Desarrollo de ensayos para cuantificación de contenido alto de Sod1 mutante de la proteína total formación en células vivas

Resumen

Se describe un método para cuantificar la agregación de proteínas mal plegadas. Nuestros detalles del protocolo lentivirales inducida por generación de línea celular estable, proyección de imagen confocal automatizado y análisis de imágenes de agregados proteicos. Como una aplicación ilustrativa, se estudió el efecto de pequeñas moléculas en la promoción de la agregación de SOD1 en una forma dependiente de dosis y tiempo.

Resumen

Esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa fatal que puede ser causada por mutaciones heredadas en el gene codificación cobre-zinc superóxido dismutasa 1 (SOD1). La inestabilidad estructural del SOD1 y la detección de inclusiones de SOD1-positivo en pacientes de ALS familiar apoyan un posible papel causal de SOD1 mal plegadas o agregados en patología de ALS. En este estudio, describimos el desarrollo de un análisis celular diseñado para cuantificar la dinámica de agregación de SOD1 en células vivas por alto contenido métodos de detección. Uso de vectores lentivirales, generamos líneas estables de la célula expresando salvaje-tipo y del mutante SOD1 A4V etiquetadas con proteína fluorescente amarilla y encontró que ambas proteínas se expresaron en el citosol sin ningún signo de agregación. Curiosamente, sólo SOD1 A4V había expresado estable HEK-293, pero no en líneas celulares U2OS o SH-SY5Y, agregados al tratamiento del inhibidor de proteasoma. Nos muestran que es posible cuantificar la agregación basada en análisis de dosis respuesta de diferentes inhibidores de la proteasoma y seguimiento de la cinética de la formación de agregados por microscopia Time-lapse. Nuestro enfoque presenta la posibilidad de cuantificar el efecto de mutaciones de la ALS en el papel de SOD1 en la formación de agregados, así como la detección de pequeñas moléculas que impiden la agregación de SOD1 A4V.

Introducción

Agregación de proteínas es un proceso biológico por el cual mal grupo de proteínas para arriba y puede actuar como agentes causales de enfermedades neurodegenerativas (amiloidosis). Caracterización de la agregación de la proteína es esencial para entender el papel de los agregados en la disfunción celular, así como en facilitar el descubrimiento de nuevos factores que influyen en la aparición de la patología. La visualización de proteínas etiquetadas de fluorescencia en células vivas es un método eficaz que puede ayudar en el desarrollo de análisis aplicables al alto contenido de proyección (HCS)^1,2,3,4.

Esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es considerada como una enfermedad proteopathic causada por la presencia de proteínas mal plegadas con la propensión a agregado y se acumulan en las neuronas motoras en ALS familiar (fALS) y esporádicos ALS (sALS)^5,6 . Un subconjunto de ~ 20% de los casos de fALS se asocian con mutaciones dominantes en el gen que codifica la enzima citosólica antioxidante cobre-zinc superóxido dismutasa tipo 1 (SOD1)^7,8. Se han propuesto varias causas posibles para este trastorno genético derivado, incluyendo los cambios en la estructura y función de las variantes de la SOD1, como aberrante estabilidad, mayor tasa de despliegue y propensión a agregado^{9, 10}. En particular, la única propiedad comprobada y potencialmente tóxica compartidos por ambas variantes vinculada ALS SOD1 y wild-type (WT) SOD1 es una propensión creciente para formar agregados proteicos compartimentado o inclusiones proteínico^11,12 . Mal plegada mutante SOD1, es persistentemente polyubiquitinated y degradada por el sistema ubiquitina-proteasoma. Como resultado, un bajo nivel de inhibición del proteasoma actividad conduce a la acumulación del mutante que SOD1 agregados^13,14, que las estructuras de forma amorfa compuesta de componentes solubles que pueden intercambiar con soluble mutante SOD1 en el citosol¹⁵. En particular, SOD1 mutante A4V (alanina en el codón 4 cambiada a valina) es la mutación más común que causa la ALS y lleva a la neurodegeneración rápida con un tiempo promedio de supervivencia de menos de 2 años después del inicio de la enfermedad¹⁶. Bioquímico, SOD1 A4V tiene una tendencia creciente a monomerize, se agregan y forman poros de amiloides; sus poro-como los agregados son similares a los poros de amiloides de otras formas mutantes ligado a la enfermedad, como la α-sinucleína y β-amiloide proteína¹⁷. Para estudiar la dinámica de la acumulación de agregados de SOD1, métodos de control solubles e insolubles SOD1 agregadas formas permanecen para ser desarrollado.

Hemos demostrado anteriormente, usando proyección de imagen de células vivas y las células HEK-293 transfectadas transitoriamente con SOD1 de etiquetado proteína fluorescente, que mutaciones asociadas a ALS deterioran SOD1 dimerización y agregación¹¹. Aunque la expresión transitoria de sistemas pueden proporcionar información útil sobre el resultado biológico de sobreexpresión génica a corto plazo, métodos proporciona la integración estable de los genes deseados pueden ser preferidos para el desarrollo del ensayo. Como tal, vectores lentivirales ofrecen la posibilidad de conferir la expresión del gen regulado y a largo plazo en las células mamíferas ¹⁸. En este estudio, nos hemos centrado en la generación de líneas celulares estables de transduced con lentivirus recombinante teniendo peso y mutante SOD1 etiquetadas con proteína fluorescente amarilla (YFP). Usando microscopía de imágenes de células vivas y cuantificación automatizada de la agregación de SOD1, desencadenaron y cuantificar eventos de agregación de SOD1 en la inhibición del proteasoma.

Protocolo

1. producción de lentivirus

Nota: la producción y manipulación de vectores lentivirales se llevó a cabo según las pautas de los institutos nacionales de salud (NIH) para investigación con recombinante DNA. La codificación de plásmido el tipo salvaje y mutante SOD1 de A4V etiquetados YFP mejorada (SOD1WT-YFP y SOD1A4V-YFP) se describen en Kim et al. ¹¹ ambos productos de fusión genética fueron amplificados mediante el par de la cartilla PCR 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ y 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ y se insertan en la CMV de U3 pTRIP-delta plásmido ¹⁹ sitios de restricción XhoI y BsrGI. En experimentos anteriores, las células HEK-293T estuvieron partidas en una proporción de 1:4 hasta 1:6 cada dos días. Evitación de más de 20 pasajes y mantenimiento de las células al menos 60% confluency ayuda eficacias de transfección buena.

1. En día 1, dividir las células HEK-293T en 30-40% de confluencia en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro (3 x 10 ⁶ células/plato) en 10 mL de medio de cultivo celular (alta glucosa DMEM con 10% FBS y 4 mM L-glutamina) para la producción del virus.
2. Mantener el cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro de la placa en un incubador de CO ₂ (37 ° C, 5% CO ₂) durante la noche.
3. En día 2, preparar una solución de transfección de DNA que contiene 10 μg de vectores lentivirales (delta pTRIP U3 CMV - SOD1WT-YFP o - SOD1A4V-YFP) junto con el lentivirales embalaje () plásmidos (5 μg de pVSVg; 10 μg de pCMV-dR8.71) figura 2A) ²⁰. Añadir 125 μl de 1 M de CaCl ₂ y ajustar el volumen a 500 μl con agua destilada. Suavemente agregar 500 μl de 0,05 M HEPES en la mezcla e incubar 10 min a temperatura ambiente.
4. Reemplazar HEK-293T células medio precalentado medio fresco 10 mL cultura sin antibióticos mezclado con solución de transfección de DNA de 1 mL e incubar durante una noche a 37 ° C, 5% CO ₂.
5. El día 3, reemplazar la pila flotante con medio de cultivo fresco.
6. En día 4, recoger el sobrenadante en un tubo de 15 mL y centrifugar durante 5 min a 500 x g para eliminar las células muertas y desechos. Además purifican el sobrenadante haciéndola pasar por un filtro de 0.45 μm utilizando una jeringa grande de 60 mL. Dispensar en alícuotas de un solo uso (300 μL) y almacenar a-80 ° C. Para mantener el máximo producto actividad, evitar un ciclo de congelación-descongelación.

2. Lentivirales transducción

1. divide la línea de células infectadas en 60% de confluencia (las células HEK-293 y SH-SY5Y; 5 x 10 ⁵ células por pozo y U2OS; 1 x 10 ⁵ células por pocillo) en una placa de cultivo de tejidos bien 6 en 2 mL de medio DMEM suplementado con 10% FBS.
2. Mantener la placa de la pozo 6 cultivo de tejidos en una incubadora de 37 ° C en 5% CO ₂ durante la noche.
3. Quitar los lentivirus congelados del congelador de-80 ° C y descongelar una alícuota en el hielo antes de cada uso; no congele de nuevo.
4. Mientras que el virus es descongelar, calentar el medio de cultivo celular que contiene el suero compatible con la línea celular de interés. Una vez que el virus está completamente descongelado, preparar una gama de diluciones (1:3, 1:10, 1:30 y 1: 100) en DMEM en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL fresco.
5. Subir el volumen de los tubos a 1 mL con medios suero reducido.
6. Añadir 2 μl de polibreno (en una población de 4 μg/μl) a 1 mL de virus/medios de comunicación. Mezclar por pipeteo y añadir 1 mL de la mezcla a las células. Incubar las células con el virus para 24 h.
7. Eliminar el virus de medios y reemplazar con los medios normales de DMEM suplementados con 10% FBS. Mantener las células a 37 ° C, 5% CO ₂.
8. Vigilar el crecimiento de las células y cambiar los medios de cultivo cada dos días. En confluencia, ampliar el plato 6-bien en una placa de cultivo de tejidos de diámetro 10 cm.
9. Una vez que las células se han ampliado lo suficiente, ⁴ células de semilla 1.5 x 10 por pozo en 50 μl de medio DMEM en placas de 384 pocillos de ensayo para verificar el nivel de expresión de la YFP etiquetan proteína por microscopía. Si el YFP etiquetados como expresión de la proteína de la célula muestra una relación señal a ruido ≥ 3, preparar acciones celulares de la línea celular correspondiente.

3. Tiempo dependiente, efecto del inhibidor de la proteasoma de agregación de la proteína

Nota: realizar la adquisición de imágenes mediante un microscopio automatizado (ver materiales).

1. Añada 0.25 μl de inhibidor de DMSO o proteasoma disuelto en DMSO 100% (ALLN, 2 mM) en las placas de fondo plano de 384 pozos.
2. Manualmente semillas 1.5 x 10 ⁴ células por pocillo en 50 μl de DMEM medios en el mismo ensayo de placa. La concentración final de proteasoma inhibidor (hexagonal) debe ser de 10 μm.
3. Configurar la unidad de control ambiental del sistema de microscopio a 37 ° C y 5% CO ₂. Una captura de pantalla de la instalación experimental se muestra en la figura 3.
4. Operar el microscopio en modo de fluorescencia de campo, utilizando el software con la configuración siguiente: LWD 20 X objetivo, modo no confocal, 4 campos/pozo, con un intervalo de captura de una hora. Al final de cada carrera, las imágenes captadas se cargan automáticamente al servidor de.

4. Imágenes de lapso de tiempo para la expresión de YFP en las células vivas y análisis (solo canal) de imagen

Nota: los pasos siguientes describen el uso del software (por ejemplo, Colón).

1. Seleccione el correspondiente algoritmo para segmentar los objetos primarios (citosol y agregados). Si es necesario, ajustar los parámetros de umbral y el contraste de fondo ( figura 4).
2. Cuenta las células usando ' encontrar células ' con un umbral individual de 0.1 para el canal de intensidad YFP. Determinar agregados utilizando un ' encontrar manchas ' algoritmo con una relativa intensidad de mancha YFP > 0.2 y un coeficiente de separación de 1.0.

5. Efecto de la respuesta de inhibidores de la proteasoma en agregación de proteínas en células vivas teñidas por sus núcleos (dos canales) de la dosis

Nota: realizar la adquisición de imágenes mediante un microscopio automatizado. Determinar el rango de concentración de inhibidores de la proteasoma (ALLN, Epoxomicin y MG132) basado en el valor esperado de ₅₀ IC para asegurar un ajuste óptimo de la curva.

1. Preparar diluciones seriadas de los compuestos en un polipropileno de almacenamiento de 384 pocillos de la placa por el estándar serie de diluciones de 1:3. Asegúrese de mezclar las diluciones compuestas bien para asegurar que las concentraciones de compuestos son exactas.
2. Añada 0.25 μl de inhibidores de la proteasoma en placas de vacío fondo plano negro 384-bien ensayo. Utilizamos un líquido controlador equipado con un cabezal de 384-capilar capaces de transferir volúmenes.
3. Semilla de 1,5 x 10 ⁴ células por pocillo en 50 μl de medio DMEM en las placas de ensayo. Incubar las placas de ensayo a 37 ° C y 5% CO ₂ para 24 h.
4. Añadir 10 μl de medio DMEM (previamente calentado a 37 ° C) con la coloración de la solución (Hoechst 33342 a un stock de 10 mg/mL) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
5. Lanzamiento de los microsmanejar software de funcionamiento. Una captura de pantalla de la instalación experimental se muestra en la figura 6. Seleccione el " configuración " ficha y seleccione 20 X objetivo y el tipo de placa correcta. Asegurar " cuello " se establece en el valor correcto en el objetivo permitiendo el enfoque adecuado con tipos de placa distintos.
6. Seleccionar la " microscopio " ficha definir exposición 1 como YFP (laser de 488) y exposición 2 como Hoechst (laser 405). Activar el filtro en ambas exposiciones y asignar exposición 1 cámara 1 y 2 la exposición a la cámara 2. Establecer tiempos de exposición a ~ 800 m de exposición 1 y 40 ms de exposición 2.
7. Seleccionar la exposición 1. Ajustar altura de foco a 0 μm. Seleccione " enfoque ". Una vez centrado, exponer la cámara 1. Ajustar la altura del foco para optimizar el plano de exposición y haga clic en " tomar altura ". Cambiar los tiempos de exposición y poder darle una intensidad máxima del pixel de ~ 3.000 del laser. Guardar parámetros de exposición. Repetición de exposición 2.
8. Select " definición de experimento " ficha crear un diseño y sublayout. Arrastre y suelte la disposición pertinente, exposición, imagen de referencia, archivo skewcrop y sublayout. Salvar el experimento.
9. Select " experimento automático " ficha y adquisición de imágenes. Al final de cada carrera, las imágenes captadas se cargan automáticamente al servidor de.

6. Análisis de dos imágenes de canales de imagen

1. seleccionar el algoritmo de software para segmentos los objetos principales (núcleo, citosol y agregados) ( figura 7).
2. Seleccione el método que segmentos núcleos con precisión por la inspección visual de los objetos segmentados. Objetos teñidos de Hoechst en canal 1 (Ch1) se utilizará para determinar el número de células. La tinción de YFP del mutante SOD1-A4V en canal 2 (Ch2) se utilizará para determinar la cantidad de los agregados.
3. Cuenta las células mediante la ' encontrar núcleos ' algoritmo como regiones de tinción de Hoechst > 20 μm ², con un factor de división de 7.0, un umbral individual de 0.40 y un contraste > 0.10.
4. Crear la tabla de datos y determinar CE ₅₀ para cada uno de los compuestos utilizando el ' regresión no-lineal ' ecuación en el software de graficación.

Resultados

Línea de celular estable de generación mediante lentivirus: La estrategia general para el control de agregados de proteína SOD1 se ilustra en la figura 1. En un primer paso, hemos generado un vector de expresión lentivirales para la entrega de estable gene SOD1 en líneas celulares (paso 1). Dos vectores lentivirales codificación etiquetado YFP SOD1 WT y SOD1 A4V (SOD1WT-YFP y SOD1A4V-YFP, respectivamente) con embalaje y sobre plásmidos fueron...

Discusión

Hay dos enfoques principales para la generación de líneas celulares estables. La primera toma varias semanas y requiere transitoria selección de transfección y resistencia de los vectores de DNA de plásmido integrada genomic. El segundo lleva pocas horas mediante el uso de lentivirus, haciendo este protocolo favorable a la expresión efectiva de la proteína diana en múltiples líneas celulares con un esfuerzo limitado. El viaje-CMV vector¹⁹ era un vector constante a utilizar, con eficacia de transdu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ALLN (C20H37N3O4)	Millipore	208719
MG132 (C26H41N3O5)	Sigma-Aldrich	C2211
Epoxomicina (C 28H50N4O7)	Sigma-Aldrich	E3652
Hoechst 33342	Invitrogen	H-3570
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Opera EvoShell software	Perkin Elmer	Ver 1.8.1
Opereta	Perkin Elmer	OPRT1288
Software de imagen Harmony	Perkin Elmer	Ver 3.0.0
Columbus Software de análisis de imágenes	Perkin Elmer	Ver 2.3.2
CyBi Hummingwell de manipulación de líquidos	CyBio AG	OL 3387 3 0110