Un método General para la detección de formación de Nitrosamide en el metabolismo In Vitro de nitrosaminas por Cytochrome P450s

Resumen

Α-hidroxilación de nitrosaminas carcinógenas por cytochrome P450s es la aceptada vía metabólica que produce intermediarios DNA-perjudiciales, causantes de mutaciones. Sin embargo, nuevos datos indican más a nitrosamidas puede oxidarse. Describimos un general método para la detección de nitrosamidas producido en vitro del citocromo P450-catalizada metabolismo de nitrosaminas.

Resumen

N-nitrosaminas son un grupo bien establecido de carcinógenos ambientales, que requieren la oxidación de la citocromo P450 que exhiben actividad. El mecanismo aceptado de activación metabólica implica la formación de α-hydroxynitrosamines que se descomponen espontáneamente a los agentes alquilantes del ADN. Acumulación de daño en el ADN y las mutaciones que en última instancia puede conducir a cáncer. Nueva evidencia indica que α-hydroxynitrosamines puede estar más oxidado a nitrosamidas processively por cytochrome P450s. Porque nitrosamidas son generalmente más estables que la α-hydroxynitrosamines y también pueden alkylate ADN, nitrosamidas pueden desempeñar un papel en la carcinogénesis. En este informe, describimos un protocolo general para la evaluación de producción de nitrosamide catalizada por la P450 metabolismo de en vitro del citocromo de nitrosaminas. Este protocolo utiliza un acercamiento general a la síntesis de las nitrosamidas pertinentes y un en vitro citocromo P450 metabolismo ensayo usando spectrometry total en tándem cromatografía líquido-nanospray ionización alta resolución para la detección. Este método detecta N′- nitrosonorcotinine como un metabolito menor de N′- nitrosonornicotine en el estudio de ejemplo. El método tiene alta sensibilidad y selectiva debido a la precisa detección de masa. Aplicación de este método a una amplia variedad de sistemas de nitrosaminas-citocromo P450 ayudará a determinar la generalidad de esta transformación. Porque cytochrome P450s son polimórficos y varían en la actividad, una mejor comprensión de la formación de nitrosamide puede ayudar en la evaluación del riesgo individual de cáncer.

Introducción

N-nitrosaminas son una gran clase de carcinógenos en la dieta, productos del tabaco y el medio ambiente en general; también puede ser formados endógenamente en el cuerpo humano¹. Más de 300 N -nitroso compuestos han sido probados y > 90% fueron evaluado como carcinógeno en modelos animales de^2,3. Para exhibir su carcinogenicidad, estos compuestos deben ser primero activados por cytochrome P450s^1,2,3. La investigación muestra que citocromo P450s oxida fácilmente nitrosaminas a ....

Protocolo

1. materiales y procedimientos generales de

1. sintetizar NNN como describió anteriormente ¹⁵. Obtener norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, sistema de regeneración de NADPH, tampón de reacción de 0.5 x y todos los otros productos químicos o solventes de fuentes comerciales en grado reactivo.
2. Espectros de RMN de registro en un espectrómetro de 500 MHz. Cambios químicos de informe como partes por millón (ppm). Utilizar picos de solvente residual como referencias internas para ¹ H-NMR (7,26 ppm CDCl ₃) y ¹³ C-RMN (77,2 ppm CDCl ₃).
   Nota: Pico partir utiliza las siguientes abreviat....

Resultados

Basado en la obra de blanco et al. ¹⁹, norcotinine era nitrosados a NNC limpia y en alto rendimiento (80-92%) para producir un estándar para el experimento en vitro . Se obtuvo evidencia estructural para una reacción exitosa de análisis espectroscópico como ¹H-NMR, ¹³C-RMN, COSY, HSQC (información de apoyo) junto con HRMS que confirmó el padre de masa [M + H]⁺ de 5 ppm de los valor teórico (fig.......

Discusión

Dilucidar el metabolismo de las nitrosaminas es un elemento fundamental para entender su carcinogenicidad. Puesto que el implicado cytochrome P450s y otras enzimas metabólicas son polimórficos, aplicación de este conocimiento potencialmente podría identificar individuos de alto riesgo^1,4. Nueva información indica más oxidación de α-hydroxynitrosamines, los principales metabolitos presumidos de nitrosaminas implicados en el atascamiento de la DNA, nitrosamidas es .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Norcotinina	AKoS GmbH (Steinen, Alemania)	CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969
Ácido acético	Sigma-Aldrich	695092
Anhídrido acético	Sigma-Aldrich	242845
Acetato de amonio	Sigma-Aldrich	431311
Hidróxido de bario	Sigma-Aldrich	433373
D-cloroformo	Sigma-Aldrich	151823
HPLC Acetonitrilo	Sigma-Aldrich	34998
Sulfato de magnesio	Sigma-Aldrich	M7506
Cloruro de metileno	Sigma-Aldrich	34856
Nitrito de sodio	Sigma-Aldrich	237213
ViVid CYP2A6 Kit de cribado azul	Technologies	PV6140
Sulfato de zinc	Sigma-Aldrich	221376
tubos de 0,5 mL	Fisher	AB0533
Matraz de fondo redondo de 100 mL	Sigma-Aldrich	Z510424
125 mL Matraz Erlenmeyer	Sigma-Aldrich	CLS4980125
125 mL Embudo separador	Sigma-Aldrich	Z261017
25 mL redondo matraz de fondo	Sigma-Aldrich	Z278262
500 MHz Espectrómetro de RMN	Bruker
Allegra X-22R Centrífuga	Beckman-Coulter
LC viales	ChromTech	CTC– 0957 y ndash; BOND
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Scientific
Barra de agitación magnética	Sigma-Aldrich	Z127035
tubo de RMN	Sigma-Aldrich Z274682
pipetas P1000, P200 y P10	Evaporador rotativo Eppendorf
			Sigma-Aldrich
RSLCnano UPLC	Thermo Scientific
Baño de agua agitable	Fisher	FSSWB15
Plato de agitación	Sigma-Aldrich	CLS6795420
PicoFrit Columna	Nuevo Objetivo	PF3607515N5
Luna C18, 5 mmm	Phenomenex	535913-1