Una plataforma de una sola molécula magnética Pinzas para manipular G-quadruplexes se divulga, que permite el estudio de estabilidad de G4 y regulación por diversas proteínas.
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Artículo de método
Manipulación de una sola molécula de G-quadruplexes por pinzas magnéticas
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En este artículo
Resumen
Resumen
Estructura secundaria de ácidos nucleicos no canónicos que g-quadruplexes (G4) intervienen en diversos procesos celulares, tales como la replicación del ADN, transcripción, procesamiento de RNA y alargamiento de los telómeros. Durante estos procesos, varias proteínas se unen y resolución estructuras G4 para realizar su función. Como la función de G4 a menudo depende de la estabilidad de su estructura doblada, es importante investigar cómo G4 proteínas regulan la estabilidad del G4. Este trabajo presenta un método para manipular las moléculas individuales de G4 con pinzas magnéticas, que permite estudios de la regulación de proteínas G4 en una sola molécula G4 en tiempo real. En general, este método es conveniente para una amplia gama de aplicaciones en estudios de interacciones de proteínas/ligandos y las regulaciones sobre varias estructuras secundarias DNA o RNA.
Introducción
Trenzado de cuatro estructuras de ADN o ARN G4 desempeñan un papel crítico en muchos procesos biológicos importantes1. Muchas proteínas están implicadas en el enlace de G4 y regulación, incluyendo proteínas telomere (telomerasa, TRF2, POT1, RPA, TEBPs)1,2, factores de transcripción (nucleolin PARP1)3, RNA, proteínas (hnRNP A1, de procesamiento hnRNP A2)4, helicasas (BLM FANCJ RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5y replicación del ADN relacionadas con proteínas (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Unión a proteínas puede estabilizar o desestabilizar las estructuras G4; así regular las funciones biológicas posteriores. La estabilidad del G4 se midió por termo fusión usando radiación ultravioleta (UV) o métodos de dicroísmo circular (CD)7. Sin embargo, tales condiciones no son fisiológicos relevantes y son difíciles de aplicar al estudio de los efectos de la Unión de proteínas7.
El rápido desarrollo de tecnologías de manipulación de una sola molécula ha permitido estudios de plegar y desplegar de una biomolécula, como ADN o una proteína, a nivel de una sola molécula con resolución nanométrica en tiempo real8. Microscopía de fuerza atómica (AFM), pinzas ópticas y pinzas magnéticas son los más utilizados métodos de manipulación de una sola molécula. En comparación con AFM y pinza óptica9, pinzas magnéticas permiten mediciones estables de plegar-desplegar dinámicas de una sola molécula durante días utilizando una técnica anti deriva10,11.
Aquí, una plataforma de manipulación de una sola molécula con pinzas magnéticas para estudiar la regulación de la estabilidad de la G4 de las proteínas es divulgado12,13. Este trabajo describe los métodos básicos, incluyendo preparación de muestra y el flujo de canal, la instalación de pinzas magnéticas y la calibración de fuerza. Permiten el control de la fuerza y los protocolos anti deriva como se describe en el paso 3 para largo tiempo las mediciones con varios controles de la fuerza, como fuerza constante (fuerza de sujeción) y constante carga tarifa (fuerza-rampa) y medición de salto de fuerza. El protocolo de calibración de fuerza se describe en el paso 4 permite calibración de fuerza de < correas cortas 1 μm sobre una fuerza amplia gama pN hasta 100, con un error relativo dentro del 10%. Un ejemplo de regulación de la estabilidad de la helicasa de ARN asociada a helicase de elemento (RHAU) ricos en AU (alias DHX36, G4R1) que juega un papel esencial en la solución de que RNA G4 se utiliza para demostrar las aplicaciones de esta plataforma13.
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Protocolo
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- formación correa
- suavemente el flujo en 200 X diluido granos M-280, paramagnéticos en la solución de ensayo (100 mM KCl, 2 mM de MgCl 2, 10 mM Tris, pH 7.4 ) en un canal. Incubar durante 10 minutos permitir que los granos que se unen a moléculas de ADN marcada con biotina inmovilizadas en la superficie revestida de SMCC a través del extremo marcado con tiol. Lave suavemente sin tethered cuentas con 200 μL de solución estándar de la reacción.
Nota: Los granos de M-280 muestran menor fijación no específica a la superficie en comparación con otros granos magnéticos comerciales como M-270.
- suavemente el flujo en 200 X diluido granos M-280, paramagnéticos en la solución de ensayo (100 mM KCl, 2 mM de MgCl 2, 10 mM Tris, pH 7.4 ) en un canal. Incubar durante 10 minutos permitir que los granos que se unen a moléculas de ADN marcada con biotina inmovilizadas en la superficie revestida de SMCC a través del extremo marcado con tiol. Lave suavemente sin tethered cuentas con 200 μL de solución estándar de la reacción.
- Instale el canal en la platina del microscopio. La búsqueda para los granos en la superficie inferior con el 100 X objetivo de inmersión de aceite.
- Seleccionar una cuenta de referencia en la superficie y un cordón atado movimiento. Construir las bibliotecas de la imagen inicial del grano referencia y grano anclado en planos diferentes desenfoque.
- Calibración de imagen de granos
- antes de los experimentos, utilizar un actuador piezoeléctrico objetiva para obtener imágenes de referencia y granos anclados en desenfocar diferentes planos espaciados por 20-50 nm, que se almacenan como dos imágenes separadas del grano bibliotecas y son indexadas respectivamente con la distancia del desenfoque ( Figura 2D).
- x, y, determinación de la posición de z
- durante los experimentos, determinan la posición del grano en el plano x-y por el centroide de grano. Determinar el cambio de altura de los talones atado mediante la comparación de la imagen actual del grano con los almacenados en la biblioteca. Utilizar el análisis de la función de auto correlación del espectro de energía de la transformada de Fourier del grano imágenes 16.
- Anti deriva retroalimentación utilizando grano de referencia
- durante los experimentos, utilizar el piezo a " bloqueo " la distancia entre el objetivo y una imagen de referencia específica del grano almacenado en la biblioteca a través de una baja frecuencia control de retroalimentación, para que la imagen del grano pegado tiene la mejor correlación con una específica imagen almacenada en la biblioteca ( Figura 2D).
- Determinar si el anclaje es una molécula única dsDNA mediante la aplicación de ~ 65 pN fuerza determinar una molécula dsDNA solo si el anclaje somete el ADN característica estirar demasiado transición 17 , 18 , 19. Repita el proceso hasta encontrar un anclaje de dsDNA sola. (Consulte la sección siguiente para la calibración de fuerza y ADN estirar demasiado la transición).
4. Calibración de fuerza de pinza magnética
- determinar directamente la fuerza (hasta 100 pN) por largo (48.502 bp ADN λ) las moléculas de ADN con fluctuación de grano a través de:
, donde k B es la constante de Boltzmann, T es la temperatura en escala Kelvin, δ 2 y es la varianza de la fluctuación de grano en la dirección perpendicular al campo magnético y la fuerza Dirección. En este sentido, el movimiento del grano puede ser descrito como una fluctuación de péndulo con una longitud de l + r 0, donde l es la distancia de extremo a extremo a lo largo de la dirección de la fuerza (extensión) de la DNA, y r 0 el radio del grano 10 ( Figura 3A). - Determine la curva de calibración para la fuerza F en función de los imanes a la distancia del grano d y F (d) para distintos granos usando la DNA de λ larga. La distancia entre el imán y el cubreobjetos se utiliza generalmente, como la longitud de anclaje de ADN puede ser ignorada. Ajuste F-d curva de la función del decaimiento exponencial doble:
, donde la conexión parámetros α1, α2, γ1, γ2 son determinados por la pinzas magnéticas y el parámetro C es determinado por la propiedad heterogénea de las bolas magnéticas. Cambiando la C, F-d curva obtenida de diversos granos puede ser traslapado 10 ( figura 3B). - Experimentos de calibración del parámetro C para granos magnéticos individuales de ADN corto.
- Determinación de la fuerza basada en la fluctuación requiere grabar la posición del grano en una frecuencia más alta que la frecuencia esquina:
, donde γ es el arrastre coeficiente de la cuenta. Para DNA corto en alta fuerza, requiere grabación de frecuencia superior a 100 Hz, por lo tanto, la fuerza no puede ser directamente medida en base a la fluctuación con la cámara. Sin embargo, el parámetro C se puede determinar midiendo la fuerza en un mínimo fuerza gama (< pN 15) con fluctuación y guarnición de los datos con un calibrado F-d curva para obtener el parámetro C 20. - De forma alternativa, para experimentos con el dsDNA, determinar el parámetro C usando la DNA estirar demasiado la transición a una fuerza de ~ 65 pN ( figura 3) 21 , 22 , 23 mediante el registro de la posición d en que salto de extensión demostró dsDNA (0,6 X aumento de la longitud de la longitud del contorno). Después de determinar el parámetro C, calcular la fuerza de los granos atados.
- Determinación de la fuerza basada en la fluctuación requiere grabar la posición del grano en una frecuencia más alta que la frecuencia esquina:
- Control de la velocidad de carga mediante la programación del movimiento de los imanes a través de la función inversa de F (d). El imán debe acercar la muestra doble exponencial.
Nota: El error relativo de la fuerza determinado por un método de extrapolación es ~ 10% y es causada principalmente por el grano radio heterogeneidad 20.
5. Manipulación de una sola molécula de G4 en la presencia y la ausencia de proteínas vinculantes
- fuerza-rampa experimentos
- después de identificar el anclaje de dsDNA, realizar un análisis de aumento de la fuerza a una velocidad de carga de 0,2 pN/s seguido por un exploración de la fuerza-fallecimiento en -0.2 pN/s. Después de cada ciclo de estiramiento, mantenga la molécula de ADN en 1 pN 30 s para permitir el ssDNA replegar a G4.
- Experimentos de fuerza de salto
- ciclo de la fuerza entre 54 pN 30 s en las que un G4 doblado podría ser desplegado y 1 pN para los años 60, bajo las cuales podría replegar un G4-15T doblado.
- Solución de flujo de proteína
- flujo de la solución de proteína cuando en ~ 20 pN fuerza para evitar la fijación de los granos el cubreobjetos. La helicasa RHAU DEAH-box, que demostraron alta especificidad a la estructura G4, fue usado 24. La recombinante helicase RHAU (DmRHAU) de Drosophila melanogaster fue expresada en Escherichia coli y purificada como se describió anteriormente 25. El G4 desenrollar actividad de DmRHAU se analiza en un tetramolecular G4 ADN sustrato 13.
- Analizar la fuerza de despliegue con un interno escrito Matlab programa 14.
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Resultados
El montaje experimental para estirar una sola molécula G4 se muestra en la figura 4. Una secuencia de formación de G4 de monocatenario atravesada entre dos asas del dsDNA fue anclada entre un cubreobjetos y un talón paramagnético. Para encontrar una tira atada solo dsDNA, se realizó un ensayo demasiado incrementando la fuerza en las tasas de carga constante. A menudo se utilizaron tres tipos de mediciones para estudiar el plegamiento y desplegamiento de biomo...
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Discusión
Como se describió anteriormente, una plataforma para el estudio de la estabilidad mecánica de la DNA de G4 y las interacciones de la proteína a G4 usando pinzas magnéticas de una sola molécula se divulgan. Acompañando a la plataforma, se desarrollan protocolos eficientes de encontrar anclaje G4 ADN y medición de la dinámica de plegar-desplegar y la estabilidad de la estructura G4 con resolución especial nanómetros. La fijación del plano focal permite control antideriva altamente estable, que es importante para detectar u...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Meng Pan para corregir el manuscrito. Este trabajo es apoyado por Singapur Ministerio de educación académica investigación fondo de nivel 3 (MOE2012-T3-1-001) a J.Y.; la Fundación Nacional de investigación a través de la mecanobiología Instituto Singapur J.Y.; la Fundación Nacional de investigación, oficina, Singapur del primer ministro, bajo su programa de Investigatorship de la NRF (NRF Investigatorship premio no. NRF-NRFI2016-03 J.Y.; el fondo de Investigación Fundamental para las universidades Central (2017KFYXJJ153) a H. Y.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Imprimaciones de PCR de ADN | IDT | Preparaciones de ADN Productos | |
| químicos de PCR | NEB | Preparaciones de ADN | |
| enzima de restricción BstXI | NEB | R0113S | Preparaciones de ADN |
| cubreobjetos (# 1.5, 22 * 32 mm y 20 * 20 mm) | BMH. BIOMEDIA | 72204 | preparación de canal de flujo |
| Decon90 | Decon Laboratories Preparación | canal de flujo | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | preparación de canal |
| de flujo Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | preparación |
| de canal de flujo M-280, perlas paramganéticas,estreptavidina | ThermoFisher Scientific | 11205D | Preparación del canal de flujo |
| Microesferas de polietileno 3.00 μ m | Polysciences, Inc | 17145-5 preparación del canal de | flujo |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma | M6250-250ML | preparación del canal de flujo |
| Microscopios Olympus IX71 | IX71 | Configuración de pinzas magnéticas | |
| Piezo-Z Etapas P-721 | Physik Instrumente | P-721 Configuración de | pinzas magnéticas |
| Olympus Lente de objetivo MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Configuración de pinzas magnéticas |
| Cámara CCD/CMOS | AVT | Pike F-032B | Configuración de pinzas |
| magnéticas Traslación etapa lineal | Physik Instrumente | MoCo DC | Configuración de pinzas magnéticas |
| LED | Thorlabs | MCWHL | Configuración de pinzas magnéticas |
| Imanes cúbicos | Supermagnete | Configuración de pinzas magnéticas | |
| Labview | National Instruments | Configuración de pinzas magnéticas | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Análisis de datos |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
