Artículo de método

Biblioteca de péptido superpuestas a epitopos Qa-1 en una proteína

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DOI:

10.3791/56401

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20 de diciembre de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, Loma Linda University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

QA-1 (HLA-E en humanos) pertenece a un grupo de moléculas de histocompatibilidad no clásicas complejas 1b. Inmunización con epítopos de Unión-1-control de calidad se ha demostrado para aumentar la regulación inmune del tejido específico y mejorar varias enfermedades autoinmunes. Adjunto describimos una estrategia de biblioteca de péptidos superpuestas para la identificación de los epitopos de Qa-1 en una proteína.

Resumen

QA-1 (HLA-E en humanos) pertenece a un grupo de 1b complejo mayor de histocompatibilidad no clásicas moléculas (MHC-Ib). Los datos recientes sugieren que las moléculas de Qa-1 desempeñan papeles importantes en topografía las células para la integridad estructural y funcional, induciendo la regulación inmune y limitar las respuestas inmunes a las infecciones virales. Además, el aumento funcional de CD8 restringidas de 1 Qa+ T las células a través del epítopo inmunización ha demostrado efectos terapéuticos en varios modelos animales de enfermedad autoinmune, por ejemplo, encefalomielitis alérgica experimental, artritis inducida por colágeno y la diabetes no obesos. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de un método que puede eficientemente y rápidamente identificar epítopos de Qa-1 funcionales en una proteína. Aquí, describimos un protocolo que utiliza CD8 restringidas de 1 Qa+ T cell líneas específicas para una biblioteca de péptidos (LPO) superpuestas para determinar Qa-1 epitopos en una proteína. Esta biblioteca OLP contiene péptidos traslapados 15-mer que cubren toda la longitud de una proteína y péptidos adyacentes se superponen por 11 aminoácidos. Mediante este protocolo, se identificaron recientemente un epítopo de Qa-1 9-mer en la glicoproteína del oligodendrocyte del myelin (MOG). Este epítopo MOG Qa-1 recién asignada fue demostrado para inducir CD8 específicos del epítopo, restringido a Qa-1+ T las células que mayor regulación inmune específicos de mielina. Por lo tanto, este protocolo es útil para la investigación futura de nuevos objetivos y funciones de CD8 restringidas de 1 Qa+ T las células.

Introducción

QA-1 pertenece a un grupo de 1b complejo mayor de histocompatibilidad no clásicas moléculas (MHC-Ib) en ratones. Su homólogo humano es HLA-E. Pruebas anteriores se ha demostrado que moléculas de Qa-1 funciones biológicas importantes. En primer lugar, las moléculas Qa-1 juegan un papel importante en la topografía de las células para la integridad estructural y funcional. En este sentido, Qa-1 moléculas han desarrollado varias estrategias para controlar la función normal de una célula. Una estrategia de este tipo permite Qa-1 moléculas para formar complejos con un péptido líder procesados (epitope), es decir, el control de calidad-1 determinante modificador (Qdm) que se procesa de moléculas clásicas de MHC-Ia en el retículo endoplásmico1. Estos complejos de control de calidad-1/Qdm luego mostrar en la superficie de una célula y enlazar a inhibitorio NKG2A receptores en las células NK para inhibir NK matando a actividad2. Si se pierde la expresión de moléculas MHC-Ia, una célula (por ejemplo, un maligno) se vuelve sensible a NK matando a2. La otra estrategia permite Qa-1 moléculas formar nuevos complejos de Qa-1/epítopos en la superficie de una célula que es deficiente en grifo (transportador asociado con el procesamiento de antígeno)3 o ERAAP (aminopeptidasa de retículo endoplasmático asociada a procesamiento de antígeno)4 (ambas deficiencias a menudo ocurren en las células malignas). La célula que expresa estos nuevos complejos de control de calidad-1/del epítopo puede reconocida y eliminada por la específica del epítopo CD8 restringidas de 1 Qa+ T las células. En segundo lugar, las moléculas de Qa-1 inducen regulación inmune5. En este sentido, Qa-1/epitopo complejos han demostrado estimular CD8+ las células reguladoras T (Treg) que son importantes para la prevención de daño inmune-mediado de uno mismo-tejidos6,7,8 ,9,10. En tercer lugar, CD8 restringidas de 1 Qa+ Treg células se ha demostrado que limitar las respuestas inmunes contra infección viral11.

Por lo tanto, el aumento específico de específicos del epítopo CD8 de Qa-1-restrictred+ T las células es una estrategia potencialmente prometedora para la eliminación de células anormales, para la mejora de la regulación inmune y para el control de la magnitud de respuesta inmune inducida por virus. Mientras que no se ha determinado si el aumento de específicos del epítopo CD8 restringidas de 1 Qa+ T las células pueden mejorar la vigilancia inmune y limitan la respuesta inmune inducida por virus, nuestros laboratorios y otros han demostrado claramente que inmunización con epitopos Qa-1 puede aumentar la función de CD8 restringidas de 1 Qa+ Treg células específicos para patógenos autoinmunes CD4+ T las células, hasta el eficiente control de CD4+ enfermedades autoinmunes mediada por células T en un modelos de variedad de animales tales como encefalomielitis alérgica experimental (un modelo animal de la esclerosis múltiple humana)6,10, artritis inducida por colágeno (un modelo animal de artritis reumatoide humana)7, y diabetes no obesos (un modelo animal de diabetes del tipo 1 humano)8. Además, hemos descubierto que la inmunización con un Qa-1 de tejidos específicos del epítopo conduce al control específico de la inflamación mediada inmune en ese tejido a través del aumento de CD8+ Treg células12. Los éxitos anteriores de los estudios preclínicos indican la necesidad de una evaluación completa de las Qa-1 epitopo vacunas para el tratamiento de enfermedades inmune-mediadas tejidos específicos y potencialmente para el tratamiento de otras enfermedades asociadas con deficiencias en el grifo y ERAAP.

En consecuencia, existe una demanda para una tecnología que puede confiablemente y rápidamente analizar epitopos Qa-1 en una proteína. En este sentido, se ha descrito un número limitado de epitopos biológicamente importantes de Qa-1. La mayoría de estos epitopos Qa-1 se identificaron casualmente durante el estudio de CD8+ T respuestas a bacterias13, las células deficientes en grifo3, las células deficientes en ERAAP4y las células que causan EAE6, de la célula 9. Por lo tanto, una técnica de alto rendimiento es deseable para la identificación de los epitopos de Qa-1 biológicamente importante en una proteína definida. A continuación, describimos una estrategia de biblioteca péptido (LPO) superpuestas que epitopos de Qa-1 funcionales en una proteína CD8 Qa-1-resrticted+ T cell líneas específicas para el grupo de la OLP (OLP_pool) de una proteína.

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Protocolo

Todos los experimentos se realizaron en cumplimiento de una institucional Animal cuidado y Protocolo de uso aprobado por el cuidado Animal y uso de la Universidad de Texas en El Paso y la Universidad de Loma Linda.

1. generación de una biblioteca de LPO que abarca toda la longitud de una proteína

  1. Diseño de una biblioteca de la OLP en el que los péptidos son 15-mer en longitud y péptidos adyacentes se superponen por 11 aminoácidos.
    Nota: En el estudio de la OLP MOG, secuencia del precursor del MOG [Mus musculus] fue obtenido de la base de datos NCBI proteína siguiendo este enlace: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. El precursor MOG (247 aminoácidos), que contiene péptidos maduros y señal, fue utilizado porque la mayoría de los epitopos de Qa-1 (HLA-E) divulgado fueron situada en péptidos de señal (e.g. Qdm1). Empezando por su N-terminal, las secuencias de péptidos de 15-mer se identificaron tales que dos péptidos adyacentes comprometidos por 11 aminoácidos (figura 1). Por lo tanto, exactamente 59 adquisiciones fueron identificados en el precursor MOG de 247 aminoácidos. Sin embargo, la OLP último puede variar de 12 a 15-mer dependiendo de la longitud de la proteína. Además, elegimos 15-mer biblioteca porque nosotros y otros hemos demostrado que péptidos de 15-mer, cuando se añade a las células dendríticas (DCs) o macrófagos, pueden ser eficientemente transformado en epítopos para reconocimiento por CD8 de las células+ T14,15 .
  2. Adquirir comercialmente cada péptido individual. 5 mg por péptido debe ser suficiente para la proyección. Adquisiciones y péptidos truncados (paso 6.1) pueden ser péptidos desaladas (pureza es aproximadamente 50-70%). La pureza del péptido óptimo (paso 6.2) que se utilizará para la generación de tetrámero y para futuros análisis biológicos debe ser > 90%. Reconstituir los péptidos bajo condiciones de esterilidad.
  3. Hacer 50 mg/mL las acciones individuales del peptide en 100% DMSO. Para 5 mg de cada péptido, agregue 100 μL de DMSO en cada tubo, mezclar y almacenar los péptidos a-20 ° C. Estas acciones se utilizarán para hacer un caldo de OLP_pool para la generación de CD8+ T cell líneas reactiva a la OLP_pool. Además, estas acciones también se utilizarán para hacer 10 mg/mL acciones individuales del peptide para determinar la capacidad de cada péptido individual para estimular una respuesta restringida de 1 Qa en una OLP_pool reactiva CD8+ T cell line.
  4. Hacer OLP_pool acción agregando un volumen igual de cada péptido en un tubo nuevo. Este stock de OLP_pool contiene 100% DMSO. En el estudio de la OLP MOG, había 59 adquisiciones12. Por lo tanto, la concentración de cada péptido en la OLP_pool fue 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59).
  5. Hacer 10 mg/mL las acciones individuales del peptide por dilución (5 x) el stock de 50 mg/mL en estéril de H2O en una placa de 96 V-fondo-bien (esta bolsa contiene 20% DMSO). Hacer estas acciones en una placa de 96 pocillos porque la determinación de la respuesta restringida de 1 Qa de cada péptido individual se realizará en una placa de 96 pocillos con una pipeta multicanal de 8 o 12 canales.
    Nota: Todos los péptidos, incluyendo adquisiciones y péptidos truncados, deben diluirse en una placa de 96 V-fondo-bien o un rack de 96 pocillos muestra lleno de tubos de 1 mL ya que la proyección de la biblioteca de péptidos se realiza en placas de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal. Si es difícil de diluir un péptido, añadir 1 gota de NaOH N sabia ayudar a disolver el péptido.

2. cebado de Kb-/- Db-/- CD8+ las células T con el K OLP_pool-pulsadab-/- Db-/- las células dendríticas (DCs).

Nota: Existen dos alelos principales de Qa-1: uno es Qa-1unay la otra es Qa-1b. Desde los animales utilizados para la investigación académica, por ejemplo C57BL/6 y Balb/c mice, llevar control de calidad-1b, este protocolo describe el procedimiento para asignación Qa-1b epitopos en una proteína. CD8+ T las células utilizadas en este protocolo son purificadas de Kb-/-Db-/- ratones C57BL/6 (de fondo) en que CD8+ T las células están restringidas por las moléculas de MHC-Ib no clásicas como Qa-1.

  1. DCs de médula ósea de producir como describieron anteriormente12.
    1. Brevemente, la cultura suspensiones de célula de médula ósea (1 x 106 células/mL) en Medio RPMI-10 (RPMI 1640 suplementado con 10% suero fetal bovino, 5.5 x 10-5 M 2-Mercaptoetanol, piruvato de sodio 1 mM y 0,1 mM aminoácido no esencial) que contiene 10 U/mL de IL-4 y GM-CSF de 100 U/mL en una placa de 6 pozos (4 mL/pocillo) a 37 ° C, 5% CO2.
    2. Dos días más tarde, eliminar las células no adherentes con cuidado y añadir citocinas y medios frescos.
    3. Después de cultivar las células durante otros dos días, transferir las células no adherente que contiene medios frescos y citoquinas en una nueva placa de 6 pozos.
    4. Las células de la cultura durante otros dos días y llenado con medios de comunicación fresca y citoquinas que contiene LPS (0,1 μg/mL) para activar los controladores de dominio.
    5. 24 h después, recoger el DCs para experimentos.
  2. Irradiar el DCs con 3000 Rads.
    1. También puede tratar el DCs (5 x 107 células/mL) con mitomicina C (50 μg/mL) en PBS a 37 ° C durante 20 min añadir RPMI-0 (1640 RPMI sin suero) para llenar el tubo (~ 12 mL) y centrifugar las células durante 10 min en una centrífuga de mesa 300 x sobrenadantes de descarte de g. y repite t el procedimiento de lavado dos veces más. Estos tres lavados son críticos porque cualquier cantidad de rastro de la mitomicina C puede inhibir la respuesta de CD8+ T las células durante el co-cultivo de células DC-T.
  3. Ajustar la concentración DC a 5 x 106 células/mL en un medio libre de suero (objetivo V libre de suero suplementado con 5.5 x 10-5 M 2-Mercaptoetanol, piruvato de sodio 1 mM y 0,1 mM aminoácido no esencial).
  4. Añadir la solución stock de OLP_pool, que contiene 100% DMSO, a los controladores de dominio que la concentración final de DMSO será 0,5% (200 x). En el estudio de la OLP MOG, la concentración de cada LPO en el OLP_pool fue 847.46 μg/mL; por lo tanto, la concentración final de cada LPO en la cultura de DC fue 4,2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).
Sin embargo, esta concentración puede escalarse hasta 100 μg/mL como la concentración de DMSO en cultivo celular sigue siendo menos del 1%.
  • Incubar el DCs a temperatura ambiente durante 3 h y agitar las células suavemente cada 15 minutos.
  • Durante este período de incubación, purificar CD8+ T de las células de la cosecha del bazo o de ganglios de Kb-/-Db-/- ratones utilizando un comercial CD8+ T kit de purificación de la célula, ajustar la concentración de células a 10 x 106 células/mL en el medio libre de suero que contiene 50 U/mL interleucina 2 (IL-2) y 100 U/mL de IL-7.
  • Ahora, agregue el CD8+ T las células en una placa de 48 pozos como 0.5 mL/pozo (después de la adición de 0,5 mL/pozo de las DCs OLP_pool-pulsada de paso 2.8, la concentración final de los CD8+ T las células serán 5 x 106 células/mL).
    Nota: CD8+ T células de bazo de ratón y de los ganglios linfáticos pueden ser purificadas con CD8 positivos aislamiento Kit siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. CD8+ T las células obtenidas son libres de granos.
  • Desactivación de las DCs OLP_pool pulsada (300 x g, 10 min) en RT. reconstituir el DCs OLP_pool pulsada a 2 x 106 células/mL en el medio libre de suero y agregar 0.5 mL/pocillo en la placa de 48 pozos que contiene la CD8+ T las células (concentración final de la OLP _pool-pulsada DCs es 1 x 106 células/mL, concentración final de CD8+ T células es 5 x 106 células/mL, concentración final de IL-2 es de 25 U/mL y concentración final de IL-7 es 50 U/mL). Cultura de las células a 37 ° C y 5% CO2.
  • El día 4, retire y deseche unos 400 μL de medio de cultivo y añadir 500 μL del medio fresco libre de suero que contiene 100 U/mL IL-2 y 100U/mL de IL-7 a cada pocillo. Incube las células a 37 ° C y 5% CO2.
  • El día 7 o 8, volver a estimular el CD8 cebada OLP_pool+ T las células con el OLP_pool.

    • 3. restimulation de la cebada CD8+ T células con macrófagos pulsada con el OLP_pool

    1. Cuatro días antes de la estimulación de los CD8 OLP_pool cebada+ T células, preparar solución grano poliacrilamida al 2% (v/v): lavar 2 g de granos de la poliacrilamida en 20 mL libre de endotoxina H2O o PBS. Los granos de poliacrilamida de pellets por centrifugación (400 x g) durante 5 minutos y resuspender en 100 mL de PBS. Autoclave a 15 lb/m durante 20 min tienda a temperatura ambiente.
    2. Inyectar a ratones por vía intraperitoneal con 1 ratón mL de la solución estéril al 2% poliacrilamida grano atraer la migración de monocitos/macrófagos en la cavidad peritoneal16.
    3. Cuatro días más tarde, sacrificio de los animales por sobredosis de CO2 .
      1. Bajo condiciones estériles, cortar una pequeña apertura en el centro del abdomen que la apertura es suficiente para pasar una pipeta de 5 mL. Llenar la pipeta con RPMI-0 e Inserte la pipeta en la cavidad del abdomen a través de la abertura.
      2. Enjuagar la cavidad del abdomen mediante pipeteo. Pipetear en un tubo estéril (estos son los macrófagos peritoneales) tanto líquido como sea posible de la cavidad del abdomen. Repetir el enjuague 4 - 5 veces.
    4. Irradian de los macrófagos peritoneales con 3000 Rads.
      1. Por otra parte, tratar los macrófagos peritoneales con el mitomycin C (siga el procedimiento descrito en el paso 2.2).
    5. Ajustar la concentración de macrófagos peritoneales a 5 x 106 células/mL en el medio libre de suero. Se añade caldo de OLP_pool (la concentración final de DMSO es menos del 1%) y M-CSF (concentración final = 100 U/mL).
      Nota: En este estudio de OLP MOG, utilizamos DMSO 0,5%. Así, MOG OLP_pool stock fue diluida 200 x (por ejemplo, 1 μL de MOG OLP_Pool acción se añadió 199 μL de macrófagos peritoneales). Por lo tanto, la concentración final de cada LPO fue 4,2 μg/mL).
    6. Agregar 200 μL/pocillo (1 x 106 células/pocillo) en una placa de cultivo de tejidos de 48 pozos e incubar la placa a 37 ° C durante 4 horas.
    7. Eliminar las células no adherentes y los granos de poliacrilamida por lavado suave con 200 μL/pocillo del precalentado RPMI-0.
    8. Piscina el OLP_pool y recoger cebada CD8 células+ T de paso 2.10. Ajustar el OLP_pool cebada CD8+ T cell concentración a 1 x 106 células/mL en el medio libre de suero que contiene IL-2 de 25 U/mL y 50 U/mL de IL-7. Añadir 1 mL/pocillo de la placa de 48 pozos que contiene los macrófagos peritoneales OLP_pool pulsado.
    9. Cuatro días más tarde, reponer el medio en la placa de 48 pozos. Retire y deseche unos 400 μL de medio de cultivo en placas de cultivo 48-bien. Añadir 500 μL de fresco medio libre de suero que contiene 100 U/mL IL-2 y 100 U/mL de IL-7 en cada pocillo. Cultura de las células a 37 ° C y 5% CO2.
    10. Tres o cuatro días más tarde, examinar el CD8 restimulated OLP_pool+ T las células para la respuesta específica de OLP_pool, Qa-1-restringido por análisis enzima-ligado del immunospot (ELISPOT). Después de este punto, volver a estimular el CD8+ T células cada 7-10 días.
      Nota: Los macrófagos son preferibles para estimular a los CD8 cebada OLP_pool+ T las células. Nos dimos cuenta de que CD8+ T re-estimulada por el macrófago células crecieron mejor que DCs in vitro.

    4. determinación de OLP_pool específica, respuesta restringida de 1 Qa en un CD8 restimulated OLP_pool+ línea de la célula de T

    Nota: Respuesta OLP_pool específica, restringida de 1 Qa en un CD8 restimulated OLP_pool+ de células T está determinada por la secreción de IFNγ por estimulación de la OLP_pool en presencia de C1R o C1R. QA-1b las células usando un análisis de ELISPOT IFNγ. C1r células pueden obtenerse comercialmente. C1R. QA-1b células pueden ser generadas por transducción de las células de C1R con el vector lentivirales Qa-1.

    1. Añadir 100 μL/pocillo de anticuerpos anti-IFN-γ captura diluido en tampón de recubrimiento (PBS) en los pocillos de una placa ELISPOT.
    Sello e incubar la placa a 4 ° C durante la noche.
  • En el segundo día, desechar el tampón de recubrimiento que contiene el anticuerpo de captura anti-IFN-γ y agregar 200 μL/bien-blocking solución (medio sin suero) e Incube la placa por 2 h a temperatura ambiente.
  • Irradiar la C1R y C1R. QA-1b células con 9.600 Rads.
    1. Por otra parte, tratar las C1R y C1R. QA-1b células con mitomicina C como se describe en el paso 2.2, salvo que la duración del tratamiento será de 30 minutos.
  • Ajustar el C1R y C1R. QA-1b las células en el medio libre de suero a 4 x 106 células/mL.
  • Deseche la solución de bloqueo en la placa y añadir el C1R y C1R. Células de QA-1b en 50 μL/pozo (200.000 células/pocillo) y mezclar.
  • Añadir 50 μL/pocillo de 100 x diluido OLP_pool stock (en el medio libre de suero) y mezclar bien. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 2-3 h.
  • Ajustar el CD8 restimulated OLP_pool+ T las células 1-2 x 106 células/mL en el medio libre de suero que contiene 150 U/mL de IL-7 y añadir 50 μL/pocillo (50.000-100.000 células/pocillo) a la placa. Centrifugar la placa (58 x g) durante 5 minutos.
  • Incubar la placa a 37 ° C y 5% de CO2 durante la noche.
  • Aspirar la suspensión celular. Lavar los pocillos 2 veces con agua desionizada de (DI) (250 μL/pocillo). Permiten pozos en remojo durante 5 minutos a cada paso de lavado.
  • Pozos de lavar 3 veces con tampón de lavado I (PBS que contenga 0.05% Tween20). Permiten pozos en remojo durante 1 min a cada paso de lavado. Desechar el tampón de lavado.
  • Añada 100 μL de anticuerpo de detección diluido en un tampón de dilución (PBS con 10% suero bovino fetal (FBS)).
  • Incubar las placas a temperatura ambiente durante 2 h.
  • Deseche la solución de detección de anticuerpos. Lavar los pocillos 3 veces con 250 μL/pocillo de lavado Tampón I. permitir pozos en remojo durante 1 min a cada paso de lavado.
  • Añadir 100 μL/pocillo del Conjugado enzimático (HRP-estreptavidina) diluido en el tampón de dilución en dilución 1: 100.
  • Incubar las placas por 1 h a temperatura ambiente.
  • Deseche la solución de Conjugado enzimático. Lavar los pocillos 4 veces con 250 μL/pocillo de lavado Tampón I. permitir pozos en remojo durante 1 min a cada paso de lavado.
  • Lavar los pocillos 2 veces con 250 μL/pocillo II de tampón de lavado (PBS).
  • Añadir 100 μl de solución sustrato (mezcla 1 gota = 20 μl de cromógeno AEC con 1 mL de sustrato AEC) a cada pocillo. Desarrollo punto de monitor durante 5 a 60 minutos.
  • Cuando resultados deseados comienzan a aparecer, lavar los pocillos con agua destilada para detener la reacción del sustrato.
  • Secar las placas a temperatura ambiente durante 2 h o toda la noche hasta que esté completamente seca. Facilitará la extracción de la bandeja de plástico debajo de las placas de secado. Almacenar las placas en una bolsa plástica sellada en la oscuridad hasta que se analiza.
  • Enumerar puntos manualmente por inspección con un microscopio de disección o con un lector de ELISPOT. Ver el resultado representativo en la figura 2.

    • 5. determinación de péptidos individuales en el OLP_pool que estimula a la secreción de IFN-γ Qa-1 restringido en un CD8 específicas OLP_pool+ de células T

    1. Determinar los péptidos individuales que estimulan OLP_pool-específico, la secreción de Qa-1-restrictred IFN-γ en un CD8 específicas OLP_pool+ T cell línea con lo anterior descrito ensayo ELISPOT de IFN-γ (concentración final de cada péptido individual utilizado para el ELISOPT análisis es 10 μg/mL). Ver resultados representativos en la figura 3.
      Nota: Un LPO-específico, Qa-1-restircted respuesta se define como una respuesta que al menos tres veces de la respuesta en presencia de C1R. QA-1b células pero sin la OLP. En el estudio de la OLP MOG, OLP68, OLP96 y OLP105 cumplan con este criterio. Por lo tanto, todas las tres adquisiciones potencialmente contienen epitopos de Qa-112 (figura 3). Sin embargo, el OLP105 dio siempre la respuesta más fuerte; por lo tanto, realizamos un análisis detallado de la OLP105 (figura 4 y figura 5)12.

    6. identificación de la óptima epitopo de Qa-1 en un LPO 15-mer que estimula la respuesta específicos del epítopo, Qa-1-restringido en un CD8 específicas OLP_pool+ de células T

    1. Sintetizar péptidos C - y N-terminalmente truncado de una OLP 15-mer como se muestra en la figura 4.
    2. Examinar la secreción de IFN-γ en un CD8 específicas de la OLP+ línea de células T estimulando el CD8 células+ T con cada uno de los péptidos truncados como la OLP los padres 15-mer en presencia de C1R o C1R. QA-1b células usando lo anterior describen ensayo ELISPOT de IFN-γ. La concentración final de cada péptido individual utilizado para el análisis de ELISPOT es 10 μg/mL. Un péptido es definido como el epitopo Qa-1 óptima si el péptido: 1) da constantemente similar o más fuerte respuesta de IFN-γ, en comparación con el original 15-mer péptido, en presencia de C1R. QA-1b células; 2) es entre 8 - 10-mer (9-mer péptido preferido) que son las longitudes de péptido a la MHC-I moléculas15,17. Ver Resultados de representante en la figura 5.

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    Resultados

    Diseño de una biblioteca de LPO que abarca toda la longitud de una proteína

    Empezando por el N-terminal de una proteína, cada péptido es 15 aminoácidos (15-mer). Por lo tanto, el primer péptido abarca posición 1 a la posición 15. El N-terminal del péptido segunda se superpone con el c-terminal del péptido primero por 11 aminoácidos. Por lo tanto, el segundo péptido abarca la posición 5 a la posición 19. Diseñar el resto de los pépt...

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    Discusión

    Aquí, hemos descrito un protocolo para el análisis Qa-1 epitopos en una proteína. En relación con este protocolo, varias otras estrategias también fueron divulgados previamente. Primero, trasplante allogeneic CD8+ líneas celulares T y clones fueron utilizados para la identificación del Qdm1. En segundo lugar, un motivo de Unión Qa-1 supuesto del análisis de Qdm fue utilizado para la identificación de la HSP60p216-224 y TCRBV8.1 del epítopo9,

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    Divulgaciones

    Autores no declaran ningún conflicto de interés.

    Agradecimientos

    Agradecemos a Penelope Garcia por su asistencia técnica y la preparación de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una beca de innovación de investigación (RIG) desde el Departamento de medicina en la Universidad de Loma Linda (681205-2967) y una donación de piloto de la National Multiple Sclerosis Society (PP1685) para XT.

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    Materiales

    Lista de materiales utilizados en este artículo
    NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
    La proteína a analizarN/AN/ALa secuencia de la proteína se puede obtener del NCBI
    Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichCat#: D2650 SIGMADMSO debe ser estéril y se debe analizar el cultivo celular.
    Ratones Kb-/-Db-/-The Lackson LaboratoryStock#: 019995Utilizamos ratones Taconic H2-KbH2-Db doube (Cat#: 4215-F y 4215-M) que, sin embargo, ya no están disponibles.
    Medio sin suero AIM V ThermoFisherScientificCat#: 12055091
    2-mercaptoetanolThermoFisher ScientificCat#: 21985023
    Aminoácidos no esencialesThermoFisher ScientificCat#: 11140076
    Dynabeads CD8 Kitde aislamiento positivoThermoFisher ScientificCat#: 11333D
    Bio-Gel P-100Bio-RadCat#: 150-4171
    Solución balanceada de fosfato (PBS)ThermoFisher ScientificCat#: 20012027
    pipeta TrasferGlobe ScientificMfg#: 137238
    Murine M-CSFPeproTechCat#: 315-02
    Placas de cultivo de tejidos de 48 pocillosEE. UU. #: CC7682-7548
    Placas de pocillos múltiples tratadas con TC de Corning Costar, 96 pocillos, fondo en forma de VSigma-AldrichCat#: Z372129 Sigma
    1ml de profundidad Placa de PP de 06 pocillos, estérilEE. UU.#: 1896-1110
    IL-2 murino recombinantePeproTechCat#: 212-12
    IL-7 murino recombinantePeproTechCat#L: 217-17
    Captura anti-IFN-γ anticuerpoBD BiosciencesCat#: 551881
    placa ELISPOTSigma-AldrichCat#: S2EM004M99
    C1RATCCCat#: ATCC CRL-1993
    C1R. Qa-1bHecho a medida (GenBank access#: NM_010398.3)
    Vector lentiviral Qa-1GeneCopoeiaProducto#: Mm02955
    Detección anti-IFN-&anticuerpo BD BiosciencesCat#: 551881
    Tween20Sigma-AldrichCat#: P9416
    Estreptavidina-HRPBD BiosciencesCat#: BD557630
    Sustrato AECBD BiosciencesCat#: 551951
    AnalizadorImmunoSpot ImmunoSpotCualquier analizador inmunoSpot
    Piruvato de sodio ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070 Gato científico de Artículo científico de debería funcionar para este propósito.

    Referencias

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