Artículo de método

Purificación de ADN Viral para la identificación de las proteínas virales y celulares asociadas

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DOI:

10.3791/56374

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31 de agosto de 2017

 , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Pittsburgh School of Medicine

En este artículo

Resumen

El objetivo de este protocolo es específicamente la etiqueta y aislar selectivamente la DNA viral de células infectadas para la caracterización de proteínas del genoma viral asociado.

Resumen

El objetivo de este protocolo es para aislar el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) DNA de las células infectadas para la identificación de asociado viral y celulares proteínas por espectrometría de masas. Aunque proteínas que interaccionan con genomas virales desempeñan un papel importante en determinar el resultado de la infección, un análisis exhaustivo de las proteínas del genoma viral asociado no era previamente posible. Aquí nos muestran un método que permite la purificación directa de los genomas de HSV-1 de las células infectadas. Replicación de ADN viral selectivamente se etiqueta con nucleótidos modificados que contienen un grupo funcional de alquino. Etiquetado ADN es entonces irreversible y específicamente etiquetada vía el accesorio covalente de la azida de biotina través de cobre (I)-catalizado reacción de cicloadición o clic de azida-alquino. DNA etiquetados biotina es purificado en bolas recubiertas de estreptavidina y las proteínas asociadas son eluidas identificadas por espectrometría de masas. Este método permite la focalización selectiva y el aislamiento de las horquillas de replicación de HSV-1 o genomas enteros de entornos biológicos complejos. Además, la adaptación de este enfoque permitirá la investigación de diversos aspectos de la infección herpética, así como el examen de los genomas de otros virus ADN.

Introducción

Virus tienen una capacidad limitada para realizar las funciones esenciales y por lo tanto depende de factores del anfitrión para facilitar los aspectos más importantes de infección que incluye transporte, replicación, reparación, recombinación y expresión génica viral. Las actividades de estos factores de host están a menudo aumentadas por proteínas virally codificadas. Además, el virus deben evitar detección e interferencia por respuestas celulares a la infección viral. Por lo tanto, las interacciones host de virus determinan el resultado de la infección. De primordial importancia es entender cómo virus alteran el ambiente celular para adaptar la maquinaria celular para facilitar procesos virales. De particular interés es identificar qué factores y procesos que actúan sobre genomas virales durante todo el ciclo infeccioso.

Herpes simplex virus tipo 1 (HSV-1) es que un doble trenzado DNA virus que infecta una parte sustancial de la población humana. En la primera hora de la infección, el genoma viral entra en el núcleo, donde una cascada de pedidos de la expresión génica viral sobreviene en coordinación con el viral de replicación de ADN (vDNA)1. En el núcleo, genomas están sujetas a regulación epigenética, se someten a reparación y recombinación y se empaquetan en la cápsida, que los primeros viriones de progenie se producen en menos de seis horas. La evaluación integral de las proteínas del genoma viral asociado a través del curso de la infección será sentar las bases para investigar los detalles moleculares de los procesos que actúan en genomas virales y se proporcionan la penetración en qué factores virales y celulares participan en distintas etapas de la infección.

Los métodos anteriores para la investigación de factores de huésped implicados en la infección viral incluyen la purificación de la afinidad de las proteínas virales para el análisis de las proteínas celulares asociadas2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. estos ensayos han sido instrumentales para la identificación de los factores celulares implicados en las respuestas antivirales host, así como modificación de la cromatina viral, la expresión génica, y reparación del ADN. Sin embargo, es difícil determinar si las interacciones dependen de la asociación con vDNA y proteómica sólo proporciona la penetración en las interacciones que se producen en función de un factor viral específico. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se ha utilizado para identificar donde se unen las proteínas virales y celulares específicas a genomas virales10,11,12,13,14 , 15 y la hibridación in situ fluorescente (FISH) combinado con inmunocitoquímica ha permitido la visualización de los factores celulares que colocalize con vDNA16,17,18, 19 , 20. estos ensayos permiten análisis espacial y temporal. Sin embargo, limitaciones incluyen la necesidad de anticuerpos altamente específicos, sensibilidad limitada y la necesidad de la visión anterior de las interacciones host de virus. Por lo tanto hemos desarrollado un método basado en iPOND (aislamiento de proteínas de ADN naciente)21 y aniPOND (acelerada nativa iPOND)22 selectivamente etiqueta y purificar vDNA de infectado las células para la identificación objetiva de genoma viral proteínas asociadas por espectrometría de masas. iPOND ha sido fundamental para la investigación de la dinámica de la bifurcación de replicación celular.

Para la purificación selectiva de los genomas virales de las células infectadas, replicar vDNA está etiquetado con nucleósidos ethynyl modificado, 5-ethynyl-2´-desoxiuridina (EdU) o 5-ethynyl-2´-desoxicitidina (EdC) (figura 1), seguido de covalente verbal a azida de biotina a través, haga clic en química para facilitar la purificación del solo paso de genomas virales y las proteínas asociadas en bolas recubiertas de estreptavidina (figura 2B). Lo importante, las infecciones se llevan a cabo en las células fijas, que no participan en la replicación del ADN celular para permitir el etiquetado específico de vDNA. Además, la infección HSV-1 causa la detención del ciclo celular e inhibe celular ADN replicación23,24. Virus puede ser prelabeled antes de la infección para el análisis de proteínas relacionadas con genomas virales entrantes (figura 1A) o marcado durante la replicación del ADN para el análisis de proteínas relacionadas con vDNA recién sintetizada (figura 1B) 25. Además, los análisis de chase de pulso pueden utilizarse para investigar la naturaleza de las proteínas asociadas con la replicación viral las horquillas (figura 1)26. Además, vDNA ethynyl-modificado puede ser covalentemente conjugado con un fluoróforo de investigación espacial de la dinámica de la proteína (figura 2A y figura 3). La proyección de imagen permite la visualización directa de vDNA es un método gratuito para la validación de las interacciones vDNA-proteína y puede ser adaptada para rastrear genomas virales a lo largo de la infección. Esperamos que estos enfoques podrían modificarse aún más para el estudio de cualquier aspecto de la infección herpética, incluyendo latencia y reactivación y para el estudio de otros virus ADN. Por otra parte, etiquetado con uridina 5-ethynyl (UE) podría permitir el análisis de genomas virales de RNA.

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Protocolo

1. cultivo celular, infección Viral y etiquetado de EdC ( figura 1)

el siguiente protocolo implica trabajar con virus. Por favor, consulte a su institución ' protocolos de bio-seguridad de s sobre manejo seguro de virus y otros agentes biológicos. Este protocolo fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Pittsburgh.

  1. Trypsinize un frasco de cultivo de tejidos 2 150 cm confluentes de células MRC-5 y las células se transfieren a una placa de cultivo de tejidos de 600 cm 2 que contiene 100 mL DMEM y 10% FBS. Incubar a 37 ° C en presencia de 5% CO 2 para 3-4 días llegar a la fase estacionaria y confluency. Un plato de 2 cm 600 confluente contiene ~ 7 x 10 7 células. Preparar 1 para cada condición y 1 placa para cada control negativo correspondiente.
    Nota: Las células deben llegar a la fase estacionaria para inhibir la replicación del ADN celular para asegurar que sólo vDNA es etiquetado y purificado en los pasos posteriores.
    Nota: Cada muestra requiere una conexión sin etiqueta de control negativo preparado con las mismas condiciones de infección y momento sin la adición de EdC.
    Nota: A escala versión de este experimento debe llevarse a paralelamente a la prueba para el etiquetado de la DNA celular por proyección de imagen usando el crecimiento de la célula comparable, infección, EdC etiquetado condiciones y puntos de tiempo (ver paso 2).
  2. Diluir 7 x 10 8 PFU HSV-1 en 7 mL frío Tris-Buffered salino (TBS). Retire el medio de crecimiento y mantenga a 37 ° C. Para infectar, añadir 7 mL diluido virus células MRC-5 y por 1 h a temperatura ambiente. Después de adsorción, retirar el inóculo, lave con 50 mL temperatura TBS y reemplazar el original medio de crecimiento. Incubar a 37 ° C en presencia de 5% CO 2. Este paso debe realizarse para cada condición experimental y el control negativo.
    Nota: EdC mayor etiquetado puede lograrse utilizando a HSV-1 mutantes defectuosos para la expresión del dUTPase viral (gen UL50) o uracil glicosilasa (UL2 gene). HSV-1 dUTPase tiene especificidad de substrato baja y pueden disminuir la activación de varios análogos de los nucleósidos análogos 25 , 27.
    3. Genomas virales de la etiqueta de
  3. con EdC. Siga las instrucciones de etiqueta entrantes genomas (1.3.1.), replicación de genomas (1.3.2.), u horquillas de replicación viral (1.3.3)..
    Nota: Único paso 1.3.1, 1.3.2 y 1.3.3 debe realizarse según genomas entrantes, genomas duplicados o las horquillas de replicación que se analizará en los pasos posteriores, respectivamente.
    Nota: Puede sustituirse por EdC EdU o f ara EdU. La toxicidad de los análogos de nucleósidos debe supervisar y minimiza.
    1. Uso prelabeled las acciones a llevar a cabo la infección en el paso 1.2 y proceda al paso 2 o 3 a 4 horas post infección (hpi) para investigar sin replicar vDNA ( figura 1A).
      Nota: Preparar virus prelabeled las existencias utilizando el protocolo descrito previamente 25. Las poblaciones de virus deben pasarse a través de una columna G-25 para quitar cualquier EdC residual.
    2. Etiqueta vDNA replicación mediante la adición de 5-25 μm EdC al medio de cultivo celular de las células infectadas para 2-4 h ( figura 1B). Antes de agregar, diluir EdC en 1 mL de medio de cultivo.
    3. Para etiquetar las horquillas de replicación viral, después del inicio de la replicación vDNA (≥ 4 hpi), etiqueta de pulso replicar vDNA con 5-25 μm EdC durante 5-20 min. A perseguir, lavar 3 x con medio de chase que contiene 25-100 μm 2´deoxycytidine (deoxyC) y luego se incuban en presencia de medio de chase para un adicional 20-40 min ( figura 1).
      Nota: Medio pulso y chase debe equilibrarse a 37 ° C y 5% de CO 2 antes de su uso.
      Nota: Para los experimentos de la persecución del pulso, es importante considerar la cantidad de tiempo que toma para que nucleósidos entrar en la célula y ser phosphorylated antes que pueden ser incorporados en la replicación de ADN. Esto debe determinarse empíricamente.
      Nota: Para determinar la resolución de los experimentos de pulso chase, calcular la tasa de replicación viral bajo las condiciones experimentales utilizados. Esto puede ser determinado por PCR cuantitativa de genomas virales durante un solo paso crecimiento tiempo curso 26.
      Nota: Para imágenes genomas virales proceda al paso 2 y para la purificación de los genomas virales, vaya al paso 3.

2. Proyección de imagen de EdC etiquetado ADN ( figura 2A)

Nota: es útil para llevar a cabo la proyección de imagen junto con el método de purificación del genoma viral para verificar que el ADN celular no está etiquetado en experimentos. La proyección de imagen también puede utilizarse para visualizar la naturaleza del etiquetado vDNA y validar datos de proteómica. Ejemplos de ADN viral y celular, patrones de tinción se muestran en la figura 3.

  1. Realizar infecciones y EdC etiquetado como se indica en el paso 1 excepto usando escala las condiciones sobre cubreobjetos en un plato de cultivo de tejidos de 12 pozos que contienen 1 mL de medio de cultivo.
  2. Fijar las células con 1 mL 3.7% paraformaldehido en PBS 1 x durante 15 min a TA. Después de la fijación, enjuague las células 2 x con 1 mL 3% BSA en PBS.
    PRECAUCIÓN: Paraformaldehido puede causar lesiones graves o permanentes. Precauciones de seguridad.
    Nota: El protocolo se puede detener aquí y cubreobjetos pueden conservarse a 4 ° C en el segundo lavado hasta 3 días.
  3. Permeabilizar las células con 1 mL de tampón de permeabilización [véase Tabla de materiales] por 20 min a temperatura ambiente mientras balanceo.
  4. Enjuague con 1 mL de 3% de BSA y luego cuadra con 1 mL 3% BSA en PBS durante 30 min a temperatura ambiente mientras balanceo.
  5. Agregar 1 mL de la reacción de clic cóctel [véase Tabla de materiales] a cubreobjetos Conjugación covalente Alexa Fluor 488 azida a EdC etiquetado ADN. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras la mecedora. Aspirar y lavar dos veces con 1 mL de PBS.
  6. Tinción de ADN celular con 1 mL de la dilución de 1:2,000 de Hoechst en PBS durante 30 min a temperatura ambiente mientras balanceo. Aspirar y lavar dos veces con 1 mL de PBS.
    7. Protocolos de inmunofluorescencia indirecta de
  7. tinción con los anticuerpos primarios y secundarios según el estándar 25.
    Nota: Etiqueta vDNA colocalizes con ICP8, ICP4 o UL42 y etiquetada celulares ADN colocalizes con tinción de Hoechst.
  8. Montaje de cubreobjetos en portaobjetos y las células mediante un microscopio de fluorescencia de imagen.
    Nota: Diapositivas pueden almacenarse a 4 ° C durante varias semanas.

3. Purificación de proteínas asociadas y vDNA

Nota: varios aspectos de este protocolo han sido adaptados de la Leung et al. 22
Nota: todos los buffers y reactivos deben ser enfriados en hielo antes de su uso y todas las medidas deben realizarse en hielo a menos que se indique lo contrario.

  1. Núcleos de cosecha.
    Nota: Antes de aislamiento de los núcleos, formaldehído puede utilizarse para la reticulación proteínas al ADN. Condiciones más estrictas de lavado pueden utilizarse durante la purificación de ADN en bolas recubiertas de estreptavidina. Para crcondiciones de osslinking y lavado ver Sirbu et al. 21.
    1. reemplazar el medio de cultivo con 20 mL de tampón de extracción de núcleos (NEB) e incubar por 20 min a 4 ° C con oscilación ocasional. Los núcleos serán visibles en el microscopio.
    2. Raspar el núcleo de la placa usando un raspador celular y transferir a un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar durante 10 min a 2.500 x g a 4 ° C a núcleos de la pelotilla, descartar el sobrenadante.
      Nota: Trypan coloración azul se puede utilizar para verificar el aislamiento de los núcleos de las células.
    3. Suavemente desalojar el pellet nuclear en 10 mL de PBS, transfiéralo a un tubo cónico de 15 mL y de pellets por centrifugación durante 10 minutos a 2.500 x g a 4 ° C. completamente quitar PBS.
      Nota: Los núcleos pueden ser congelados y el protocolo se puede detener en este punto. Para ello, con cuidado Resuspender el precipitado nuclear en 500 μl de congelación de búfer e incubar el tubo en un baño de hielo seco/etanol. Almacenar los núcleos congelados a-80 ° C. Antes de usar, descongelar núcleos a temperatura ambiente, transferir rápidamente al hielo, añadir 10 mL de PBS, roca suavemente a la mezcla, de pellets por centrifugación durante 10 minutos a 2.500 x g a 4 ° C y eliminar completamente PBS. Núcleos de congelación puede resultar en rendimiento reducido.
  2. Covalentemente conjugada biotina-azida a EdC etiquetado vDNA.
    1. Resuspender el pellet nuclear en reacción de click 10 mL de la mezcla [véase Tabla de materiales] transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces con una pipeta de 10 mL.
      Nota: Es importante que los reactivos incluidos en la mezcla de reacción de clic se agregan en el orden indicado.
    2. Gire durante 1h a 4 ° C. Mientras gira preparar y enfriar búferes de B1, B2 y B3 [véase Tabla de materiales].
    3. Núcleos de sedimento por centrifugación durante 10 minutos a 2.500 x g a 4 ° C. completamente eliminar haga clic en la opción de mezcla de reacción y lavar el precipitado resuspender en 10 mL de PBS suavemente y centrifugar 10 min a 2.500 x g a 4 ° C.
    4. Suavemente Resuspender el pellet nuclear en 1 mL de PBS y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con una pipeta de gran diámetro. Núcleos de pellets por centrifugación 10 min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente quitar PBS y flash congelación en nitrógeno líquido.
      Nota: El protocolo puede ser una pausa en este punto y núcleos congelados pueden almacenarse a-80 ° C. congelación deshielo ayuda con posterior lisis, lo que se recomienda que los núcleos sean flash congelado incluso cuando procediendo a paso 3.3 en el mismo día.
  3. Lyse núcleos y fragmento de la DNA.
    1. Descongelar los núcleos de hielo y resuspender en 500 μl tampón B1 mediante pipeteo arriba y abajo. Incubar en hielo durante 45 minutos
    2. Muestras de someter a ultrasonido 6 veces para 30 s cada en amplitud 40% utilizando una sonda de microtip de 3 mm. Coloque las muestras en hielo por 30 s entre pulsos. Después de la sonicación, muestras deben aparecer clara, turbia no.
      Nota: Condiciones de sonicación deben optimizarse para cada sonicators. Para obtener instrucciones detalladas sobre cómo optimizar las condiciones de la sonicación se refieren a Leung et al. 22.
    3. de la pelotilla de restos celulares por centrifugación a 14.000 x g por 10 min a 4 ° C. El tamaño de la pelotilla debe disminuir sustancialmente. Filtrar el sobrenadante a través de filtro de la célula de 100 μm y mantener el flujo a través de.
    4. Añadir 500 μl tampón B2 para el sobrenadante filtrado. 900 μl de esta muestra se utilizará en paso 3.4.2.
    5. Tomar una alícuota de cada condición para aislamiento de DNA (volumen de 1/20 o 50 μL) y añadir 50 μl de 2 x solución SDS-bicarb [véase Tabla de materiales]. Continúe con el protocolo de aislamiento de ADN (paso 3.6).
    6. Tomar una alícuota de cada condición de entrada proteína (volumen de 1/20 o 50 μL) y añadir 50 μl de 2 x Tampón Laemmli, congelar en nitrógeno líquido y guardar a -80 ° C. uso de paso 3.5.6.
  4. Enlace biotinilado ADN a estreptavidina cubierto cuentas.
    1. T1 de estreptavidina preparar granos magnéticos al transferir 300 μL de la mezcla de grano a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Preparar un tubo de granos por muestra. Perlas de lavado 3 veces con 1 mL de tampón B2 Vortex para suspender de nuevo, aplicando un imán para separar los granos, y aspirando el tampón de lavado.
      Nota: Optimizado vinculante el resultado de las condiciones en producción maximizada y Unión de fondo mínimo. Se determinó experimentalmente que granos magnéticos Streptavidin T1 tienen una capacidad significativamente mayor de perlas de agarosa, así como otros granos de estreptavidina y menos fondo obligatorio de Streptavidin C1 granos ( Figura 4A ).
    2. Agregar 900 μl de la muestra del paso 3.3.4. los granos lavados y girar durante la noche a 4 ° C.
      Nota: No no granos de vortex, una vez que la muestra se agrega a ellos.
      Nota: Si cantidades significativas de ADN o de proteína están aisladas en el control negativo sin etiqueta, este paso se puede reducir de la noche a la mañana a 4 h para reducir el atascamiento de fondo.
  5. Lavar granos y eluir proteínas asociadas y vDNA.
    Nota: Se recomienda usar puntas de filtro para los pasos restantes.
    1. Muestras de lugar en un bastidor de tubo de microcentrífuga magnético, eliminar sobrenadante, resuspender suavemente en 1 mL de tampón B2, gira a 4 ° C por 5 min
    2. Tres veces Repita el paso 3.5.1.
    3. Coloque las muestras en un bastidor de tubo de microcentrífuga magnético, eliminar el sobrenadante, resuspender en 1 mL de tampón B3 y mueva levemente a 4 ° C por 5 min
    4. Transferir 100 μl del grano mezcla (volumen del th del 1/10) a un nuevo tubo para aislamiento de DNA dependiente. Este tubo se aplica al imán, eliminar sobrenadante, resuspender granos en 100 μL 1 x solución de SDS bicarb y continúe con el protocolo de aislamiento de ADN (paso 3.6).
    5. Aplicar el tubo que contiene la mezcla restante del grano de 900 μl de paso 3.5.3. al imán, eliminar el sobrenadante y resuspender granos en 50 μl de 2 x Laemmli sample buffer eluir proteínas y complejos ADN-proteína.
    6. Hervir las muestras a 95 ° C por 15 min, vortex, rápidamente gira en la microcentrífuga y aplicar el imán. Transferencia de eluato a un nuevo tubo flash congelar y conservar a -80 ° C.
      Nota: Abren cerraduras de casquillo de uso para asegurar que los tubos no haga al hervir.
      Nota: El protocolo se puede detener en este punto y las muestras pueden almacenarse a-80 ° C durante varias semanas.
    7. Analizar las muestras de proteína por tinción de Coomassie Blue, western blot o espectrometría de masas por procedimientos estándar 25. Resultados representativos se muestran en la figura 4 y figura 5.
      Nota: Para determinar si el rendimiento de proteína es suficiente para espectrometría de masas, 7.5 μl de cada muestra se utiliza para el análisis por azul de Coomassie tinción y 7.5 μL para borrar occidental de un genoma viral representante asociado proteína (ICP4, ICP8 o UL42). El mismo volumen de lisados de paso 3.3.6. se ejecutan junto al control de niveles de entrada de la proteína. Luego se analiza la muestra restante (35 μL) por masa espectrometría como se describió anteriormente 25.
  6. De ADN
    1. incubar las muestras de pasos 3.3.5. y 3.5.4. a 65 ° C para 4-16 h. Quite de la muestra de granos magnéticos, si es necesario.
    2. Extraer muestras con alcohol de fenol: cloroformo: isoamílico de 150 μL (PCI) y transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.
    3. La restante PCI con 100 μl del extracto Tris-EDTA (TE) y añadir la fase acuosa a un tubo nuevo.
    4. Extraer muestras con alcohol de cloroformo: isoamílico de 200 μl (24:1).
    5. Purificar la fase acuosa utilizando la PCR Purification Kit según el fabricante ' Protocolo s.
      Nota: El indicador de pH en PB de búfer se volverá púrpura cuando se añade a la muestra. Añadir 10 & #181; L 3M de NaOAc pH 5.0 para disminuir el pH de la muestra.
    6. Concentración de ADN determinar usando un fluorómetro.
      Nota: Este protocolo da típicamente 100-400 ng ADN de límite de grano. Ninguna DNA debe ser detectada en el efluente del control negativo en el que EdC no fue agregada en el paso 1.3.
    7. ADN puede almacenarse en un enlace de ADN bajo tubo a 4 ó - 20 ° C y puede ser utilizado para PCR en tiempo real o el análisis de secuenciación de alto rendimiento.

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Resultados

El uso de la química del tecleo para la purificación de la DNA de las células primero fue logrado por el método de iPOND21. El propósito de iPOND es purificar las horquillas de replicación celular para la identificación de las proteínas asociadas. Hemos adaptado esta técnica para estudiar específicamente las interacciones proteína vDNA durante la infección. Manipulación del acercamiento a la etiqueta de genomas virales con EdC (figura 1

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Discusión

Este protocolo incluye varios pasos que, si no siguen cuidadosamente, pueden resultar en rendimiento de proteína redujo significativamente o contaminación con el ADN celular. Es esencial que las células fijas se utilizan para todos los experimentos para asegurar que el ADN celular no es etiquetado y purificada. Esto puede confirmarse por la ausencia de polimerasas de la DNA celulares en la muestra de proteína debido a HSV-1 no utilizar celular polimerasa de la DNA para la síntesis del genoma. EdC etiquetado y núcleos rec...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Reconocemos Hannah Fox para ayuda en la preparación de este manuscrito. Este trabajo fue financiado por los NIH grant R01AI030612.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Células MRC-5ATCCCCL-171
Suero fetal bovino (FBS)Gibco26140-179
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)Gibco12800-082Sustituido con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 12 mM  (para el crecimiento en matraces) o 30 mM (para el crecimiento en placas) bicarbinato de sodio
600 cm2 plato de cultivo de tejidosThermo Fisher Scientific166508
Tris Solución salina tamponada (TBS), pH 7,4137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine
CulataLas culatas con títulos superiores a 1x109 PFU/mL funcionan mejor
Sephadex G-25  columna (PD-10 Columna de desalinización)GE Healthcare17085101
Dimetilsulfóxido (DMSO)Fisher ScientificD128-1
5&agudo;-Etinil-2--desoxicitidina (EdC)Sigma-AldrichT511307Disolver en DMSO para preparar 40 mM de caldo, alícuota y almacenar a -20 ° C 
2&agudo;-desoxicitidina (deoxyC)Sigma-AldrichD3897Disolver en agua para preparar 40 mM de caldo, alícuota, y almacenar a -20 ° C 
Tampón de extracción nuclear (NEB)Preparar en fresco (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM de sacarosa, 0,5% Igepal)
Rascador de célulasBellco glass7731-22000Autoclave antes de usar
tripánSigma-AldrichT8154
PBS, pH 7,2 (10x)1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (diluir a 1x en agua estéril antes de usar)
Sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO4-5H2O)Fisher ScientificC489Prepare 100 mM de caldo y almacene a 4 & grados; C hasta por 1 mes
(+) L-ascorbato de sodioSigma-AldrichA4034Preparar 100 mM de caldo y almacenar en hielo hasta su uso
Biotina azidaInvitrogenB10184Prepare 10 mM de caldo en DMSO, alícuota, y almacene a -20 ° C hasta por 1 año 
Haga clic en Reaction MixPrepare inmediatamente antes de usar agregando reactivos en el orden indicado (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM de Biotina Azide, 1 mL 100 mM de ascorbato de sodio)   
Cóctel Completo Inhibidor de Proteasa Roche11697498001Disolver en 1 mL de agua para preparar 50x caldo, puede almacenar a 4 & grados; C hasta por 1 semana, o agregue directamente 1 pastilla a 50 mL de tampón
de congelación TampónPrepare fresco (7 mL de glicerol al 100%, 3 mL de NEB, 200 μ L 50x inhibidor de la proteasa)
Tampón B1Preparar en fresco (25 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x inhibidor de la proteasa)
Tampón B2Preparar en fresco (150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5% de Igepal, 1x inhibidor de la proteasa)
Tampón B3Preparar en fresco (150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 8, 1x inhibidor de proteasa)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipado con una sonda de micropunta de 3 mmSonicsVCX 130
Cell strainerFalcon352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Life Technologies65601
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
Mini-Tube RotatorFisher Scientific260750F
2x TampónMezcle 400 mg de SDS, 2 mL de glicerol al 100%, 1,25 mL de 1 M de Tris (pH 6,8) y 10 mg de azul de bromofenol en 8 mL de agua. Tienda en 4  ° C hasta por 6 meses. Antes de usar, agregue 1 M de DTT hasta una concentración final de 200 mM.
Cierres de tapa para tubo de 1,5 mlReactivos
Scientific Kit de tinción azul coloidal NOVEXInvitrogenLC6025
placa de cultivo de tejidos de 12 pocillosCorning3513
CubrecubreobjetosFisher Scientific12-545-100Autoclave antes de usar
Portaobjetos de microscopioFisher Scientific12-552-5
16% de paraformaldehídoElectrónica Microscopy Sciences15710Diluir al 3,7% en 1x PBS antes de usar
Albúmina sérica bovina (BSA)Fisher ScientificBP1605Preparar 3% en 1x PBS
Tampón de permeabilización (0,5% Triton-X 100)Sigma-AldrichT8787Preparar 0,5% Triton-X 100 en 1x PBS
Cóctel de reacción de clic - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de imágenesSondas molecularesC10337Preparar según el protocolo del fabricante
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399Preparar 10 mg/mL en agua, puede almacenar a 4 & grados; C durante un máximo de 1 año
Anticuerpo primario anti-ICP8 de ratónAbcamab20194Utilizar una dilución 1:200 en 1x PBS
Anticuerpo primario anti-UL42 de ratón (2H4)Abcamab19311Utilizar una dilución 1:200 en 1x PBS
Goat Anticuerpo secundario conjugado con 594Life Technologiesa11005Utilice una dilución 1:500 en 1x PBS
Immu-mountThermo Fisher Scientific 9990402
2x SDS-solución de bicarbonato2% SDS, 200 mM NaHCO3
Fenol:cloroformo:alcoholMezclar 25:24:1 al menos 1 día antes de usar, almacenar a 4 & grados; C en la oscuridad
cloroformo:alcoholMezclar 24:1 al menos 1 día antes de usar, almacenar a temperatura ambiente en la oscuridad
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0100 mM Tris, 10 mM EDTA (diluir a 1x antes de usar)
Qiaquick PCR kit de purificaciónQiagen28104
3 M acetato de sodio pH 5.2
Qubit 2.0 FluorímetroInvitrogenQ32866
Qubit dsDNA HS Kit de ensayoInvitrogenQ32851
Tubos de ensayo QubitInvitrogenQ32856
Microscopio de fluorescencia equipado con software
Microcentrífuga para tubos de
Centrífuga de sobremesa para tubos de
mL Célula incubadora de
cultivo Biosafety cabinet
Heat blocks65 ° C y 95 ° C
HSV-1 Solución azul de de congelación de muestra Laemmli de Western Blot estándar NC9679153 Fisher ratones isoamílico isoamílico de imagen1,5 mL15 y 50

Referencias

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