Un protocolo simple para la sobreexpresión y purificación de la cis- preniltransferasa humana optimizada con codones, en condiciones no desnaturalizantes, de Escherichia Coli , junto con un ensayo de actividad enzimática. Este protocolo puede generalizarse para la producción de otras proteínas de cis- preniltransferasa en cantidad y calidad adecuadas para estudios mecánicos.
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Artículo de método
Sobreexpresión y Purificación de Humanos Cis -preniltransferasa en Escherichia coli
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Resumen
Resumen
Las preniltransferasas (PT) son un grupo de enzimas que catalizan el alargamiento de la cadena del difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) a través de múltiples reacciones de condensación. El DHDDS (deshidrodolicil difosfato sintasa) es un cis- PT (que forma enlaces dobles cis de la reacción de condensación) eucariótico que cataliza el alargamiento de la cadena del difosfato de farnesilo (FPP, difosfato alílico) a través de múltiples condensaciones con isopentenil difosfato (IPP). DHDDS es de importancia biomédica, como una mutación no conservadora (K42E) en la enzima resulta en la retinitis pigmentosa , en última instancia, conduce a la ceguera. Por lo tanto, el presente protocolo se desarrolló con el fin de adquirir grandes cantidades de DHDDS purificado, adecuado para estudios mecánicos. En este caso, se utilizó el uso de fusión de proteínas, condiciones de cultivo optimizadas y optimización de codones para permitir la sobreexpresión y purificación de DHDDS humanos funcionalmente activos en cis -PT entre diferentes especies sugiere que este protocolo se puede aplicar para otros eucariotas cis- TP, así como los que participan en la síntesis de caucho natural.
Introducción
Las preniltransferasas son un grupo de enzimas que catalizan el alargamiento de la cadena del difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) a través de múltiples reacciones de condensación 1 , 2 . Enzimas de tipo Z catalizan la formación de dobles enlaces cis de la reacción de condensación, mientras que las enzimas de tipo E catalizan la formación de trans doble enlace 3. Las cis- priltransferasas (enzimas cis -PT, tipo Z) se clasifican clásicamente de acuerdo con la longitud de su cadena de productos en cadenas cortas (C 15<....
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Protocolo
1. Clonación de cis- TP para sobreexpresión en E. coli
- Obtener el vector de expresión pET-32b, diseñado para la clonación y de alto nivel de expresión de las secuencias de proteínas fusionadas con la proteína 109aa tiorredoxina (TRX) 17, y E. coli con codones optimizados 18 secuencia de longitud completa -PT cis codificación.
- Tener cuidado de tener un TEV-proteasa (tabaco proteasa del virus etch) sitio de escisión (ENLYFQ / G, donde "/" indica el punto de escisión) 9 seguido por un enlazador flexible corto (SGSGSG, para mejorar sitio de esc....
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Resultados
En la Figura 1 se muestra la descripción general del constructo utilizado y el proceso de purificación. Las muestras obtenidas en cada etapa de purificación se muestran en la Figura 2 . Este análisis de SDS-PAGE muestra la purificación por etapas de DHDDS, dando como resultado un producto altamente purificado. La Figura 3 muestra los resultados de la SEC analítica de la enzima purificada, revelando .......
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Discusión
El protocolo descrito aquí para la purificación de DHDDS humano funcional en células de E. coli es simple y eficiente, permitiendo una sobreexpresión y purificación de la proteína en 3 - 4 días una vez que se dispone de una construcción adecuada. Tales protocolos para la purificación de proteínas son de especial importancia dado los avances en la secuenciación del genoma, que proporcionó gran cantidad de información sobre la genética de muchas enfermedades [ 18] , lo que requiere el desa.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Centro para la Excelencia en Investigación de la Fundación Israelí de Ciencias (I-CORE) en Biología de las Células Estructurales (1775/12) y la Fundación Israel de Ciencia otorga 1721/16 y 2338/16 (YH), y 825/14 (DK ). El apoyo de la Fundación Fields Estate a DK es muy apreciado. Este trabajo fue realizado por Ilan Edri y Michal Goldenberg en el cumplimiento parcial de los requisitos de la tesis MD de la Facultad de Sackler de Medicina, Universidad de Tel Aviv.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competente E. coli (Alta eficiencia) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA | Roche | 11873580001 | |
| Resina de superflujo TALON | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 columna de desalinización | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 aumento 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pirofosfato | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesil pirofosfato | Sigma | 44270-10MG |
Referencias
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., K....
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Reimpresiones y permisos
