General protocolo muestra y médula de proceso para medir enfermedad Residual medible y células leucémicas en la leucemia mieloide aguda

Summary

Detección de enfermedad residual mínima o medible (Milirutherford) es un biomarcador pronóstico importante para refinar la evaluación de riesgo y predicción de la recaída en la leucemia mieloide aguda (AML). Estas directrices amplias y recomendaciones con las mejores prácticas de identificación consistente y precisa y detección de MRD, puede ayudar en la toma de decisiones eficaces de tratamiento de AML.

Abstract

Criterios de respuesta en la leucemia mieloide aguda (LMA) ha sido recientemente restablecido, con examen morfológico para determinar si los pacientes lograron remisión completa (CR). Aproximadamente la mitad de los pacientes adultos que ingresaron CR se recaída dentro de 12 meses debido a la consecuencia de las células AML residual en la médula ósea. La cuantificación de estos restantes células de la leucemia, conocidas como enfermedad residual mínima o medible (MRD), puede ser un biomarcador robusto para la predicción de estas recidivas. Por otra parte, el análisis retrospectivo de varios estudios ha demostrado que la presencia de MRD en la médula ósea de los pacientes AML se correlaciona con la supervivencia pobre. No sólo es la población leucémica, reflejado por células albergar una leucemia asociados fenotipo inmunológico (pila), asociado al resultado clínico, pero también lo es la subpoblación de inmaduros baja frecuencia de células madre de leucemia (LSC), los cuales pueden ser seguimiento a través de citometría de flujo MRD o MRD-como enfoques. La disponibilidad de ensayos sensibles que permiten la detección de células de la leucemia residual (stem) en base de características específicas de la enfermedad o enfermedades asociadas (marcadores moleculares anormales o aberrantes immunophenotypes) tiene evaluación de MRD drásticamente mejorada en la AML. Sin embargo, dada la inherente heterogeneidad y complejidad de esta afección como enfermedad, métodos para el muestreo de la médula y realizar análisis de MRD y LSC deben armonizarse siempre que sea posible. En este manuscrito que se describe una metodología detallada para el aspirado de médula ósea adecuado de muestreo, transporte, procesamiento para la evaluación de la citometría de flujo óptimo de varios colores y estrategias para evaluar el indicador MRD y LSC para ayudar en la toma de decisiones terapéuticas que bloquean la muestra para los pacientes AML.

Introduction

Leucemia mieloide aguda (AML) es que un tumor maligno de la médula ósea caracterizado por defectos en el programa de maduración, con proliferación anormal y la acumulación de las células progenitoras mieloides, inhibición de la hematopoyesis normal y en última instancia, insuficiencia de la médula ósea . La enfermedad es altamente heterogénea en cuanto a morfología, immunophenotype, citogenética, las aberraciones moleculares y firmas de expresión génica, así como a la respuesta al tratamiento y tratamiento resultado^1,2. El manejo actual incluye la quimioterapia de inducción con el objetivo de lograr la remisión completa (CR), seguida por remisión posterior al tratamiento, que es en gran medida guiado por los resultados moleculares, citogenéticos y immunophenotypic estudia y consiste ya sea en varios cursos de quimioterapia adicional o trasplante de células madre (autólogos o alogénicos)³. A pesar de tasas de remisión alta después de quimioterapia intensiva de hasta 90% supervivencia a 5 años en adultos sólo es aproximadamente 30-40%, principalmente debido al desarrollo de recidivas que son normalmente resistentes a la quimioterapia y así muy difícil de tratar. Resultado en los niños es mejor, aunque aproximadamente un tercio de la recaída también. Por lo tanto, la detección temprana de recaída inminente llenará una necesidad médica y puede orientar la terapia post remisión⁴.

Enfermedad residual después de terapia puede reflejar la suma de todos los diagnóstico y mecanismos/factores de resistencia post-diagnóstico; por lo tanto, su medición puede ser instrumental para guiar el tratamiento y pronóstico. La posibilidad de enfermedad residual de delimitando (antiguamente llamada enfermedad residual mínima y ahora se refiere como medibles de enfermedad residual o MRD) muy por debajo de los criterios morfológicos de 5% de blastocitos está cambiando el panorama de la clasificación de riesgo. Actualmente los dos métodos que se utilizan sobre todo para detectar la MRD son flujo cytometry y molecular-, este último se evalúa por la transcriptasa reversa PCR (RT-qPCR)⁵ o, aunque en una etapa prematura, por nueva generación sequencing (NGS). Muchos estudios en adultos como en niños ya demostrado que diversos enfoques MRD proporcionan información pronóstica fuerte en AML tanto después de^6,de la terapia de inducción y consolidación⁷y una nueva definición de carga de enfermedad ( superior a CR morfológica) está ahora emergiendo⁸. Esto sugiere que MRD evaluados por flujo o técnicas moleculares deben ser y de hecho son ya cada vez, estándares en cada ensayo clínico en la AML.

Este manuscrito describe el procedimiento de citometría de flujo detallados para obtener una caracterización precisa y reproducible immunophenotypic de MRD en muestras de médula ósea, incluyendo la toma de muestras de médula ósea y tratamiento procedimientos anteriores citometría de flujo. La disponibilidad de muestras de médula ósea de buena calidad en el diagnóstico y seguimiento es crucial para el éxito de esta medida a través de centros clínicos y ensayos clínicos. De hecho, estas consideraciones pre-analíticas son también de los enfoques MRD de vital importancia para molecular (PCR y NGS). Para la caracterización de immunophenotypic de MRD, marcadores expresados aberrantemente se combinan con mieloide normal y marcadores del progenitor, para identificar una leucemia asociados immunophenotype (pila)⁹. MRD mide el resultado de muchos factores que influyen en la respuesta a la terapia, tales como resistencia intrínseca o adquirida leucemia, farmacodinamia y cinética de la terapia, la vigilancia inmune y cumplimiento. Por lo tanto, MRD es un muy fuerte parámetro pronóstico posterior al diagnóstico asociado con resultado clínico cuando dicotomizada en un nivel de corte determinado por análisis de la característica de funcionamiento de receptor (ROC). En nuestra cohorte AML adultos de HOVON 42a estudio, el nivel de corte se fija en 0,1% de glóbulos blancos de pila total células positivas. Utilizando este criterio para determinar el estado MRD positivo vs negativo, se puede identificar un grupo de pacientes que tienen una incidencia de recaída significativamente peor, supervivencia libre de recidiva y general⁶. Además, describimos la medición de las células de leucemia inmaduras, resistente a los medicamentos con características similares a la célula de vástago (células CD34 + CD38-leucemia o LSC), que ofrece un fuerte predictor de resultados de los pacientes¹⁰. Forma el enfoque MRD de citometría de flujo se acerca a pila y LSC. El enfoque de pila es apropiado para aproximadamente el 90% de los pacientes, mientras que el enfoque LSC puede aplicarse en alrededor del 80% de los pacientes. Juntos sobre el 95% de los pacientes pueden ser evaluado para un parámetro o ambos.

Por último, esta publicación ofrece una descripción detallada de la operación para evaluar MRD por citometría de flujo. Esto incluye: 1) armonización o estandarización de los procedimientos de muestreo de la médula ósea, dirección de transporte 2) muestra 3) Descripción detallada de la detección de células leucémicas con FACS usar varios paneles de anticuerpos incluyendo célula tubo enfoques para caracterizar el LSC, 4) máquinas de montaje de la FACS para las mediciones estandarizadas, 5) programas analíticos para mediciones de MRD y 6) programas analíticos para la detección de la LSC.

Nuestro objetivo es mostrar todas las facetas del procedimiento incluida la preparación de la muestra puesto rara vez se discute si bien es un tema importante para la calidad del resultado final. Biopsia y aspiración de médula ósea son procedimientos clínicos utilizados para evaluar las células hematopoyéticas en la médula ósea. Estos se realizan con un conteo sanguíneo completo (CSC) y un frotis de sangre. El método óptimo para la aspiración de médula ósea es crucial para la diagnosis exacta y el seguimiento para la medición de MRD. Además, un aspirado de médula ósea exitoso debe contener suficientes células para realizar el análisis de flujo de pila y LSC (células viables por lo menos 10 millones). Aquí, describimos el método para realizar una aspiración de médula ósea y ofrece una guía, que debe resultar en adecuada celda muestreo (y límite de la posibilidad de hemodilución) necesarios para la investigación adicional y precisa el diagnóstico. Estas consideraciones pre-analíticas son también de los enfoques MRD de vital importancia para molecular (PCR y NGS). Todas las muestras de immunophenotyping deben procesarse preferencial dentro de las 24 h de colección. Aunque no recomendable, muestras de sangre periférica y médula ósea pueden todavía ser procesadas y analizadas conservado hasta 72 h a temperatura ambiente. Además, todas las manipulaciones con el material deben realizarse en condiciones estériles, para permitir que la criopreservación de células estériles para la posterior evaluación de la investigación/calidad etcetera.

Protocol

El protocolo sigue las directrices del código de la investigación y el Comité de ética de investigación de la VU University Medical Center.

1. médula ósea aspiración y muestra la preparación de

1. Preparación paciente y material
   1. Llene una o dos jeringas de 10 mL con lidocaína al 1% utilizando una aguja de calibre 16. Sustituir la aguja por una aguja de calibre 21.
   2. Ponga dos gotas de EDTA 5% en un vidrio de reloj.
   3. Configurar diapositivas de vidrio (n = 15 con numerador constante de la paciente y la fecha) para la preparación de frotis.
   4. Colocar paciente en posición decúbito lateral. Localizar la Espina ilíaca posterior superior y marque con lápiz.
      Nota: en general, la espina dorsal ilíaca superior posterior está situado una mano anchura distal a la cresta ilíaca y una mano anchura lateral a la línea media. En las hembras, la columna vertebral real puede ser un poco más lateral, en algunos hombres un poco más mediales.
   5. Desinfectar la piel con clorhexidina 0.5-1% en etanol de la zona de biopsia previsto hacia fuera en círculos.
   6. Abra el paquete de guantes estériles, colóquese los guantes estériles y colocar el paquete sobre la mesa para crear un campo estéril. Abra el paquete con la aguja de aspiración y colóquelo en el campo estéril.
   7. Infiltrar la piel y tejido subcutáneo y finalmente periostio. En el periostio, administrar la lidocaína de tal manera que un área de 1 cm de diámetro ha sido anestesiado.
      Nota: La administración adecuada de lidocaína al periostio es uno de los factores más importantes para la comodidad del paciente. Probar si el periostio ha sido adecuadamente anestesiado golpeando la ubicación prevista de la biopsia con aguja introducida y preguntar si el paciente siente algún dolor. Nota: los niños están completamente anestesiados durante todo el procedimiento.
   8. Sujete la aguja para aspirado (15 Ga x 2,8") con el extremo proximal de la palma y el dedo índice contra el costado del eje metálico de la aguja cerca de la punta; esta posición permite mejor control.
   9. Introducir la aguja con un movimiento de rotación (rápidamente alternando movimiento pronating/supinating) a través de la piel hacia la Espina ilíaca y llevar la aguja en contacto con la Espina ilíaca posterior.
   10. Asegurar que la aguja se introduce a la zona de anestesia de periostio; el paciente debe sentir ningún dolor y presión. Si el paciente siente dolor, vuelva a colocar la aguja, o administrar lidocaína más.
   11. Ejerciendo una presión suave pero firme, avanzar la aguja girando en movimientos alternados hacia la derecha contra las agujas del reloj. Entrada en la cavidad de la médula ósea se detecta generalmente por disminución de la resistencia.
   12. Retire el estilete de la aguja. Conecte una jeringa vacía de 10 mL para la aguja.
   13. Aplicar presión negativa al retirar el émbolo de la jeringa con un suave tirón. Advertir al paciente que puede sentir una sensación de calambre y dolor cuando se se aspira la médula ósea. Si no hay suficiente espículas de médula ósea son liberados, otra aspiración debe realizarse con un drenaje rápido. Espículas más será en los primeros 1-2 mL de la atracción inicial. Aspirar sólo 1-2 mL para evitar la dilución de la muestra.
       Nota: Disolución dará lugar a hemodilución y pueden confundir los resultados MRD).
   14. Retire la jeringa y vuelva a colocar el estilete en la aguja de aspiración. Expulsar parte de la médula en un vidrio de reloj y el resto en un tubo de 8 mL con heparina.
       Nota: Invertir cada tubo inmediatamente después de colocar el aspirado de médula ósea en el tubo de muestra para asegurar la anticoagulación adecuada. Coagulación de la médula ósea a menudo es la causa de material inadecuado. Adicionales de la médula puede ser aspirada desde el mismo lugar, pero preferiblemente, la aguja se avanza 5-10 mm antes de toma una aspirada nuevo. Preferentemente deben tomarse no más de 2 sorteos por cada nivel de la inserción. Asegúrese de marcar los tubos con el aumento de números representando la primera, segunda o consecutivos dibuja. Es regla común con el primer sorteo para el análisis diagnóstico más relevante.
   15. Alternativamente, retraer la aguja desde el lugar de inserción y reintroducir en la cavidad de la médula unos pocos milímetros de distancia del lugar de inserción original y repita el procedimiento.
       Nota: No aspirar más de 1-2 mL por extracción, para evitar la contaminación de sangre significativa.
   16. Repita con la frecuencia que se necesita material. Cuando se aspira el material suficiente para el protocolo de estudio clínico específico, sacar la aguja de la médula ósea.
       Nota: En el caso de las aspiraciones de médula ósea lentas o difíciles, el uso de jeringas que fueron previamente enjuagado con anticoagulante puede ser útil. En el caso de un golpecito seco, realizar una biopsia de trépano que está fuera del alcance de este manuscrito.
2. Preparación de frotis para examen morfológico
   1. Para una óptima evaluación morfológica, escoja espículas (p. ej. usando una espátula de plástico) de la aspirada en el vidrio de reloj y coloque en un portaobjetos de vidrio.
   2. Suavemente coloque otro portaobjeto sobre la diapositiva con la médula y deslice suavemente; evitar cualquier presión.
      Nota: Sólo en caso de espículas de médula ósea muy grande ligera presión puede ejercerse, para disminuir el espesor de la célula que se separa. Los beneficios del procedimiento de la ayuda de un asistente que puede manejar los tubos de muestra. Etiquetado exacto de los tubos con el número de pacientes y el número del sorteo secuencial de la médula es crucial.
   3. Seque el portaobjetos y luego realizar Giemsa Grünwald puede manchar (véase tabla de materiales). Examinar bajo el microscopio óptico para la morfología (ver figura 1).
      Nota: La figura 1A muestra los frotis de médula ósea sana que consiste en tipos de diferentes células funcionales mientras figura 1B un paciente AML con ráfagas leucémicas predominante. Para definir mejor la carga leucémica residual, immunophenotyping debe realizarse.

2. transporte de material para su posterior procesamiento

1. Preparación de las muestras para el transporte
   1. Para asegurarse de que el material no se escapará y los tubos no se romperán, asegurar correcto empaquetado (ver figura 2).
      Nota: De nuestras otras experiencias la viabilidad de las células y se conserva mejor cuando la médula ósea se mantiene a temperatura ambiente. Para el transporte a largo plazo esto se logra mejor usando una temperatura 'gel-pack' para ayudar en la estabilidad de la temperatura durante el transporte.
   2. Paquetes de etiquetas y añadir las formas correctas para evitar la pérdida del paquete, transporte prolongado o la conmutación de los pacientes.
      Nota: Esto al menos debe contener: datos del paciente (formulario 1). Esto debe incluir el número del estudio y la fecha de nacimiento. Esencial para el procesamiento adecuado del material después de su llegada al laboratorio receptor, es una clara declaración de específicamente análisis de laboratorio solicitados (diagnóstico molecular, Inmunofenotipificación, MRD etc.) en este formulario. (Forma 2) Dirección y número de teléfono de una persona de contacto, y cuando es necesario, papeles para la aduana. Para evitar perder paquetes en el correo, el laboratorio envío siempre notifica el laboratorio receptor que una muestra ha sido enviada. Se recomienda el uso de "seguimiento y rastreo".
2. Recibe muestras de otros institutos
   1. Asegúrese de que la logística adecuada en el lugar en el Instituto al recibir la muestra en el laboratorio tan pronto como se entrega en el Instituto.
      Nota: Se requiere de una organización logística óptima preferentemente un laboratorio central, que recibe y recopila todo el material de la clínica local y de hospitales externos. En particular, la asignación de protocolos para la distribución y una comunicación clara con los laboratorios ejecutivos es esencial.
   2. Después de recibir las muestras, observar con precisión la numeración correspondiente en forma impresa y una base de datos segura que contiene importantes campos como número de identificación de MRD, número de identificación específico de ensayo, número de registro del Hospital, Instituto de envío, fecha de nacimiento, material tipo (médula ósea o sangre periférica), conteo de glóbulos blancos (WBC), fecha de la aspiración de médula ósea, fecha de la medición de la muestra y cualquier observaciones relevantes para la calidad de la medición.
      Nota: Preferiblemente, esta base de datos también está equipado para contener datos adicionales (o vincularse a otras bases de datos) de análisis de resultados y otros datos del paciente como datos de seguimiento.

3. configuración de citómetro de flujo de

Nota: Esta sección está basada en instrucciones Euroflow. ¹¹

1. De voltajes de fotomultiplicador (PMT) para parámetros SSC FCS y canales de fluorescencia blanco
   1. Para FCS SSC parámetros poner en marcha el citómetro de flujo y realizar la "citómetro configuración y seguimiento (CST)" en el citómetro de flujo con los granos de la CST (véase tabla de materiales). Lisar hematíes de un donante sano (descrito en la sección 4.1).
      1. Crear un nuevo experimento (en el menú: experimento, experimento nuevo, seleccione experimento en blanco) usando el software del fabricante (ver tabla de materiales) con un Forward scatter (FSC) versus trama de punto la dispersión lateral (SSC) para configurar los parámetros de FSC y SSC. Nombre este experimento PMT FSC/SCC con la fecha. Primero utilizar la configuración actual de citómetro (click derecho: "aplicar CST actual"). Estos ajustes se han generado con el control de rendimiento de CST con perlas de CST-calibración (véase tabla de materiales). Ajuste de FSC y SSC para visualizar los linfocitos en "experimento global settings". Nota: en nuestro citómetro de flujo son 285 V y 400 V respectivamente. Marcar la "compensación de habilitar": Inspector/instrumento ajustes/compensación.
      2. Para evaluar el tamaño de las células (FSC) y el nivel de detalle (SSC) Inicio medición sin etiqueta lisis glóbulos periféricos por la función de "adquirir las células". Puerta de los linfocitos y ajustar/fine-tune FSC y SSC tensiones para llegar a los siguientes valores de target media para la población de linfocitos cerrada: FSC: 100.000 (gama 95.000 105.000); SSC: 15.000 (rango de 13.000-17.000).
      3. Adquirir y registrar datos mediante la medición de al menos 10.000 eventos. Verificar el promedio FSC y SSC valores de linfocitos cerrados de destino y vuelva a ajustar si es necesario.
   2. Para configurar la fluorescencia blanco canales voltajes PMT utilizan partículas de calibración de cuentas 8-pico arco iris (véase tabla de materiales).
      1. Crear un nuevo experimento en el FACS de 7 picos. Crear una hoja de cálculo "Objetivo fluorescente intensidad media (MFI)" con todas las parcelas necesarias dot (n = 2; FSC y SSC, FITC y PE), histogramas (n = 8; un histograma para cada detector de fluorescencia) y estadísticas que indiquen la referencia valores máximos (MFI y coeficiente de variación (CV)) para cada canal de fluorescencia.
      2. Recién preparar una solución que contiene 1 gota (± 60 μL) de perlas de arco iris en 1 mL de dH₂O. suavemente vortex para mezclar los granos en solución.
      3. Utilizar la configuración de la PMT de la FSC/SSC voltajes desde arriba y start medir la fluorescencia de las perlas de arco iris mediante la función de "adquirir" (sin grabar) en "Bajo" caudal con un umbral de 5.000. Utilice el botón"puerta rectangular" a puerta de la población de granos camiseta P1 en el FSC frente a diagrama de punto SSC. Puerta 7^th pico - población P2 en el FITC versus trama de punto PE.
      4. Continuar con la adquisición de los 7 picos arco iris grano suspensión y ajustar/fine-tune PMT voltajes en todos los canales de fluorescencia para alcanzar valores según los canales de destino anotados de MFI MFI lo dispuesto con los granos.
      5. Use "Registro" para recoger datos de unos 10.000 eventos y busque el MFI de la 7^th granos de pico. Corregir las tensiones PMT si es necesario. Una vez se alcanzan valores de destino MFI para el pico de^th 7, registro/sobrescribir el archivo de los últimos valores PMT.
      6. Guardar los valores PMT finales y el nombre el archivo de configuración de PMT con la fecha, que será guardar en el catálogo de software del fabricante. Utilice esta configuración PMT para corregir el derrame sobre cada colorante de fluorescencia.
2. Ajustes de compensación de fluorescencia
   1. Etiquetar un tubo de control sin manchas y cada anticuerpo conjugado del fluorocromo (véase tabla S1 para los fluorocromos usados). Pipetear 100 μl de buffer en cada tubo.
   2. Vórtice el frasco de perlas multicolor de compensación (véase tabla de materiales) bien y luego añadir 1 gota completa (± 60 μL) de estos granos a cada tubo.
      Nota: Evite el goteo de los granos por el lado del tubo al agregar a cada tubo. Esto puede llevar a la concentración baja del grano y puede afectar los resultados de la matriz de compensación.
   3. Pipeta el volumen adecuado calculado para una prueba de anticuerpo conjugado con fluorocromo suficiente (que sería suficiente para teñir 10⁶ células) en el tubo correspondiente y vórtice completamente. No añadir anticuerpo al tubo control sin manchas. Incubar durante 15 a 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente (RT).
   4. Añadir 4 mL de tampón de lavado (solución salina con tampón fosfato (PBS)/0.05% azide-0.1% albúmina sérica humana (HSA) (véase tabla de materiales)) a cada tubo. Centrifugar los tubos a 300g por 10 minutos quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de grano mediante la adición de 0,2 mL de tampón de lavado a cada tubo. Vórtex los tubos completamente.
   5. Abra el software de análisis del fabricante (ver tabla de materiales) y crear un nuevo experimento (en el menú: experimento, experimento nuevo, seleccione experimento en blanco) y cambie el nombre de archivo de compensación con fecha actual.
   6. Vaya a "configuración de citometría" y utilizar el valor PMT de la sección 3.1. Asegúrese de que el umbral en FSC es 5.000 y los valores de compensación de todos los fluorocromos usados son cero.
   7. Crear controles de compensación, incluyendo tubos de etiqueta específico, según sea necesario. Asegúrese de incluir un control sin manchas. Seleccione del menú: experimento, configuración de la compensación, crear controles de compensación.
   8. Cargar el tubo de control sin manchas y ajustar la puerta P1 en la población de tira de camiseta y asegúrese de que la puerta P1 contiene sólo granos de camiseta.
   9. La puerta P1 con el botón derecho y seleccione "Aplicar a todos controles de compensación". Datos de registro para todos los tubos de fluorescencia etiquetado individual. Verifique que la puerta P2 abarca a la población positiva en cada histograma de fluorescencia. Si es necesario ajustar la puerta.
   10. Calcular la indemnización. Seleccione experimento, configuración de la compensación, calcular indemnización.
   11. Si el cálculo de la remuneración no es satisfactoria, se muestra un mensaje de error. Realizar los ajustes necesarios y volver a calcular. Cuando el cálculo de la remuneración es exitoso, un cuadro de diálogo aparece preguntar el nombre para la configuración de la compensación.
   12. Escriba un nombre (por ejemplo configuración de color de 8 AA-MM-DD) y haz clic en el enlace y guardar. La configuración de compensación también se guardarán en el catálogo de configuración de la compensación.
       Nota: Puede utilizarse la misma configuración para todos los experimentos usando el mismo fluoróforos.

4. flujo Cytometry evaluación (pila y LSC)

Nota: Aquí se describe el procedimiento de lisis a granel antes de la tinción, que permite a una recomendado: concentración de glóbulos blancos de la mancha. Mayoría de los protocolos MRD utiliza este enfoque aunque algunos han utilizado con éxito otras opciones como la coloración antes de lisis. Toda la médula ósea tinción antes de lisis minimiza pérdida de célula preferencial¹², pero tiene la desventaja de las concentraciones de células imprevisibles, demasiado baja.

1. Lisis masiva de las células
   Nota: Mantenga las muestras unmanipulated horizontal a temperatura ambiente, cuando la adquisición de cytrometric de flujo no puede realizarse el mismo día con el fin de iniciar todo el procedimiento al día siguiente.
   1. Agite la muestra de médula ósea anticoagulada a homogeneidad invirtiendo la muestra varias veces. Determinar la concentración de células de médula ósea (conteo de glóbulos blancos (WBC)) usando una célula contando cámara con celular Tuerk solución de tinción (véase tabla de materiales).
   2. Pipeta el volumen necesario de la médula ósea en un tubo separado 15 mL. La cantidad de células es dependiente en el número de tubos separados de tinción; para una tinción (un tubo) usar aproximadamente 2 x 10⁶ leucocitos por las medidas de la pila y 8 x 10⁶ leucocitos para la medida del tubo LSC.
   3. Lyse células de sangre rojas por adición de solución de lisis (ver tabla de materiales). Volumen requerido de solución de lisis debe ser 10 veces el volumen de la suspensión de células.
   4. Mezclar suavemente por inversión e incubar 10 min a TA. Centrifugar durante 7 min 800g en RT. descartar el sobrenadante (e.g. con una bomba de vacío o una pipeta Pasteur). Resuspender el precipitado de células en solución salina con tampón fosfato (PBS)/0.05% azide-0.1% albúmina sérica humana (HSA) (véase tabla de materiales) en el uso de RT. el volumen máximo del tubo.
   5. Centrífuga para 7 g 800 min a TA. descartar el sobrenadante (e.g. con una bomba de vacío o una pipeta Pasteur). Resuspenda el precipitado de células en PBS/0.05% azide-0.1% HSA a una concentración celular de 100 x 10 6/mL WBC y dividir por el número de los tubos previstos.
2. La coloración de células por citometría de flujo
   1. Pipeta anticuerpo monoclonal (MoAb) solución cóctel mezcla en los tubos de clasificador (FACS) de células activado por fluorescencia apropiado e incubar a las células sometidas a lisis de la médula durante 15 min en la oscuridad.
      Nota: Esto es muy importante cuando se utilizan tintes de tándem. Por ejemplo, ver las mezclas de los paneles estándar utilizados en nuestro laboratorio (tabla S1).
   2. Lavar las células con 3 mL PBS/0.05% azide-0.1% ha. Centrifugar las células durante 5 min a 400g. Deseche el sobrenadante (e.g. con una bomba de vacío o una pipeta Pasteur) y resuspender el pellet celular en 300 μL PBS/0.05% azide-0.1%HSA.
   3. Para la medición de la LSC: Resuspender el precipitado de células en 400 μL PBS/0.05% azide-0.1% HSA y agregar 4 μL de granos en blanco (por ejemplo Spherotech, véase tabla de materiales) para utilizar como población control negativo en el análisis.
   4. Abrir el MRD o LSC experimento lay-out en el FACS (véase tabla de materiales) y medida para WBC de MRD al menos 100.000 eventos para medición de muestras de pacientes de AML en el diagnóstico y 1 X 10⁶ WBC para muestras AML en el seguimiento. Del LSC experimentos miden menos de 4 x 10⁶ WBC tanto en el diagnóstico y seguimiento para obtener un resultado confiable de la LSC.
   5. Guardar los datos utilizando un nombre de archivo apropiado estandarizado para el análisis de los resultados. Hacer un inventario de los diferentes marcadores medidos en las células de la AML y en las células AML (positiva, negativa, expresión en exceso/incompleta) y almacenar estos datos en el diario de laboratorio.
   6. En caso de no diagnóstico pila disponible, medir todos los 4 tubos en el seguimiento para asegurar que cualquier posible pila medible puede ser identificado en un enfoque diferente de lo normal.
   7. Elegir el más confiable de LAIP(s)¹³ establecida en diagnóstico y adquirir tantos eventos como sea posible, pero > número mínimo definido.

5. identificación de leucemia asociado inmuno-fenotipos (pila): Análisis de diferentes poblaciones celulares

Nota: Los archivos FCS pueden ser analizados con varios programa de software para la visualización óptima de las diferentes poblaciones celulares (véase tabla de materiales).

1. Población de glóbulos blancos
   1. Puerta de las células de CD45 positivo y las células que aparecen viables, dejando de lado bajo FSC (células no viables, las células eritroides) dentro de la trama de la FSC/SSC; Estos contienen el CMB (Figura 3A). Mostrar el CMB y utilizar uno de los marcadores primitivos (por ejemplo CD34; Figura 3Aii) para ayudar a determinar la posición final de las explosiones en la zona de CD45dim (Figura 3Aiii).
   2. Las células CD45dim de la puerta y detrás de la puerta las células en la parcela FSC/SSC (figura 3B). Retire la puerta de CD34 (figura 3Bii) al informar el % de células en esta puerta como % de blastos en el árbol de la población en el programa. Mostrar las explosiones en un SSC/CD34 parcela y puerta de las células CD34 positivas (figura 3Biii).
2. Linfocitos
   1. Utilizar los linfocitos como control interno: las poblaciones mieloides como linfoides poblaciones como control positivo y control negativo.
   2. Partir de la población de glóbulos blancos (Figura 4A). Linfocitos de la puerta como el CD45^alta/SSC^baja población (Figura 4B).
   3. Asegúrese de que no hay ninguna célula mieloide en la puerta con CD34, CD117, CD13 o CD33 y puerta de las células negativas del negativo/CD33 CD13 (figura 4C-E). Llame a esta población 'linfocitos' en el árbol de la población (figura 4F).
3. PILA en el diagnóstico
   1. Las ráfagas de la puerta y posteriormente las células CD34 positivas en un SSC/CD34 parcela y estos 'marcador primitivo' en el árbol de la población.
   2. Parcela las células primitivas, en este caso CD34 positivas y los linfocitos en una parcela nueva con un marcador linfoide (CD7) contra un marcador mieloide (CD33). La población aberrante (véase normas complementarias 1 de archivo) de la puerta y llaman 'Pila positivo' en el árbol de la población.
      Nota: La final elegida pila se divulga como pila de % en la población de la ráfaga. La sensibilidad, especificidad y estabilidad de las LAIPs pueden establecerse sólo por personal con amplia experiencia en las mediciones de MRD. El total de estos parámetros determina la calidad de la pila. En figura 5 A, D, se presentan ejemplos de cuatro diferentes cuotas de pila en la diagnosis.
   3. Determinar la expresión de LAIPs (% blastos) y mantener estos datos en una base de datos o archivo de excel.
   4. Hacer informes de los análisis FACS y las notas de las LAIPs que tienen que ser utilizados en las mediciones de MRD.
      Nota: La definición de LAIPs está autorizada en un equipo de expertos ya que es una característica esencial para las medidas exactas de MRD en siga para arriba.
4. MRD en seguimiento
   1. Las ráfagas de la puerta como se describe en 5.1 pero dependiendo del punto de tiempo después de la terapia; correcta evaluación de esta puerta puede ser desafiadora. En el fenotipo de pila que se estableció en el diagnóstico y la población inmadura de la puerta.
   2. Según lo descrito en 5.1. encontrar la puerta correcta explosión basada en la aberración definida y estar al tanto de la regeneración de la médula ósea y expresiones normales para sacarlos de la puerta
   3. Repetir la misma estrategia que bloquean puntos en todo seguimiento y determinar MRD como el porcentaje de células de la pila en la población entera de glóbulos blancos. Ver por ejemplo figura 6A y 6B.
   4. Informe positividad MRD cuando el % de MRD es ≥ 0,1% de las células de sangre blancas. Imprimir datos en un formato estándar para discutir semanalmente con el equipo MRD. Registrar los resultados después de llegar a un consenso. Deje que los resultados a ser autorizado por el supervisor antes de comunicar los resultados a los clínicos.

6. Análisis de Stem cell MRD (LSC solo tubo)¹⁴

1. Análisis del LSC en el diagnóstico y seguimiento
   1. Las células de la ráfaga de la puerta como se describe en la sección 5.1.
   2. Como control negativo potencial para CD38-, puerta fracción de glóbulos rojos (es decir, resto glóbulos rojos después de la lisis, caracterizado como SSC^baja/FSC^baja y CD45^negativo). Si es necesario, las células muertas y fragmentos celulares pueden ser excluidos por una puerta adicional en este terreno.
   3. Determinar dentro de la puerta de explosión leucémicas la subpoblación con expresión de CD34. Seleccione dentro de esta población el CD34⁺ CD38 células^– (usar como atajo: borde superior de los granos en blanco de calibración para la determinación de umbral (véase tabla de materiales), la fracción roja o uso 10³ como punto de corte). Llamar a esta población 'CD38 progenitores^baja' (figura 7).
      Nota: Ver archivo adicional 1 para más detalles sobre el ajuste de los niveles de CD38-corte-off.
   4. Determinar dentro de esta población^baja de CD38 el verdadero CD34 + CD38^{muy baja} población de células madre, utilizando la mediana de la fracción roja, la frontera más baja de los granos de la calibración en blanco o elegir 10² como punto de corte (figura 7 ). Ver archivo adicional 1 para más detalles sobre la configuración de los niveles de CD38-corte-off.
   5. Dentro de ambas poblaciones, las células leucémicas y las células madre hematopoyéticas normales (LSC vs HSC) de la puerta mediante el análisis de cada marcador leucémica en el panel (es decir, CD45RA, combi 6 (CLEC12A, TIM-3, CD7, CD11b, CD22 y CD56 en PE), CD123, CD33 y CD44).
   6. Parcela el marcador de células madre de interés frente a otros marcadores de células madre comparar positividad/negatividad con positividad/negatividad de marcadores y afinar LSC versus frecuencia HSC.
   7. Informe el porcentaje de blastos inmaduros, linfocitos, células de CD34 +. Para los marcadores todo separados, una lista el número total de^bajas de CD38 y CD38^verylow y los números de CD38^baja y CD38^verylow que marcador positivo (y por lo tanto neoplásica).
   8. Seleccione el marcador que mejor distingue a las células madre hematopoyéticas normales vs células madre leucémicas para su posterior análisis. Calcular el porcentaje de LSC y HSC como porcentaje de glóbulos blancos total.
      Nota: Un porcentaje de LSC de ≥ 0.004% se reporta como LSC positivo al diagnóstico, mientras que el corte es 0,0001% en el seguimiento. Células aberrantes que bloquean en las muestras de seguimiento es similar al análisis como al diagnóstico, sin embargo, un número de células en las poblaciones de células madre puede ser muy pequeño. Por lo tanto, la necesidad de adquirir suficientes eventos.

Results

En el 90% de los pacientes AML se puede identificar por lo menos una pila. Para generar los porcentajes exactos de pila + las células de las células primitivas de la ráfaga en la diagnosis, el ajuste apropiado de la puerta de explosión es crucial y necesita verificación como visualizado en la figura 3. Un ejemplo de cada paciente que un tipo específico de aberración en las primitivas células de CD34 + se visualiza en la figura 5. Para medición de MRD en el seguimiento, el anteriormente definido pila + células cerradas y define como porcentaje de pila + las células de los glóbulos blancos. Por lo tanto, el ajuste de esta puerta es crucial para lograr los resultados correctos de MRD. La figura 6 muestra un paciente que permanece en remisión completa y un paciente que después de tener resultados positivos de la MRD (≥ 0.1%) de las recaídas después del segundo ciclo de la terapia de inducción.

El protocolo actual sólo es adecuado para definir las células madre en células CD34 +, puesto que la caracterización exhaustiva de este compartimento ha demostrado que el CD38-población alberga la célula de vástago más potente como fracción. Para separar el LSC de la HSC dentro de esta fracción, se usan marcadores adicionales. Los marcadores más a menudo seleccionados para distinguir LSC son CD45RA y el canal de combi que 6 marcadores específicos de LSC con PE. De acuerdo con otras evaluaciones clínicas, un nivel de corte de ≥ 0.004% se definió como positivo de LSC y se asoció con peor supervivencia en la diagnosis mientras que un nivel de corte de 0,0001% se utilizó en el siga-up¹⁰.

Figura 1 : Frotis de médula ósea. Donante A) sano y paciente B) AML (subtipo FAB 5). Tinción de Giemsa en 100 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Corregir el material de embalaje para líquidos biológicos. Más detalles sobre las normas y reglamentos de transporte de fluidos biológicos pueden encontrarse en el sitio¹⁵ de los centros de Control y prevención de enfermedades. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Estrategia para la definición de células de la ráfaga que bloquean. A) compuerta CD45dim, B) compuerta CD34 + blastos.

Figura 4 : Bloquear linfocitos. A) células azul son WBC se muestra en la trama de la FSC/SSC, células B) verdes son linfocitos caracterizados por CD45^alta/SSC^baja, C) se muestran ejemplos de negatividad para CD34, D) negatividad para CD117 y la E) negatividad para CD13, F) los diferentes tipos de células en un árbol de población Resumen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : LAIPs en la diagnosis AML. A) pila basada en cruz linaje aberración (CD7 en células expresan CD33), B) pila basada en diferenciación asincrónica (CD11b en células expresan CD13), C) pila basada en sobreexpresión en comparación con las células normales (CD34^{muy alta} de CD13 expresando las células), D). PILA basada en underexpression en comparación con las células normales (HLA-DR^bajo de CD33 expresando las células). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Pila seguido durante la terapia. Definición A) pila al diagnóstico (CD34 + / CD13 + / CD33-) y pérdida de la pila durante el seguimiento en un paciente que permaneció en remisión completa continua, definición de la pila B) en el diagnóstico (CD117 + / CD7 + / CD33 +) y persistencia de la pila durante el seguimiento en un paciente que recayó. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7 : Célula de vástago que bloquean. Un) Gating de la diferentes CD34 + / CD38 poblaciones basan en granos (CD38^baja está por debajo del borde superior de los granos, mientras que el CD38 se definen como las células negativas verdadera representación del LSC^{muy baja} y se encuentran debajo de la mediana de los granos), B) dos ejemplos de pacientes con distinción entre HSC y LSC en la carta recordativa basada en CD45RA^neg y CD45RA^pos expresión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Amplios datos disponibles que muestran evidencia de positividad MRD asociada a supervivencia pobre, y por lo tanto evaluación de MRD puede mejorar resultados de los pacientes por proporcionar información pronóstica adicional sobre la que se pueden hacer las decisiones clínicas. Por lo tanto, un método consistente y armonizado para la evaluación inmuno-fenotípico de MRD es esencial para en última instancia mejorar la terapia del paciente. Esto también es importante cuando se comparan estudios clínicos a través de diferentes centros clínicos, y puede en última instancia, ayuda en la clínica la decisión haciendo y sirviendo como un extremo clínico de sustituto para la supervivencia general. La idea de que directrices sólidas están garantizadas para las mediciones de MRD precisas y coherentes ha conducido a una acción concertada de la red europea de leucemia (ELN) a directrices de diseño de vanguardia. Este documento completo será publicado tarde-2017 y será fundamental para muchos grupos de estudio y laboratorios de avanzar.

Pasos críticos en el protocolo

Un aspecto a menudo pasado por alto e importante de análisis MRD es el impacto de la calidad de la muestra en la determinación exacta de MRD. Esto es más evidente cuando el material tiene que ser transportado a otros institutos en los ensayos clínicos mundiales dados el consideraciones operativas adicionales que deben tomarse en cuenta en este entorno. Para reducir el riesgo de mezclar para arriba paciente información y entrega oportuna de la administración adecuada de las muestras es crucial. Una vez más, en esta etapa del transporte los formularios correctos y/o importación en sistemas electrónicos hospital con asignaciones claras de los análisis solicitados se requiere. Teniendo en cuenta la etapa en la terapia de toma de muestras de MRD también es crucial puesto que puede ser relevante para la decisión clínica (por ejemplo después de segundo curso de la terapia) y, por tanto, debe definirse claramente. El uso de información falsa (como por ejemplo el 1 de enero por el año de nacimiento) aumenta el riesgo de mezclar pacientes o análisis. Si es requerido por ley, debe utilizarse una forma alternativa de anónimas de identificación.

Todas las muestras de immunophenotyping deben procesarse preferencial dentro de las 24 h de colección. Aunque no recomendable, muestras de sangre periférica y médula ósea pueden todavía ser procesadas y analizadas conservado hasta 72 h a temperatura ambiente. Además, todas las manipulaciones con el material pueden mejor realizarse en condiciones estériles, para posterior criopreservación de células en biobancos (local) sigue siendo pertinente: muchos estudios clínicos con análisis adicionales para investigar las células de leucemia con respecto a las características moleculares, inmuno-fenotípicas y funcionales para llevar a cabo en una etapa posterior. Sin embargo detalles de biobancos no están dentro del alcance de este manuscrito.

Uso de MRD como una herramienta de diagnóstico implica que es necesario un laboratorio acreditado, no sólo para citometría de flujo, sino también en cuanto a control de calidad de evaluación de MRD. Esto puede requerir la distribución de muestras a laboratorios de referencia específica o (re) analizar ficheros de flujo con las mediciones de MRD por equipos de referencia.

Este artículo describe las acciones más importantes de la colección de aspirado de médula ósea para determinación de MRD en muestras clínicas - que requieren todo un equipo de expertos con tareas específicas, responsabilidades y con comunicación frecuente para la eficaz caracterización y análisis. Puesto que cada tarea es fundamental para el procedimiento, se recomienda tener sonido logística incluyendo protocolos en cada laboratorio y suficiente personal de respaldo que ha sido específicamente entrenado para la tarea. Además, puesto que hay algunos pasos relativamente subjetivos en la parte de los procedimientos (especialmente pila y LSC aberrante marcador de identificación), es esencial para las discusiones sobre el resultado final por el equipo y el informe final autorizado por un equipo de supervisores. Los esfuerzos actuales están llevando a cabo desarrollo de software de ordenador que te ayudará a estandarizar el análisis MRD (pila y LSC).

Modificación y resolución de problemas

Cada laboratorio puede tener su propio conjunto de anticuerpos que puede utilizarse para definir las diversas subpoblaciones, aunque tener una columna vertebral estandarizada de marcadores es esencial para obtener resultados comparables, como se indica en las directrices del estado del arte ELN para documento medidas de MRD anteriormente descrito. Independientemente de los marcadores solicitados hay algunas cuestiones que pueden dificultar el análisis de los resultados y deben tomarse en consideración.

Limitaciones de la técnica

La identificación de expresión aberrante de marcadores de pila y LSC primero es evaluada en el diagnóstico y seguimiento en el tiempo (durante y después de la terapia) para una caracterización precisa del fenotipo MRD. Mientras que sobre el 95% de los pacientes pueden ser evaluado mediante pila o LSC (o ambos), todavía algunos pacientes tienen no LAIPs definidos o no CD34 + CD38-LSCs presentan CD34 negativo ráfagas o tienen una muestra falta de diagnóstico. En estos casos, vale la pena probar y medir MRD con un panel de anticuerpos tan amplios como el número de celdas disponibles permite y luego selecciona la más confiable (dando la distinción más fuerte de las células leucémicas) pila. Teniendo en cuenta que una proporción de pacientes que recaen en última instancia no parecen totalmente el immunophenotype de diagnóstico, debido a la heterogeneidad de la enfermedad ALD, medir un amplio panel de anticuerpos en MRD se recomienda de todos modos. Estos cambios de immunophenotypic incluyen células de la ráfaga y LSCs y han demostrado que ocurren durante la terapia¹⁶ y la enfermedad medible puede basarse en estas poblaciones próximas llamadas. En este momento sin embargo, no ha sido determinada si todas las subpoblaciones de immunophenotypic dará lugar a recaída de la enfermedad, y es por lo tanto no habitual Informe MRD a medida-terapia basada en estas células en los ensayos clínicos. Es importante tener en cuenta que el riesgo de perder LSC debido a cambios de la población se reduce por el acercamiento de un tubo en el que los más importantes marcadores define aberración son en citometría de un flujo (PE) canal¹⁴.

Importancia con respecto a los métodos existentes

El método descrito en el presente Protocolo se basa en la definición de LAIPs uno o más, que las células se siguen durante la terapia. Una desventaja de este método es que se ha recientemente demostrado que la pila puede cambiar durante la terapia. De esta forma que algunas poblaciones próximas con diferentes marcadores aberrantes pueden ser faltadas. Para evitar esto, lo mejor sería medir todos los marcadores de aberrantes en lugar de sólo los que se encuentran en el diagnóstico. Esto sería similar a lo "diferente de la normal" que es utilizado por varios laboratorios¹⁷.

Futuras aplicaciones

Recientemente, MRD ha recibido atención adicional para el nuevo diseño de ensayo clínico. En la era de las opciones de tratamiento especializado y farmacoterapia específica, el uso de MRD como una medida de resultado se reduce el tiempo necesario para establecer la eficacia clínica de nuevos tratamientos, en última instancia, lo que permite una introducción más rápida de urgencia terapéutica opciones en la clínica. La importancia de la logística adecuada y ejecución práctica de una evaluación armonizada de MRD son cruciales para el futuro éxito del tratamiento de AML como la FDA está investigando la factibilidad de uso de MRD como un endpoint sustituto en vez de la supervivencia global mide¹⁸.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
	BD Biosciences	120995496,060996589 y 013729	FACS Canto II
	BD Biosciences	555360	CD7 FITC
	DAKO	F076701	CD2 FITC
	Sanquin	M1613	CD36 FITC
	BD Biosciences	332778	CD15 FITC
	BD Biosciences	335039	CD45RA FITC
	BD Biosciences	345810	CD56 PE
	BD Biosciences	337899	CD22 PE
	BD Biociencias	345785	CD14 PE
	Miltenyi Biotec	130-080-801	CD133 PE
	BD Biociencias	562566	Clec12a PE
	BD Biociencias	565568	Tim-3 PE
	BD Biociencias	332774	CD7 PE
	BD Biociencias	333142	CD11b PE
	BD Biociencias	337899	CD22 PE
	BD Biociencias	345810	CD56 PE
	BD Biociencias		347222 CD34 PERCP-CY5.5
	BD Biociencias	558714	CD123 PERCP-CY5.5
	Beckman Coulter	B49221	CD117 PE-CY7
	BD Biociencias	562854	CD33 BV421
	BD Biociencias	345791	CD19 APC
	BD Biociencias	333143	CD11b APC
	BD Biociencias	345800	CD33 APC
	BD Biociencias	345807	CD38 APC
	BD Biociencias	641411	HLA-DR APC-H7
	BD Biociencias	560532	CD44 APC-H7
	BD Biosciences	562596	CD13 BV421
	BD Biosciences	348811	CD34 PE-CY7
	Beckman Coulter	A96416	CD45 Krome Orange
	BD Biosciences	655873	CD45 HV500c
	BD Biosciences	655051	perlas CST
	BD Biosciences	555899	Solución
	BD Biosciences	644204	CompBeads
	BD Biosciences	655051	cuentas CST
	Biosciences		FACSDiva software
	Cytognos		Infinicyt
	Spherotech	Euroflow RCP-30-5a
	Sigma-Aldrich		Tuerk solución
	Spherotech	BCP-100-5	Partículas de calibración en blanco Perlas
			HSA
			azida
			ddH2O