En tiempo real temblando inducida por conversión de ensayo para la detección de priones CWD en materia Fecal

Yo Ching Cheng; Samia Hannaoui; Theodore Ralph John; Sandor Dudas; Stefanie Czub; Sabine Gilch

doi:10.3791/56373

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Artículo de método

En tiempo real temblando inducida por conversión de ensayo para la detección de priones CWD en materia Fecal

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DOI:

10.3791/56373

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29 de septiembre de 2017

Yo Ching Cheng^*¹ , Samia Hannaoui^*¹ , Theodore Ralph John² , Sandor Dudas³ , Stefanie Czub³ , Sabine Gilch¹

¹Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, ²Dept. of Molecular Biology, University of Wyoming, ³Canadian Food Inspection Agency, Lethbridge Laboratories

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para describir una técnica de amplificación del prión simple, rápido y eficiente, el método de conversión inducida por el temblor en tiempo real (RT-QuIC).

Resumen

La técnica de RT-QuIC es una sensibilidad en vitro acelulares priones test de amplificación basado principalmente en el mal plegamiento y agregación de substrato de la proteína (PrP) de prión recombinante usando las semillas del prión como plantilla para la conversión. RT-QuIC es una técnica novedosa de alto rendimiento que es análoga a la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (PCR). Detección de crecimiento de fibrilas amiloides se basa en el colorante tioflavina T, que aparece sobre la interacción específica con proteínas ricas hoja de ᵦ. Así, la formación de amiloide puede detectarse en tiempo real. Hemos intentado desarrollar una prueba de cribado no invasiva confiable para detectar priones de la enfermedad (CWD) emaciación crónica en extracto fecal. Aquí, específicamente hemos adaptado la técnica de RT-QuIC para revelar PrP^Sc siembra actividad en heces de CWD infectados cérvidos. Inicialmente, la actividad de siembra de los extractos fecales preparamos fue relativamente baja en RT-QuIC, posiblemente debido a potenciales inhibidores de análisis en la materia fecal. Para mejorar la actividad de siembra de los extractos de las heces y eliminar potenciales inhibidores de ensayo, homogeneizaron las muestras fecales en un tampón que contiene detergentes e inhibidores de la proteasa. También hemos presentado las muestras a diferentes metodologías para concentrarse PrP^Sc en base a la precipitación de la proteína usando sodio ácido fosfotúngstico y la fuerza centrífuga. Finalmente, los extractos de las heces se analizaron optimizado RT-QuIC que incluyó el recambio de sustrato en el protocolo para mejorar la sensibilidad de detección. Así, estableció un protocolo para la detección sensible de priones CWD siembra actividad en heces de cérvidos preclínicos y clínicos por RT-QuIC, que puede ser una herramienta práctica para diagnóstico no invasivo de CWD.

Introducción

Enfermedades priónicas o encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) son trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Creutzfeldt - Jakob (ECJ) en humanos, la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en bovinos, scrapie en ovejas y cabras y emaciación crónica enfermedad (CWD) en cérvidos ¹^,². Las EET se caracterizan por la apariencia espongiforme distintivo y pérdida de neuronas en el cerebro. Según la hipótesis de "sólo proteína", priones están compuestos principalmente de PrP^Sc ('Sc' para scrapie) ³, una isoforma mal plegada de la proteína priónica celular codifi....