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Artículo de método

Basado en el dendrímero nanopatrones desigual para adherencia de superficie de Control local: un método para dirigir la diferenciación condrogénica

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DOI:

10.3791/56347

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20 de enero de 2018

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1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2Department of Engineering Electronics, University of Barcelona (UB), 3Networking Biomedical Research Center (CIBER), 4Instituto de Investigacin Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Organic Chemistry, Universidad de Málaga (UMA), 5Andalusian Centre for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND, 6Unidad de Bioingeniería Tisular y Terapia Celular (GBTTC-CHUAC), Grupo de Reumatolog ía, Instituto de Investigación Biomèdica de A Coruña (INIBIC), Complexo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC), Sergas, Universidade da Coruña (UDC), 7Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), 8Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Cell Biology, Genetics and Physiology, Universidad de Málaga (UMA)

En este artículo

Resumen

Un método para obtener nanopatrones desigual basado en el dendrímero que permiten el control de escala nanométrica de local arginina-glicina-aspártico (RGD) superficie densidad del ácido es descrito y aplicado para el estudio de la diferenciación celular de adherencia y condrogénica.

Resumen

Diferenciación y adhesión celular está condicionada por la disposición de escala nanométrica de los componentes de la matriz extracelular (MEC), con concentraciones locales tener un efecto importante. Aquí presentamos un método para obtener a gran escala nanopatrones desigual de ácido arginina-glicina-aspártico (RGD)-densidad superficial de dendrímeros funcionalizados que permiten el control de escala nanométrica de servicios locales. Nanopatrones se forman por adsorción superficial de dendrímeros de soluciones a diferentes concentraciones iniciales y se caracterizaron por ángulo de contacto de agua (CA), espectroscopía de fotoelectrones de rayos x (XPS), y análisis de sonda tales como técnicas de microscopía Microscopía de efecto túnel (STM) y microscopía de fuerza atómica (AFM). La densidad superficial local de RGD se mide utilizando imágenes AFM mediante mapas de contorno de probabilidad de las distancias entre partículas mínimas y luego correlacionados con la diferenciación y la respuesta de la adherencia de la célula. El método nanomotivos presentado aquí es un procedimiento simple que puede ampliarse de forma sencilla a grandes superficies. Por lo tanto es totalmente compatible con protocolos de cultivo celular y se puede aplicar a otros ligandos que ejercen efectos dependiente de la concentración en las células.

Introducción

Aquí describimos un procedimiento sencillo y versátil basada en el dendrímero nanomotivos para obtener superficies de cultivo celular que permiten el control de adherencia local a escala nanométrica. Se han divulgado detalles de nanoescala de la organización de ECM,1,2,3 y nanomotivos de las superficies de adherencia de célula ha proporcionado penetraciones profundas en los requisitos celulares relacionados con la adherencia4, 5. Experimentos con micelar nanopatrones basado en litografía revelaron un valor umbral de alrededor de 70 nm de nanospacing de péptido RGD, adhesión celular se retrasará por encima de este valor6,7,8 ,9. Estos estudios también destacan la mayor influencia de locales de densidad global ligando el cell adhesión9,10,11.

Durante la morfogénesis, interacciones de la célula con el entorno activan los primeros eventos de la diferenciación, que continúan hasta que se han formado estructuras de tejido complejo final. Dentro de este marco, se han utilizado superficies nanopatterned para hacer frente a la influencia de las interacciones de superficie de la célula iniciales en la morfogénesis. Basado en litografía nanopatrones RGD con una separación lateral de 68 nm en β-tipo Ti-40Nb aleaciones ayudan a mantener el fenotipo indiferenciado de las células madre no comprometida12, mientras que nanospacings RGD de entre 95 y 150 nm mejorar la diferenciación de células madre mesenquimales (MSCs) hacia adipogenic/osteogénico13,14,15 y condrogénica sinos16. También, uno mismo-montaje macromoléculas modificados con componentes de señalización han demostrado directa de adhesión celular y la diferenciación proporcionando regulación arquitectónica a nanoescala de señalización señales17. En este sentido, la deposición de dendrímeros con partes de células interactuando en su esfera externa18,19,20 sobre superficies se ha utilizado para estudiar células adherencia21,22, morfología23,24y de25,de eventos de migración26. Sin embargo, la falta de caracterización superficial en estos estudios hace difícil establecer ninguna correlación entre la configuración superficial del dendrímero y respuesta de la célula.

Dendrímero nanopatrones con líquido-como orden y espaciamiento definido pueden obtenerse cuando dendrímeros por adsorción a las superficies de carga baja de soluciones con baja fuerza iónica. 27 sobre la base de esta propiedad, aquí presentamos un método para obtener a gran escala nanopatrones desigual de dendrímeros funcionalizados de RGD en superficies de baja carga que permiten el control de escala nanométrica de densidad superficial local de RGD. Ángulo de contacto de agua (CA), espectroscopía de fotoelectrones de rayos x (XPS) y exploración sonda microscopia técnicas (nanopatrones STM y AFM) mostrar que las densidades locales ligando pueden ajustarse modificando el dendrímero inicial concentración en solución. La densidad superficial local de RGD es cuantificada de imágenes AFM de mapas de contorno de probabilidad de las distancias entre partículas mínimas y luego correlacionada con experimentos de la célula. En comparación con otras técnicas de nanomotivos4, nanomotivos basado en el dendrímero es sencilla y pueden fácilmente ampliarse a grandes superficies, siendo totalmente compatible con aplicaciones de la cultura de célula. Nanopatrones se utilizan como substratos bioactivos para evaluar el efecto de la densidad superficial local de RGD en células adherencia28 y en la inducción condrogénica de adultos de MSCs humanos29. Nuestros resultados muestran que RGD basados en el dendrímero nanopatrones mantienen el crecimiento de la célula y que adhesión celular se ve reforzada por la alta densidad superficial local de RGD. En los experimentos de diferenciación, intermedio adherencia de células a los sustratos favoreció la condensación de MSC y temprana diferenciación condrogénica. Debido a la facilidad con que dendrímero grupos periféricos pueden ser modificados, el método descrito aquí puede ser ampliado a otros ligandos de ECM que ejercen efectos dependiente de la concentración en las células.

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Protocolo

1. preparación del sustrato

  1. Recocido Au(111) 1.4 x 1.1 cm en sustratos de Mica.
    1. Coloque el sustrato Au(111) en una vitrocerámica y templar con una llama de butano para 3 minutos deje que el sustrato se enfríe bajo atmósfera de argón. Repita este paso para cada sustrato de Au(111).
      Nota: Au(111) sustratos deben utilizarse inmediatamente después del recocido.
  2. Preparación de poli (ácido L-láctico) (PLLA)-cubierto de substratos de vidrio.
    1. Cortar y lavar el portaobjetos de vidrio.
      1. Corte el portaobjetos de microscopía en 18 diapositivas de 1,25 x 1,25 cm con un cortador de punta de diamante. Hacer una pequeña hendidura en la parte inferior de cada diapositiva, de modo que los lados superiores e inferiores pueden distinguirse más tarde.
      2. Lavar bien los portaobjetos con agua desionizada seguida de etanol al 96%. Permita que seque al aire.
    2. Preparar la solución al 2% PLLA.
      1. Agregar 200 mg de PLLA a 10 mL de 1, 4-dioxano en un tubo de presión. Agregar una barra de agitación y cierre el tubo herméticamente.
      2. Coloque el tubo de presión en baño de glicerina sobre una placa caliente a 60 ° C con agitación suave durante 24 h y luego transferir la solución a un frasco de vidrio de 15 mL.
    3. Capa el portaobjetos con la solución PLLA.
      1. Coloque el portaobjetos y el frasco con la solución PLLA en un plato limpio caliente a 60 ° C. Asegúrese de colocar las diapositivas hacia arriba y que puedan permanecer durante al menos 10 minutos llegar a la temperatura necesaria.
      2. Preparar la máquina de pintar del giro y establecer el programa especificado en la tabla 1.
      3. Coloque uno de lo toboganes boca arriba en el recubridor spin, utilizando un sistema de vacío. Con una pipeta Pasteur, se aplican 0.25 mL de la solución PLLA a la diapositiva, asegurándose de que toda la superficie está cubierta. Ejecute el programa de la capa. Repita este paso para cada diapositiva.

2. dendrímero nanomotivos

  1. Preparación de soluciones de 28 dendrímero RGD-funcionalizados (RGD-Cys-D1).
    1. Disolver 5 mg del dendrímero en 6,494 mL de agua desionizada. Esta es la solución A.
      Nota: Use solución dendrímero dentro de 6 meses de preparación.
    2. Someter a ultrasonidos solución A durante 10 minutos y preparar soluciones B y C siguiendo la tabla 2.
    3. Someter a ultrasonidos solución C por 10 min y preparar soluciones D, E y F siguiendo la tabla 2.
    4. Almacene las soluciones B, C, D, E y F a 4 ° C hasta su uso. Solución A puede almacenarse a-20 ° C para su uso posterior.
  2. Nanomotivos de dendrímeros RGD-Cys-D1 en los sustratos
    1. En una campana de cultivo de tejidos, esterilizar los sustratos por irradiación con luz UV para 13 minutos.
      Nota: Este paso sólo es necesario cuando sustratos de nanopatterned van a ser utilizados como sustratos de cultivo celular. En este caso, mantener las condiciones estériles (campana de cultivo de tejidos, materiales estériles, soluciones y técnicas) para los siguientes pasos.
    2. Coloque cada sustrato cara arriba en los pocillos de una placa, manipularlos cuidadosamente con las pinzas.
    3. Someter a ultrasonidos soluciones B, C, D, E y F por 10 min.
    4. Pasar las soluciones del dendrímero de RGD-Cys-D1 a través de un filtro de 0,22 μm de diámetro utilizando una jeringa directamente en los pocillos que contienen el sustrato (2 mL/pocillo). Se recomiendan al menos tres réplicas por concentración del dendrímero. Cerrar y sellar la placa y dejarla a temperatura ambiente (RT) de 16 h.
    5. Retire y deseche las soluciones. Lavar el sustrato con agua desionizada estéril y seco. Almacenar sustratos a 4 ° C.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí.

3. preparación de substratos de Control

Nota: Todas las medidas se realizaron en una campana de cultivo estériles para tejidos y sólo material estéril, soluciones y técnicas fueron utilizadas. Al menos, seis de control de sustratos fueron usadas (tres réplicas del control positivo) y tres réplicas del control negativo.

  1. En una campana de cultivo de tejidos, esterilizar los sustratos por irradiación con luz UV para 13 minutos.
  2. Sustratos de control para el experimento de adhesión de fibroblastos.
    1. Utilizar sustratos de Au(111) llama recocido como control negativo. Oro tiene un efecto bien conocido de desnaturalización de la proteína que confiere propiedades adhesivas de la célula contra28. Someter a ultrasonidos todas las soluciones y filtrar antes de la incubación del sustrato.
    2. Para los controles positivos, sumerja llama recocido Au(111) sustratos en una solución de PEG modificado con RGD tiol, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene glicol mono-11-mercaptoundecanamide (RGD-PEG-SH)30 y glicol del trietileno mono-11-mercaptoundecyl éter (PEG-SH) en una proporción molar de 1: 100 en etanol al 96% durante 16 horas a TA.
    3. Lave bien los sustratos en etanol y secar con argón. Almacenar sustratos a 4 ° C.
  3. Control de sustratos para la condrogénesis.
    1. Utilizar sustratos PLLA prístinos como control negativo. Sin ningún tratamiento superficial, PLLA muestra pobre interconexión con células vivas. 31
    2. Para los controles positivos, preparar 5 mL de fibronectina de 0,1 mg/mL en tampón fosfato salino (PBS) e incubar cada sustrato PLLA con 1.6 mL de la solución de fibronectina por 1 h a TA.
    3. Retire y deseche la solución de fibronectina y lavar el sustrato con PBS. Almacenar sustratos a 4 ° C.

4. Caracterización superficial

  1. Proyección de imagen de AFM
    1. Realizar proyección de imagen de AFM de sustratos PLLA para un análisis de la rugosidad. Puesto que los dendrímeros tienen un diámetro de 4-5 nm, los valores de rugosidad de 1 nm debe obtenerse para la correcta visualización de la nanopatrones. También, realizar proyección de imagen de AFM de la nanopatrones. En ambos casos, realizar AFM en modo aire.
    2. Seleccione un voladizo de silicio con un resorte de constante k = 40 N/m y una frecuencia resonante ν = 300 kHz y móntelo en el equipo de AFM.
    3. Montar la muestra en la etapa del microscopio de fuerza atómica. Dependiendo de la configuración del aparato, afinación y proyección de imagen especificaciones pueden variar. Consulte el manual del fabricante.
    4. Enfoque la muestra con la punta del microscopio hasta el contacto.
    5. Para imagen de PLLA para análisis de rugosidad, seleccione al menos cuatro áreas representativas de 20 x 20 μm por sustrato en tres sustratos independientes. Dendrímero nanopatrones la imagen, elegir al menos tres imágenes representativas de 5 × 5 μm por sustrato de tres sustratos independientes por condición (dendrímero inicial concentración en solución). Para evitar dañar la capa del dendrímero mientras la proyección de imagen, ajustar el punto fijo para mantener la fuerza en un mínimo.
      Nota: La elección de la zona de proyección de imagen también depende del rango de trabajo del escáner piezoeléctrico. Consulte el manual del instrumento en este sentido.
    6. Proceso la altura AFM imágenes ajustando cada scan línea al polinomio funciones utilizando el software propietario del fabricante de los aparatos AFM de nivelación y analizarlos de PLLA para calcular la rugosidad de la superficie. Significa raíz cuadrada (RMS) análisis pueden proveer una opción adecuada.
  2. Medida de la densidad superficial de RGD local.
    1. Obtener el umbral de la imagen de las imágenes procesadas de la altura AFM para seleccionar los dendrímeros en la superficie.
    2. Determinar las posiciones de la partícula usando un software de procesamiento de imágenes y utilizarlas para obtener las distancias entre partículas mínimas (8Dmin).
    3. Representar valores demin den z para las posiciones de partículas correspondientes para obtener los mapas de contorno de probabilidad para 8Dmin. Ajustar la escala de color de la trama para visualizar las regiones de densidad más alta local RGD superficial (dmin < 70 nm).
    4. Cuantificar el área de las regiones con la densidad más alta local RGD superficial utilizando un software de procesamiento de imágenes. Incluyen las áreas del dendrímero agregados en el cálculo.
  3. Proyección de imagen de STM.
    Nota: Proyección de imagen de STM se puede realizar sólo para nanopatrones sobre sustratos de Au(111) conductoras. Las mediciones se realizan en el aire.
    1. Coloque el sustrato de nanopatterned muestra el equipo de STM. Compruebe la conexión eléctrica entre la muestra y titular con un tester.
    2. Grabado a punta del material de la sonda seleccionada (es decir. PT 0.8: Ir 0.2) con un diámetro que garantice el adecuado ajuste en la cabeza del equipo de STM. Grabado se puede realizar mediante corte manual o grabado electroquímico. 32
      Nota: Grabado electroquímico hace más puntas simétricas.
    3. Montar la punta en la cabeza del equipo de STM y conectar la muestra.
    4. Sistema "actual" en el canal de retroalimentación (en este tipo de medición, actual será constante por feedback tuning). Ajuste el voltaje de bias y punto fijo actual y tamaño de exploración para obtener una imagen bien resuelta una vez que la punta se dedica.
      Nota: La elección de la zona de proyección de imagen también depende del rango de trabajo del escáner piezoeléctrico. Consulte el manual del instrumento en este sentido.
    5. Proceso de las imágenes topográficas de STM ajustando cada línea de exploración para nivelación polinomio funciones utilizando el software propietario del fabricante del aparato del STM.
  4. Mediciones de CA.
    1. Medida de CA en los sustratos de nanopatterned por el método de la gota sésil en tres posiciones diferentes en tres sustratos independientes por condición (dendrímero inicial concentración en solución) con un sistema óptico de CA.
    2. Llene la microjeringa con agua desionizada y ajustar los parámetros en el software de CA para producir gotas de 1 μl.
    3. Coloque la muestra en el escenario para que la superficie de la muestra es claramente visible en el equipo para la proyección de imagen.
    4. Mueva la jeringa con el micromanipulador hasta llegar cerca de la superficie y colocar la gota sobre la superficie. Grabar la imagen inmediatamente después de la estabilización de la gota.
      Nota: En las mediciones de CA, es muy importante controlar la humedad para lograr resultados reproducibles.
    5. Analizar el CAs con el software propietario del fabricante de los aparatos de CA. El método de ajuste se puede ajustar a las necesidades del usuario. El método de ajuste elíptica puede ser una opción.

5. cultivo celular

Nota: Todas las medidas se realizaron en una campana de cultivo de tejidos y sólo material estéril, soluciones y técnicas fueron utilizadas.

  1. Experimento de la adhesión de fibroblastos.
    1. Cultura NIH 3T3 ratón embrionario los fibroblastos de pasajes tempranas (< 10) a 37 ° C y 4.6% CO2 ambiente en medio basal con alta glucosa suplementada con 10% suero bovino fetal (FBS), 1% glutamina, 1% penicilina-estreptomicina y 1% piruvato de sodio (medio de cultivo). T75 frascos de una siembra total de 500.000 células por frasco en 10 mL de medio de cultivo se recomiendan.
    2. Quitar medio viejo con una pipeta de 10 mL cada 2 días y reemplazar con 10 mL de medio de cultivo recién preparada.
    3. Células en cultivo en el medio de crecimiento hasta llegar a alrededor de 80% de confluencia, a continuación, quite el medio y añadir 5 mL de tripsina por frasco. Para asegurar el desprendimiento celular adecuado desde la parte inferior del frasco, mantener la solución de tripsina en contacto con las células durante 5 min a 37 ° C.
    4. Añadir 5 mL de medio de cultivo cada frasco y recoger las células en un tubo de centrífuga. Centrifugar las células a 470 x g por 5 min retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio de cultivo. Determinar la concentración de células usando un hemocitómetro.
    5. La transferencia de los sustratos bien placas no tratadas para cultivo de tejidos (no adherente).
    6. Las células en los sustratos con una densidad de 4.000 células/cm2 en medio del crecimiento de la semilla e incúbelos durante 4,5 h a 37 ° C y 10% CO2 ambiente.
  2. Inducción condrogénica de MSCs.
    1. Cultura humanas MSCs de primeros pasos (< 5) a 37 ° C y 4.6% CO2 ambiente en un medio de MSC. T75 frascos de una siembra total de 500.000 células por frasco en 10 mL de medio de cultivo se recomiendan.
    2. Cambiar el medio cada 3 días (como se describe en 5.1.2).
    3. Trypsinize las células antes de confluencia del 80% se alcanza y centrifugar y les resuspender en medio de cultivo de MSC (como descrito en 5.1.3). Determinar la concentración de células usando un hemocitómetro.
    4. Centrifugar las células otra vez y resuspender en 10 mL de medio de inducción de condrogénesis.
    5. Transferencia de los sustratos de las placas para nuevas placas bien no tratadas para cultivo de tejidos (no adherente). Las células en los sustratos con una densidad de 3.000 células/cm2de la semilla.
    6. Cambiar el medio condrogénica cada 3 días (como se describe en 5.1.2).

6. la fijación y el Immunostaining de la célula

Nota: Los pasos siguientes pueden realizarse en condiciones no estériles.

  1. Quitar los medios de comunicación y lavar las células con PBS. Fijar mediante la adición de una solución de formol al 10% durante 20 min a TA.
  2. Eliminar el formol y lavan las células con PBS.
  3. Bloquean los grupos aldehídos libres mediante la adición de una solución de 50 mM de cloruro de amonio (NH4Cl) en PBS. Salir de las células durante 20 min en solución de NH4Cl Retire RT. y lavan las células con PBS.
    Nota: El protocolo se puede detener aquí. Almacenar las muestras en PBS a 4 ° C.
  4. Quitar PBS y permeabilizar las células mediante la adición de una solución al 0.1% de la saponina en la solución de bloqueo (albúmina 1% en PBS) durante 10 min en Wash RT. las células con PBS y transferir las muestras a una placa muy nueva.
  5. Incubar las células con una solución de anticuerpos primarios en la solución de bloqueo (tabla 3) durante 1 h a TA. Luego, retirar la solución de anticuerpo primario y lavan las células con PBS.
  6. Incubar las células con anticuerpos secundarios en la solución de bloqueo (tabla 3) durante 1 h a TA.
    Nota: Evite la luz exposición.
  7. Retirar la solución de anticuerpo secundario y lavan las células con PBS y seco.
    Nota: El protocolo se puede detener aquí. Almacenar las muestras en PBS a 4 ° C en la oscuridad.
  8. Montaje de la muestra para la observación del microscopio: usando un cortador de punta de diamante, corte cubreobjetos en 1,25 cm x 1,25 cm. Añada 50 μl de medio en las muestras de montaje microscopia y cubrirlas ligeramente con el cubre-objetos corte.
  9. Transferir las muestras a un receptor conveniente, cubrirla con papel de aluminio y guardar en la oscuridad a 4 ° C hasta observación.

7. la célula de proyección de imagen y análisis de datos

Nota: Para Au(111) opaco y gruesos sustratos a base de microslide, debe usarse un microscopio vertical.

  1. Experimento de la adhesión de fibroblastos.
    1. Uso un microscopio de epifluorescencia había equipado con una cámara digital y aumento de alta (es decir, 40 X) y baja (es decir, 10 X) objetivos. Realizar mediciones en aire.
    2. Coloque la muestra en los núcleos de la célula de la etapa y la imagen con el objetivo de X 10 con una excitación ULTRAVIOLETA, filtro de emisión longpass a visualizar la tinción de Hoechst/DAPI.
    3. Imagen de la célula citoesqueleto y adherencias focales (FAs) con el objetivo 40 X, seleccionando el filtro de microscopio que coincida con las especificaciones correspondientes del fluorocromo de anticuerpo.
    4. Para la cuantificación de FA, utilice un software de procesamiento de imágenes para convertir imágenes a archivos de 8 bits. Quitar las imágenes de fondo y convertir a binario mediante el establecimiento de un umbral. Calcular por lo menos 30 imágenes por muestra y considerar FAs desde 1 μm2 para el cálculo.
  2. Inducción condrogénica de MSCs.
    1. Condensados de la célula de la imagen en las etapas iniciales de inducción condrogénica (< 5 días) con un microscopio de epifluorescencia vertical equipado con una cámara digital y una baja (es decir, 10 X) objetivo de la ampliación. Utilizar filtro de emisión ultravioleta de la excitación y longpass a visualizar la tinción de Hoechst/DAPI.
    2. Para la medición de la zona de condensación, utilizar un software de procesamiento de imágenes, convertir imágenes a archivos de 8 bits, eliminar el fondo y seleccionar un umbral que pone de relieve el contorno total. Calcular el área de las partículas.
    3. Muestras de imagen immunostained para FAs, fibras de actina del citoesqueleto y específicas del cartílago colágeno tipo II alfa 1 (COL2A1) con un microscopio confocal vertical a alta magnificación (es decir, 40-60 X). Recoge secciones en un intervalo representativo (es decir, 0.5-1 μm).
    4. Para procesar la pila, use un software de procesamiento de imágenes. Convertir imágenes a archivos de 8 bits, eliminar el fondo y hacerlos binario mediante el establecimiento de un umbral. Tratar un mínimo de tres condensados de célula por condición de tres muestras independientes.
    5. Cuantificar la proteína FA manchada de las áreas de la zona basal de condensados de la célula y expresa como el porcentaje correspondiente de área dividido por el número de núcleos de células en la imagen.
    6. Para medir la coloración COL2A1, utilizar proyecciones de z confocales y cuantificar la suma de la proyectada (área máxima COL2A1 por muestra). Normalizar el valor del área obtenido contra la zona del condensado correspondiente.

8. cuantitativa análisis de reacción en cadena (qRT-PCR) de la transcripción-polimerasa inversa

Nota: Para evitar contaminación con ARNasas, utilizar artículos de plástico desechables, estériles y desechables guantes durante la manipulación de reactivos y el ARN. Siempre utilice técnicas asépticas microbiológicas adecuadas y utilizar una solución de descontaminación apropiada para eliminar la contaminación de la Rnasa de superficies y artículos no desechables tales como centrifugadoras y pipetas.

  1. Aislar ARN total y pulverizar en un disruptor de RNA. Tratar las muestras de RNA con DNasa y convertirlos en cDNA usando un cDNA síntesis kit.
  2. Conducta de qRT-PCR usando las cartillas para el factor de transcripción SOX9. Beta-2-microglobulina (B2M) y la proteína ribosomal L13a (RPL13a) puede ser utilizado como genes housekeeping.
  3. Calcular los niveles de expresión y normalizar contra el control negativo (PLLA).

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Resultados

Presentamos un método nanomotivos que permite una adherencia superficial que se abordarán en la nanoescala (figura 1). La estructura química de RGD-Cys-D1 se muestra en la figura 1A. Dendrímeros fueron estampadas sobre superficies conductoras eléctricas del Au(111) para caracterización de STM de alta resolución. Dendrímero bajas concentraciones en la solución (hasta 10-5% w/w) prestados dendrímeros aislado de ...

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Discusión

Durante el desarrollo del protocolo descrito, se debe considerar una serie de pasos críticos. La primera se refiere a la caracterización de la nanopattern con técnicas de microscopía de sonda de exploración. Para visualizar el nanopatrones, la superficie donde se produce el patrón debe tener un valor de rugosidad bajo el diámetro medio de los dendrímeros, que es alrededor de 4 – 5 nm medida por STM (figura 1B). Además, debe tenerse en cuenta que la proyección de imagen de STM de alta resolución se limita...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores reconocen Oriol Font-Bach y Albert G. Castaño por su ayuda en dmin cuantificación. También reconocen a la unidad de microscopía Digital avanzada en el Instituto de investigación biomédica (IRB Barcelona) dejó a los autores de grabar el vídeo en sus instalaciones. Este trabajo fue apoyado por la red biomédica investigación centro (CIBER), España. CIBER es que una iniciativa financiada por el VI nacional R & D & i Plan 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, programa Consolider, acciones CIBER y el Instituto de Salud Carlos III, con el apoyo del Fondo Europeo de Desarrollo Regional. Este trabajo ha sido apoyado por la Comisión de universidades e investigación de la Consejería de innovación, universidades y empresa de la Generalitat de Catalunya (SGR 2014 1442). También fue financiado por los proyectos OLIGOCODES (no. MAT2012-38573-C02) y CTQ2013-41339-P, otorgado por el Ministerio de economía y competitividad, además a INTERREG V-A Portugal España 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. reconoce apoyo económico de la beca de Ministerio de economía y competitividad Español (no. IFI15/00151).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Oro (111) sobre mica. 1.4x1.1 cm Spi Supplies466PS-AB
Micro portaobjetos de vidrio,lisos Corning2947-75x25
Agua desionizadaMillipore18MΩ cm
Etanol 96%PanReac131085.1212
L-Lactide/DL-Copolímero de lactidaCorbion95/05 relación molar
1,4 - dioxanoSigma-Aldrich296309-1L
Aceite de silicona, alta temperaturaAcros Organics174665000
SpinnerLaurellWS-650MZ-23NPP/Lite
Campana de flujo laminar para cultivo de tejidosTelstarBio II AdvanceClase II Cabina de seguridad biológica
Millex-GPSLGP033RB0.22 µ m
Jeringa 10 mLDiscardit309110
Microscopio de fuerza atómicaVeeco InstrumentsDimension 3000 Instrumento
AFM de silicio Sondas AFMBudget SensoresTap300AI-GResonante Frecuencia 300 kHz, k = 40 N/m
Microscopio de efecto túnel de barridoImagen molecularMicroscopio
Pt0.8:Ir0.2 alambreAdventPT671012Diámetro 0,25 mm
Software WSxM 4.0Nanotec electronica
Sistema óptico de ángulo de contacto (CA)Software Dataphysics
SCA20Dataphysics
Espectrómetro de fotoelectrones de rayos XPhysical ElectronicsSistema multitécnico Perkin-Elmer PHI 5500
Sigma-AldrichF1141-1MG1.0 mL
solución salina tampón de fosfato de Dulbecco (DPBS)Gibco21600-10Polvo
Fibroblastos de embrión de ratónATCCATCC CRL-1658NIH/3T3
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) líquido alto contenido de glucosaGibco11960044líquido alto en glucosa, sin glutamina, 500 mL
Suero fetal bovino (FBS)Gibco16000044500 mL
L-GlutaminaInvitrogen25030200 mM (100X)
Penicilina-estreptomicinaInvitrogen15140
Piruvato de sodioInvitrogen11360039100 mL
Matraces de cultivo T75Nunclon156499
TripsinaLife Technologies252000720,25% EDTA
CentrífugaHermle LabortechnikZ 206 A
Placa tratada sin cultivo de tejidos, 12 pocillosFalcon351143No adherente
hMSCs derivadas del tejido adiposoATCC ATCCPCS-500-011Frasco de células 1 mL
MSC medio basalATCCATCC PCS-500-030
MSC kit de crecimientoATCCATCC PCS-500-040Bajo en suero
herramienta de diferenciación de condrocitosATCCATCC PCS-500-051
Solución de formalinaSigma-AldrichHT5011-15MLtamponado neutro,
cloruro de amonioSigma-AldrichA9434-500Gpara biología molecular, apto para cultivo celular, ≥ 99.5%
SaponinaSigma-Aldrich47036-50G-Fpara biología molecular, utilizada como surfactante no iónico, adyuvante
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA3059-50G
Monoclonal de conejo [Y113] anticuerpo anti-paxilinaAbcamab32084Diluido 1:200
Monoclonal de ratón [1F5] cadena anti-colágeno alfa-1 XX AcrisAntibodies AM00212PU-NDiluido: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugado anti-ratón anti-ratón anti-IgG (H+L) anticuerpo secundarioInvitrogenA106672 mg/mL. Anticuerpo secundario diluido 1:1000
Alexa Fluor 568 anti-conejo anti-conejo IgG (H+L)InvitrogenA110362 mg/mL. Diluido 1:1000
Hoechst 33342Thermo FisherH3570 10ML10 mg/mL. Diluido 1:1000
Cubreobjetos 24x24 mmDeltalabD102424
FluoromountSigma-AldrichF4680-25ML
Microscopio vertical Nikon Eclipse E1000con cámara CCD
Microscopio confocalLeica MicrosystemsLeica SPE Microscopio confocal vertical
ImageJ 1.50g freeware
software MATLAB El softwareMATHWORKS, Inc.
Software OriginPro 8.5 Coordinación
PicoSPM Fibronectina de plasma bovino al 10% http://imgej.nih.gov/ij OriginLab

Referencias

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