Method Article

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

DOI:

10.3791/56474

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November 15th, 2017

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1St. Jude Proteomics Facility, St. Jude Children's Research Hospital, 2Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 3Heilongjiang University of Chinese Medicine

In This Article

Summary

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Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Abstract

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Se han logrado muchos avances excepcionales en espectrometría de masas (MS)-basado en proteómica, con progreso técnico especial en cromatografía líquida (LC) acoplada a la espectrometría total en tándem (LC-MS/MS) y la capacidad de multiplexación etiquetado isobárico. Aquí, presentamos un protocolo perfilado profundo-proteómica que combina 10-plex etiqueta masa tándem (TMT) etiquetado con una amplia plataforma LC/LC-MS/MS y corrección de interferencias computacional MS post para cuantificar con precisión todo proteomas. Este protocolo incluye los siguientes pasos principales: extracción de proteínas y la digestión, etiquetado TMT, 2 dimensiones (2D) LC, espectrometría de masas de alta resolución y procesamiento computacional de datos. Medidas de control de calidad se incluyen para solucionar problemas y evaluar la variación experimental. Más de 10.000 proteínas en muestras de mamíferas pueden cuantificarse con confianza con este protocolo. Este protocolo se puede aplicar también a la cuantificación de modificación post traduccional con cambios menores. Este método multiplexado, robusto proporciona una poderosa herramienta para análisis proteómico en una variedad de muestras complejas, incluyendo cultivo de células, tejidos animales y especímenes clínicos humanos.

Introduction

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Avances en la tecnología de secuenciación de última generación han llevado a un nuevo panorama para el estudio de sistemas biológicos y enfermedad humana. Esto ha permitido un gran número de mediciones de genoma, transcriptoma, proteoma, metaboloma y otros sistemas moleculares a ser tangible. Espectrometría de masas (MS) es uno de los más sensibles métodos de química analítica y su aplicación en proteómica ha ampliado rápidamente después de la secuenciación del genoma humano. En el campo de la proteómica, los últimos años han producido importantes avances en los análisis cuantitativos basados en MS, incluyendo etiquetado isobárico y la multiplexación capacidad combina....

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Protocol

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PRECAUCIÓN: consulte todas las hojas de seguridad (es decir, MSDS) antes de uso. Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando se realiza este protocolo de.

Nota: se utiliza un conjunto de reactivos TMT 10-plex etiqueta isobárico en este protocolo para la cuantificación de proteoma de 10 muestras.

1. preparación de células/tejidos

Nota: es fundamental recoger las muestras en un tiempo mínimo a baja temperatura para mantener las proteínas en su estado biológico original.

  1. Células adherentes de lavado (por ejemplo, las células de HEK 293) en un....

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Results

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Utilizamos una mezcla de péptidos especie descrita para analizar sistemáticamente el efecto de la compresión de la relación en 3 pasos principales del Protocolo, incluyendo fraccionamiento pre-MS, MS ajustes y corrección de post-MS23. El fraccionamiento de pre-MS fue evaluado y optimizado mediante el uso de una combinación de pH básico TAGATOSA y pH ácido RPLC. Para el análisis de post-MS, se consideraron sólo los péptidos específicos. Utilizamos este modelo de int.......

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Discussion

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Se describe un protocolo de alto rendimiento para la cuantificación de proteínas con una estrategia etiquetado isobárico 10-plex, que se ha aplicado con éxito en varias publicaciones12,13,14,32 . En este protocolo, podemos analizar hasta 10 muestras diferentes de proteínas biológicas en el 1 experimento. Habitualmente podemos identificar y cuantificar proteínas más 10.000 con alta confianza. Au.......

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Los autores agradecen a todos los demás miembros laboratorio y centro de debate útil. Este trabajo fue parcialmente apoyado por H NI otorga ALSAC, R01GM114260, R01AG047928 y R01AG053987. Se realizó el análisis de MS en de St. Jude Children Research Hospital proteómica, parcialmente financiado por subvenciones de NIH centro apoyo P30CA021765. Los autores agradecen a Nisha Badders ayuda con editar el manuscrito.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sistema 1220 LCAgilentG4288B
50% HidroxilaminaThermo Scientific90115
AcetonitriloBurdick & JacksonAH015-4
Batidora de balaNext AdvanceBB24-AU
Butterfly Portfolio HeaterPhoenix S& TPST-BPH-20
C18puntas Harvard Aparato74-4607
Dithiothreitol (DTT)SigmaD5545
DMSOSigma41648
Ácido fórmicoSigma94318
Colector de fraccionesGilsonFC203B
Perlas de vidrioSiguiente AvanceGB05
HEPESSigmaH3375
Yodoacetamida (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
MetanolBurdick & JacksonAH230-4
Pierce BCA Kit de ensayo de proteínasThermo Scientific23225
Espectrómetrode masas Thermo ScientificQ Exactive HF
nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
ReproSil-Pur C18 resina, 1.9umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
Columnas Self PckNuevo objetivoPF360-75-15-N-5
Desoxicolato de sodioSigma30970
SpeedvaThermo ScientificSPD11V
TMT 10plex Reactivo de etiquetado isobáricoThermo Scientific90110
Ácido trifluoroacético (TFA)Applied Biosystems400003
tripsinaPromegaV511C
UreaSigmaU5378
Xbridge Columna C18columna Waters186003943
Ziptips C18MilliporeZTC18S096
SepPak 1cc 50mgWatersWAT054960

References

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  1. Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
  2. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14

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Deep Proteome ProfilingIsobaric LabelingLiquid ChromatographyMass SpectrometryTMT Labeling2D LCHigh Resolution Mass SpectrometryComputational Data ProcessingProtein QuantitationPost Translational Modifications

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