la siembra de PBMC para el experimento de co-cultivo en 0,4 μm insertos.
  2. Espere 24 h permitir que las células se adhieran.
  3. Lugar los sembrados Inserte la cultura sobre las culturas mononucleares para iniciar la cultura Co (ver sección 1.10 del Protocolo).
  4. Cambiar el medio cada 2-3 días con α-MEM completo.
    1. Descartar el medio con una pipeta de 200-1.000 μl.
    2. Añadir 500 μl de fresco medio.
      Nota: El objetivo principal de la cultura Co es entender el poder de la osteoclastogenic de las células cancerosas, por lo tanto, el GFs no se agregan a α-MEM. En cada experimento de co-cultivo, son necontrol negativo (ver nota en paso 1.10 del Protocolo) y controles positivos de los osteoclastos por RANKL y MCSF (sin células cancerosas). Las células cancerosas que siembran en los insertos no se coloca sobre las células mononucleares se utilizan como un control negativo de la cultura de cooperación.
  5. Parar el co-cultivo y utilice las células cancerosas para análisis posteriores:
    1. 13 días después de la siembra de PBMC y 12 días después de la siembra de células de cáncer, coloque la inserción en una placa nueva.
    2. Detener cultivo de células de cáncer en base a que análisis posteriores deben realizarse (ver discusión).
  6. El día 14, deje de diferenciación de osteoclastos y fijar las células, como se informó en el paso 1.15.
  7. Trampa realizar tinción inmediatamente o dentro de 14-30 días.
    Nota: La coloración opcional: para confirmar que las células TRAP + polycarion son los osteoclastos, los investigadores pueden realizar coloración adicional para detectar CTR, un marcador específico de los osteoclastos. La detección de anillos F-actina es otro osteoclasta-específico manchas ensayo 12 , 13 , 14.

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Resultados

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Un método fue optimizado para distinguir fácilmente los osteoclastos de monocitos de sangre periférica. La cultura de monocitos fueron cultivada con células de cáncer, confirmando (como se describe en la literatura18) que las células cancerosas son capaces de sostener la osteoclastogénesis en metástasis óseas. Osteoclastos se distinguen de las células cancerosas y GFs se muestran en la figura 1. Una célula osteoclasta-como es una célul...

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Discusión

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Preclínicos en vitro modelos de estudio de los mecanismos de interferencia entre las células cancerosas y las células óseas son necesarios para identificar los mecanismos de la metástasis del hueso que pueden usarse para crear nuevas estrategias terapéuticas. Hemos desarrollado un modelo plenamente humanos en vitro de osteoclastogénesis de sangre periférica (figura 3). Durante la optimización de la metodología, un número de puntos críticos fueron identificado y resueltos. L...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría agradecer a Yibin Kang para proporcionar la línea de celular SCP2 y Cristiano Verna para asistencia editorial.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
y alfa; MEMEurocloneBE12-169F
GlutaminaLife-technologiesECB3000D
Suero fetal bovinoLife-technologiesECS0180DPR
hMCSFPeprotech300-25Se deben respetar las indicaciones de almacenamiento
hRANKLPeprotech310-01Se deben respetar las indicaciones de almacenamiento
Fosfatasa ácida, Kit de leucocitos (TRAP)Sigma Aldrich387 A
Medios de separación de linfocitosBiowestL0560-100
Tampón de lisado de glóbulos rojosSIgma11814389001
ROCHE
TripsinaEuroCloneCOD.
ECB3052D
Solución acuosa de paraformaldehído al 4%, grado EMCiencias de la Microscopía Electrónica157-4-100
MDA-MB-231 línea celularATCCCRM-HTB-267
MCF7ATCCHTB-22
TranswellCorning3470-ClearEstos insertos son para placas de 24 pocillos;
6,5 mm, 0,4 μ M;
tamaño de poro

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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