Manipulación de una sola molécula de G-quadruplexes por pinzas magnéticas

Resumen

Una plataforma de una sola molécula magnética Pinzas para manipular G-quadruplexes se divulga, que permite el estudio de estabilidad de G4 y regulación por diversas proteínas.

Resumen

Estructura secundaria de ácidos nucleicos no canónicos que g-quadruplexes (G4) intervienen en diversos procesos celulares, tales como la replicación del ADN, transcripción, procesamiento de RNA y alargamiento de los telómeros. Durante estos procesos, varias proteínas se unen y resolución estructuras G4 para realizar su función. Como la función de G4 a menudo depende de la estabilidad de su estructura doblada, es importante investigar cómo G4 proteínas regulan la estabilidad del G4. Este trabajo presenta un método para manipular las moléculas individuales de G4 con pinzas magnéticas, que permite estudios de la regulación de proteínas G4 en una sola molécula G4 en tiempo real. En general, este método es conveniente para una amplia gama de aplicaciones en estudios de interacciones de proteínas/ligandos y las regulaciones sobre varias estructuras secundarias DNA o RNA.

Introducción

Trenzado de cuatro estructuras de ADN o ARN G4 desempeñan un papel crítico en muchos procesos biológicos importantes¹. Muchas proteínas están implicadas en el enlace de G4 y regulación, incluyendo proteínas telomere (telomerasa, TRF2, POT1, RPA, TEBPs)^1,2, factores de transcripción (nucleolin PARP1)³, RNA, proteínas (hnRNP A1, de procesamiento hnRNP A2)⁴, helicasas (BLM FANCJ RHAU, WRN, Dna2, Pif1)⁵y replicación del ADN relacionadas con proteínas (Rif1, REV1, PrimPolymerase)⁶. Unión a proteín....

Protocolo

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configuración de la muestra e identificar solo dsDNA tether

1. formación correa
   1. suavemente el flujo en 200 X diluido granos M-280, paramagnéticos en la solución de ensayo (100 mM KCl, 2 mM de MgCl ₂, 10 mM Tris, pH 7.4 ) en un canal. Incubar durante 10 minutos permitir que los granos que se unen a moléculas de ADN marcada con biotina inmovilizadas en la superficie revestida de SMCC a través del extremo marcado con tiol. Lave suavemente sin tethered cuentas con 200 μL de solución estándar de la reacción.
      Nota: Los granos de M-280 muestran menor fijación no específica a la superficie en comparación con otros gran....

Resultados

El montaje experimental para estirar una sola molécula G4 se muestra en la figura 4. Una secuencia de formación de G4 de monocatenario atravesada entre dos asas del dsDNA fue anclada entre un cubreobjetos y un talón paramagnético. Para encontrar una tira atada solo dsDNA, se realizó un ensayo demasiado incrementando la fuerza en las tasas de carga constante. A menudo se utilizaron tres tipos de mediciones para estudiar el plegamiento y desplegamiento de biomo.......

Discusión

Como se describió anteriormente, una plataforma para el estudio de la estabilidad mecánica de la DNA de G4 y las interacciones de la proteína a G4 usando pinzas magnéticas de una sola molécula se divulgan. Acompañando a la plataforma, se desarrollan protocolos eficientes de encontrar anclaje G4 ADN y medición de la dinámica de plegar-desplegar y la estabilidad de la estructura G4 con resolución especial nanómetros. La fijación del plano focal permite control antideriva altamente estable, que es importante para detectar u.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Imprimaciones de PCR de ADN	IDT		Preparaciones de ADN Productos
químicos de PCR	NEB		Preparaciones de ADN
enzima de restricción BstXI	NEB	R0113S	Preparaciones de ADN
cubreobjetos (# 1.5, 22 * 32 mm y 20 * 20 mm)	BMH. BIOMEDIA	72204	preparación de canal de flujo
Decon90	Decon Laboratories Preparación	canal de flujo
APTES	Sigma	440140-500ML	preparación de canal
de flujo Sulfo-SMCC	ThermoFisher Scientific	22322	preparación
de canal de flujo M-280, perlas paramganéticas,estreptavidina	ThermoFisher Scientific	11205D	Preparación del canal de flujo
Microesferas de polietileno 3.00 μ m	Polysciences, Inc	17145-5 preparación del canal de	flujo
2-Mercaptoetanol	Sigma	M6250-250ML	preparación del canal de flujo
Microscopios Olympus IX71	IX71	Configuración de pinzas magnéticas
Piezo-Z Etapas P-721	Physik Instrumente	P-721 Configuración de	pinzas magnéticas
Olympus Lente de objetivo MPLAPON-Oil 100X	Olympus	MPLAPON-Oil 100X	Configuración de pinzas magnéticas
Cámara CCD/CMOS	AVT	Pike F-032B	Configuración de pinzas
magnéticas Traslación etapa lineal	Physik Instrumente	MoCo DC	Configuración de pinzas magnéticas
LED	Thorlabs	MCWHL	Configuración de pinzas magnéticas
Imanes cúbicos	Supermagnete		Configuración de pinzas magnéticas
Labview	National Instruments		Configuración de pinzas magnéticas
OriginPro/Matlab	OriginLab/MathWorks		Análisis de datos

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