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Elektrophysiologische Bewertung der murinen Atria mit hochauflösenden optischen Mapping

Published: February 22, 2018 doi: 10.3791/56478
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Department of Bio-informational Pharmacology, Medical Research Institute, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Biofunctional Informatics, Tokyo Medical and Dental University
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die elektrophysiologische Bewertung der murinen Atrien mit Hilfe einer optischen Mapping-Systems mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, darunter zweite Aufnahmen der Membran Spannung und Ca2 + vorübergehend unter programmiert Stimulation durch eine spezielle Elektroden-Katheter.

Abstract

Den letzten genomweite Assoziationsstudien targeting Vorhofflimmern (AF) haben darauf hingewiesen, dass eine starke Assoziation zwischen dem Genotyp und elektrophysiologische Phänotyp in den Vorhöfen. Das ermutigt uns, nutzen Sie ein gentechnisch Mausmodell um den Mechanismus der AF zu erhellen. Es ist jedoch schwierig, die elektrophysiologischen Eigenschaften in murinen Vorhöfe aufgrund ihrer geringen Größe zu bewerten. Dieses Protokoll beschreibt die elektrophysiologische Bewertung der Vorhöfe mit einer optischen Mapping-System mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in murinen Herzen Langendorff durchblutet. Die optische Mapping-System setzt sich dual High-Speed-komplementäre Metalloxid-Halbleiter-Kameras mit hoher Vergrößerung objektive Objektive, um die Fluoreszenz der Spannung-empfindlichen Farbstoff und Ca2 + Kennzeichen zu erkennen. Um konzentrieren sich auf die Beurteilung der murinen Atrien, ist mit einer Fläche von 2 mm × 2 mm oder 10 mm x 10 mm, mit 100 × 100 Auflösung (20 µm/Pixel oder 100 µm/Pixel) und Sampling-Rate von bis zu 10 kHz (0,1 ms) bei maximaler optische Zuordnung durchgeführt. Eine 1-Französisch Größe vierpolige Elektrode pacing Katheter befindet sich in den rechten Vorhof durch die Vena Cava superior eine mechanische Beschädigung in den Vorhof zu vermeiden, und Tempo Stimulation wird durch den Katheter geliefert. Eine elektrophysiologische Untersuchung erfolgt mit programmierte Stimulation einschließlich konstanten Tempo, platzen, Tempo, und bis zu dreifache Extrastimuli Tempo. Die optische Abbildung aufgenommen unter eine spontane oder Tempo, Rhythmus der Dauer des Aktionspotentials, Aktivierung Karte Leitgeschwindigkeit und Ca2 + vorübergehend einzeln in der rechten und linken Herzvorhof. Darüber hinaus bestimmt die programmierte Stimulation auch die Inducibility atrialen Tachyarrhythmien. Präzise Aktivierung Zuordnung wird durchgeführt, um die Ausbreitung der Erregung im Vorhof während einer induzierten atrialen Tachykardien zu identifizieren. Optische Abbildung mit einer speziellen Einstellung ermöglicht eine gründliche elektrophysiologische Bewertung des Atriums in murinen pathologischen Modelle.

Introduction

Das Herz besteht aus 4 Kammern bei Säugetieren. Die oberen zwei Kammern sind Atrien und die unteren Herzkammern sind. Herzkammern arbeiten als Pumpe Blut in die systemische oder pulmonaler Kreislauf auswerfen. Atria Blut Rückkehr aus der systemischen oder pulmonalen Venen zu erhalten, und helfen beim Transport von Blut in die Ventrikel, eine effiziente kardiale Pumpfunktion zu erhalten. Von einer elektrophysiologischen Aspekt ist die wichtige Funktion der Vorhöfe, den Herzrhythmus zu regulieren. Die elektrischen Signale stammen aus der Sinusknoten befindet sich an der Kreuzung zwischen der Vena Cava superior (SVC) und rechten Vorhof (RA), dann verbreiten die RA und den linken Vorhof (LA) und führen um die Ventrikel durch die Atrioventricular-Knoten und His-Purkinje Wärmeleitung-System.

Behandlung von Herzrhythmusstörungen, die Herzrhythmusstörungen sind, werden in Vorhofflimmern und ventrikuläre entsprechend ihrer Herkunft klassifiziert. Vorhofflimmern (AF) ist die häufigste anhaltende Form eine Arrhythmie, zeichnet sich durch eine zufällige und schnelle Erregung der Vorhöfe. Neuere genetische Analysen und genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben die Verbindung zwischen AF und genetische Mutationen oder Monopolymorphisms1,2,3,4gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass AF zumindest teilweise eine genetische Ursache zugeordnet ist. Daher ist es wichtig, die Genotyp-Phänotyp-Interaktionen in die Vorhöfe mit einer gentechnisch Tiermodell zu bewerten. Es ist weithin anerkannt, dass die Maus die etabliertesten Säugetier für gentechnische Veränderung ist.

Die optische Mapping-Technik wurde entwickelt, um die Anregung von Herzgewebe zu bewerten. Allerdings ist die Beobachtung des murinen Atriums durch optische Zuordnung von seiner relativ geringen Größe behindert. Wir versuchen, eine detaillierte Bewertung der murinen Atrium mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu erreichen.

Protocol

Dieser Tierversuch wurde genehmigt und unter der Verordnung von der institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss von Tokio medizinischen und zahnmedizinischen Universität durchgeführt.

1. Vorbereitung

  1. Stammlösungen
    1. Lösen der Spannung-empfindlichen Farbstoffen (di-4-ANEPPS und RH237) und Ca2 + Indikator (Rhod 2 bin) mit 100 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), Stammlösungen mit Konzentrationen von 6 mM, 10 mM und 10 mM, bzw. zu machen.
    2. Auflösen der Erregung-Kontraktion (E-C) Entkuppler, Blebbistatin, mit 90 % DMSO, eine 50 mM-Stammlösung zu machen.
    3. Aliquoten Stammlösungen in einem 0,2 mL PCR Rohr in einem dunklen Raum, und ersetzen Sie die Luft in das Lager Rohr mit Stickstoffgas um Oxidation zu vermeiden.
    4. Wickeln Sie die Lager Rohre in Alu-Folie individuell für den Lichtschutz und bei-20 ° c lagern.
  2. Funktionierende Lösungen
    1. Bereiten Sie 1 L Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca2 + (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,0 mM Na2HPO4und 1,5 mM KH2PO4pH 7,40 durch NaOH eingestellt)
    2. Bereiten Sie 1 L Tyrode Lösung (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,53 mM MgCl2, 0,33 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-Glukose und 5,0 mM HEPES, pH 7,40 durch NaOH eingestellt).
    3. Tyrode Lösung mit einem 0,22 µm Flasche Top Filter filtern und durch Blase Belüftung über einen Ausströmerstein angeschlossen an eine Gasflasche O2 gut belüften.

2. optische Zuordnung in Langendorff durchblutet Herzen

  1. Montieren Sie die optische Mapping-System mit zwei komplementäre Metalloxid-Halbleiter (CMOS)-Kameras (Abb. 1aund b)
    1. Montieren Sie die CMOS-Kameras, Strahlteiler, Objektive, Objektiv-Revolver, Lichtquelle, dichroitischen spiegeln, Filter und andere Teile in der optischen Mapping-System wie in Figur 1a& bgezeigt.
    2. Wählen Sie die Vergrößerung durch das Objektiv in einem Turm, ausgestattet mit verschiedenen Vergrößerungen (1,6 X und 5 X) ändern.
      Hinweis: Die Größe des CMOS-Sensors ist 10 mm × 10 mm, mit einer Auflösung von 100 × 100, d. mit 5 X Objektiv h., bietet dieses System eine räumliche Auflösung von 20 µm.
    3. Legen Sie das Anregungslicht mit einer Leuchtdiode (LED) Lampe mit einer Wellenlänge von Zentrum von 530 nm, durchlaufen einen Bandpass-Filter (520/35 nm), und mit einem dichroitischen Spiegel reflektiert (560 nm).
    4. Aufzeichnen der Emission Signal geteilt durch einen Splitter (665 nm), in welcher Einstellung Kamera 1 mit einem langen pass Filter (697/75 nm) erkennt die Fluoreszenz, die mit einer Membran Spannung-empfindlichen Farbstoff (di 4-ANEPPS oder RH237) und Kamera 2 mit einem Bandpass-Filter (572/28 nm) erkennt die Signal von der Ca2 + Indikator (Rhod2-Uhr).
  2. Montieren Sie die Langendorff Perfusion Schaltung
    1. Befestigen Sie Polyvinylchlorid (PVC) Röhren an einer peristaltischen Pumpe.
    2. Legen Sie die Saugseite des PVC-Rohres in Tyrode Lösung mit 100 % O2 belüftet, wie in Schritt 1.2.3 beschrieben.
    3. Der Druckseite des PVC-Rohres an eine handgefertigte Luftfalle anschließen, dann ordnen Sie die 5 µm Filter, drei-Wege-Hähne, Druckaufnehmer, Heizung Glas Spule und abgestumpften 21-Gauge-Nadel (die Nadelstärke ist entsprechend der Aorta Größe veränderbar) gegenüber dem Vorquartal , mit anderen PVC-Rohre.
    4. Füllen Sie die Perfusion Schaltung mit Tyrode Lösung, die Vermeidung von Luftblasen in der Schaltung zu, und stoppen Sie den Fluss zu, bis das Herz mit der Schaltung verbunden ist.
  3. Heparinisierung und Anästhesie
    1. Spritzen Sie unfraktioniertem Heparin (200 IU, unabhängig vom Körpergewicht) intraperitoneal in eine Maus mit einem 25-Gauge-Nadel und Spritze 1 mL.
    2. Betäuben Sie die Maus durch eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (65mg/kg) 10 min nach der Injektion von Heparin.
  4. Kanülierung und Durchblutung
    1. Platzieren Sie den Mauszeiger in die Rückenlage. Bestätigen Sie die Tiere betäubt, durch mangelnde Reaktion bis zu den Zehen Prise. Öffnen Sie die Bauchdecke unter dem Xiphoid Prozeß-Niveau mit einer Schere. Machen eine Quereinschnitt im Zwerchfell, durchs Herz beidseitig der Rippen in der medialen Axillarlinie ohne Schäden und die vorderen Brustwand nach oben kippen. Gebogene Pinzette hinter dem Herzen voraus, und halten Sie die absteigende Aorta, Speiseröhre und minderwertige Vena Cava. Dann, Verbrauchsteuern Sie Herzen mit einer Schere schnell zusammen mit dem angrenzenden Gefäße und Gewebe, wie die Aorta, Lunge, Luftröhre, Speiseröhre, Fettgewebe und Thymus.
    2. Das Herz mit 10 mL eiskaltem PBS in einer Petrischale zu waschen, und das anliegende Gewebe zu entfernen.
    3. Stellen Sie die Spitze der abgestumpften 21-Gauge-Nadel in der Aorta ascendens an die Perfusion-Kreislauf angeschlossen, und befestigen Sie es mit Gewinde unter einem Stereomikroskop.
    4. Beginnen Sie, das Herz für 10 min mit Tyrode Lösung mit 100 % O2belüftet durchspülen.
    5. Überwachen Sie den Perfusionsdruck kontinuierlich mit der Drucksensor an der Verstärker und der Recorder angeschlossen.
    6. Halten Sie den Perfusionsdruck zwischen 80-100 MmHg (in der Regel 2-5 mL/min für den Durchfluss entsprechend) während der folgenden Schritte.
    7. Während der anfänglichen Perfusion (Schritt 2.4.4.) legen Sie die dünnen Polyethylen (PE)-Rohr (Außendurchmesser: 0,8 mm) in der SVC und befestigen Sie es mit einem Faden. Legen Sie dann das Herz in die vorgewärmte Glas-Kammer (Abbildung 1 b& c).
    8. Punktion eine innewohnende 24-Gauge-Nadel (Außendurchmesser: 0,7 mm) in der linken Herzkammer (LV) Aussparung durch die ventrikuläre Apex zu vermeiden Schäden in den Vorhof, und entfernen die innere Nadel verlassen die äußere Kanüle in das LV.
    9. Führen Sie einen 1-Französisch Größe benutzerdefinierte Elektrode Katheter durch das PE-Rohr in der SVC elektrischen Stimulation in der RA durchführen Bei Bedarf vorab des Katheters in den rechten Ventrikel (RV) für ventrikuläre Stimulation.
    10. Legen Sie eine Pin-Elektrode in ventrikuläre Apex kontinuierlich aufzeichnen der bipolaren Elektrokardiogramm (EKG) zwischen Pin Elektrode und Kanülierung Nadel in der Aorta ascendens (Abbildung 1 c).
    11. Überwachung des EKG und Perfusion Drucks während der gesamten Studie weiter.
    12. Schalten Sie das Licht, und führen Sie das folgende Experiment in einem dunklen Raum.
    13. Gehen Sie zu Schritt 2.5. für eine einzelne Aufnahme die Membrane Spannung oder 2.6. für eine doppelte Aufnahme der Membran Spannung und Ca2 + Transient.
  5. Für eine einzelne Aufnahme der Membran Spannung Färbung
    1. Wartung der Perfusion-Lösung bei dieser Färbung Protokoll für eine einzelne Aufnahme der Membran Spannung bei 37 ° c erwärmt.
    2. Verdünnen Sie 8.3 µL der Stammlösung di-4-ANEPPS (6 mM) mit 10 mL der Tyrode Lösung (die Endkonzentration ist 5 µM).
    3. Ziehen Sie das Gesamtvolumen (10 mL) der verdünnten Lösung di-4-ANEPPS in das Herz über die Perfusion Route für 2-5 min, gefolgt von einer Auswaschung mit Tyrode Lösung für 5 min.
    4. Verdünnen Sie 5 µL der Stammlösung Blebbistatin (50 mM) mit 1mL der Tyrode Lösung (die Endkonzentration beträgt 250 µM).
    5. Den Gesamtbetrag der verdünnte Blebbistatin-Lösung über die Perfusion Route zu verwalten.
    6. Überspringen Sie 2.6 Schritt und fahren Sie mit Schritt 2.7 für auswaschen.
  6. Für eine doppelte Aufzeichnung der Membran Spannung und Ca2 + Transient Färbung
    1. Die Tyrode-Lösung bei Zimmertemperatur aufbewahren.
      Hinweis: Diese anfängliche Einstellung der Temperatur ist anders als in der Färbung für eine einzelne Aufnahme der Membran Spannung (Schritt 2.5.).
    2. Verwalten Sie die Blebbistatin auf die gleiche Weise wie in den Schritten 2.5.4 und 2.5.5.
    3. Mix 3 µL der Stammlösung Rhod2AM (10 mM) und 30 µL Polyoxyethylen-Polyoxypropylene block Copolymer F-127 (20 % DMSO), dann die Mischung mit 10 mL der Tyrode Lösung verdünnen.
    4. Laden Sie den Gesamtbetrag der Rhod2AM Lösung (3 µM) über 2 bis 5 min über den gleichen Weg wie die Blebbistatin.
    5. Verdünnen Sie 7 µL der Stammlösung RH237 (10 mM) mit 10 mL der Tyrode Lösung.
    6. Verwalten den Gesamtbetrag der verdünnte RH237-Lösung (7 µM) über 2 bis 5 min.
    7. Beginnen Sie nach Abschluss des oben genannten Verfahrens, die Tyrode-Lösung bei 37 ° c zu erhitzen.
  7. Auswaschung
    1. Halten Sie die Temperatur der Tyrode Lösung bei 37 ° c in das folgende Experiment.
    2. Durchspülen Sie das Herz mit Tyrode Lösung für mindestens 5 min zum Auswaschen der übermäßigen Farbstoffe.
      Hinweis: Es gibt keine Notwendigkeit, die Durchflussmenge während dieser auswaschen Schritt zu erhöhen (siehe Schritt 2.4.6.)
    3. Bestätigen Sie das Verschwinden der jede Bewegung Artefakt aufgrund von Kontraktionen und die homogene Färbung im perfundierten Herzen.
  8. Probenahme und Datenanalyse
    1. Das Deckglas (25 mm × 60 mm) auf perfundierten Herzen sorgfältig, um das Vorhofflimmern Oberfläche ohne zu viel mechanische Beanspruchung zu glätten und verhindern Sie Bewegung Artefakt aus Schwingung der Lösung zu. Bestätigen Sie, dass entsprechend dem Deckglas Atrium beimisst.
    2. Aufzeichnen die Fluoreszenz von CMOS-Kameras mit einer Sampling rate bis zu 0,1 ms für di 4-ANEPPS und 1 ms für die RH237 und Rhod2AM Färbung.
    3. Analysieren Sie die erhaltenen Aufnahmen mit der Analyse-Software gemäß den Anweisungen des Herstellers für den eigentlichen Betrieb der Software.
    4. Erstellen Sie eine Aktivierung Karte und Film nach dem Extrahieren der Region von Interesse, Drift-Entfernung, zeitliche Filterung und 3 X 35binning.

(3) elektrophysiologische Untersuchung

  1. Einstellung des Schrittmachers Elektroden und stimulator
    1. Den Kontakt der maßgeschneiderte Tempo Elektrodenspitze in der RA für die Stimulation des Gewebes zu bestätigen (siehe Schritt 2.4.9.).
    2. Liefern Sie alle Tempo Reize aus der pacing Katheter mit der programmierbaren Stimulator verbunden.
  2. Bestimmung der Tempo-Schwelle
    1. Satz das Tempo Intervall zwischen 100 und 150 ms (Impulsbreite von 0,4 ms), Vermeidung von jedem inneren Rhythmus übertraf die Tempo Rate.
    2. Liefern Sie konstante Tempo Stimulierung für mindestens 20 Schläge, eine stabile atriale Stimulation zu erhalten.
    3. Das Tempo auf 5 Ausgabe eingestellt mV, dann allmählich reduzieren, bis der gelieferten Tempo schlägt fehl, das Atrium zu depolarisieren.
    4. Bestätigen Sie die atriale Anregung durch die Anwesenheit von P-Wellen im EKG und/oder ein Vorhofflimmern Erregersignal durch die optische Erfassung.
    5. Ermitteln Sie die minimale Stimulation Ausgabe, die in der Lage, das Atrium als Tempo-Schwellenwert zu depolarisieren.
    6. Setzen Sie den Tempo Ausgang für folgenden Studien an zweimal das Tempo Schwelle.
  3. Konstante und Burst Stimulation
    1. Liefern konstante Tempo für 99 Beats, mit einem Tempo Intervall ab 150 ms oder das längste Intervall, das vermeidet übertraf den inneren Rhythmus.
    2. Reduzieren Sie das Tempo Intervall schrittweise mit 5 ms-Schritten, bis zu 40 ms oder bis erreichen des Intervalls, das nicht 1:1 Aufnahme des Atriums zu erhalten.
  4. Einzelne Extrastimulus Tempo
    1. Soll die Tempo Zykluslänge von der grundlegende Antrieb (S1) 120 ms, 100 ms und 80 ms, wenn der innere Rhythmus übertrifft der grundlegende Antrieb oder das Tempo nicht 1:1 Vorhofflimmern Erregung zu erhalten.
    2. Legen Sie die Anzahl der Tempo Reize auf 10 Schläge für den grundlegenden Antriebsstrang.
    3. Legen Sie die erste Extrastimulus (S2) auf-10 ms für die grundlegende Zykluslänge.
    4. Liefern Sie S2 nach den letzten Tempo Reiz der grundlegende Antrieb.
    5. Verkürzen Sie die Kupplung Intervall von S2 nach und nach mit 5 ms-Schritten, bis die S2 versagt, das Atrium zu depolarisieren.
    6. Bestimmen Sie die effektiven Refraktärzeit (ERP) als das längste S2-Intervall, das nicht zu den Vorhof zu depolarisieren.
    7. ERP mit mindestens 3 verschiedene grundlegende Zykluslängen zur Frequenzadaptation des ERP-Bewertung zu bewerten.
  5. Doppel- und Dreibettzimmer Extrastimuli Tempo atriale Tachyarrhythmien induzieren
    1. Das S2-Intervall auf einen Punkt 20 ms außerhalb der ERP-S2 zurückgesetzt, wenn keine Rhythmusstörungen beobachtet werden.
    2. Fügen Sie eine zweite Extrastimulus (S3), beginnend mit der gleichen Intervall als S2.
    3. Verringern Sie die Kupplung Intervall zwischen S2 und S3 schrittweise mit 5 ms-Schritten, bis S3 nicht das Atrium zu depolarisieren.
    4. Das Intervall der S2 auf einen Punkt 10 ms außerhalb der ERP zurückgesetzt, dann wiederholen Sie Schritt 3.5.3.
    5. Die S2 und S3 Intervalle auf Punkte 20 ms außerhalb jedes ERP zurückgesetzt.
    6. Hinzufügen einer dritten Extrastimulus (S4), beginnend mit der gleichen Intervall als S3.
    7. Verringern Sie die Kupplung Intervall zwischen S3 und S4 schrittweise mit 5 ms-Schritten, bis S4 nicht das Atrium zu depolarisieren.
    8. Das S3-Intervall auf einen Punkt 10 ms außerhalb der ERP zurückgesetzt, dann wiederholen Sie Schritt 3.5.7.
    9. Die S2 und S3 Intervalle auf Punkte 10 ms außerhalb der ERP zurückgesetzt, dann wiederholen Sie Schritt 3.5.7.
    10. Definieren Sie die Inducibility atrialen Tachyarrhythmien durch die reproduzierbare Induktion mit entsprechend programmierten reizen.
  6. Bewertung der Inducibility der atrialen Tachyarrhythmien
    1. Kontinuierlich zeichnen Sie das EKG während alle Tempo-Protokolle (Schritt 3.3-3.5. auf).
    2. Führen Sie optische Aufnahmen, während und nach jeder Stimulation, die Induktion von atriale Tachykardie (AT) oder sich wiederholende Vorhofflimmern Antwort (RAR) aufnehmen.
    3. Bestätigen Sie die Reproduzierbarkeit, indem Sie das gleiche Tempo Protokoll anwenden, wenn AF oder ein RAR induziert wird.

Representative Results

Die optische Zuordnung Experimente werden durchgeführt mit den Geräten, wie in Figur 1adargestellt. Das Schema des optischen Systems ist in Abbildung 1 bdargestellt. Das System bietet eine hochauflösende Analyse des Membranpotentials und Ca2 + vorübergehend im Atrium.

Wie in Abbildung 1 c und ddargestellt, ist das isolierte Herz in einem temperierten Raum positioniert. Ein 1-Französisch Größe Elektrode Katheter befindet sich in der RA durch ein PE-Rohr in der SVC eingefügt, und ein weiteres innewohnende PE-Rohr wird in der LV-Hohlraum von der LV-Spitze zur Vermeidung übermäßigen Druck auf die Herzkammer eingefügt. Für eine gleichzeitige EKG-Aufzeichnung die Kathode (ECG Blei [-]) an die Kanülierung Nadel angeschlossen ist, und die Anode (ECG Blei [+]) ist verbunden mit der Pin-Elektrode in die ventrikuläre Spitze eingefügt. Die Funktion dieser Versammlung soll die Vorhöfe mechanische Beschädigungen zu vermeiden.

Für die Bewertung der Membran Spannung wird Fluoreszenz mit di-4-ANEPPS mit bis zu einer 10.000 Bilder/s Abtastrate (Abbildung 2) aufgezeichnet. Die Aktivierung der Karte ergibt sich bei konstant Tempo geliefert aus VA. Die Feinkartierung ermöglicht die Analyse des Musters detaillierte Wärmeleitung in kleinen murinen Atrien.

Abbildung 3 zeigt repräsentative Spuren der Membran Spannungen und Ca2 + Transienten in der LA mit RH237 und Rhod2AM bei konstant Tempo aus VA. Wir reduzieren die Sampling-Rate für die Zuordnung zu 1000 Bilder/s, eine ausreichende Signal-/Rauschverhältnis des Rhod2AM-Signals mit der derzeitigen Einstellung zu erhalten. Allerdings stellt das System eine ausreichende Qualität für Analyse der Beziehung zwischen dem Aktionspotential und Ca2 + Transienten.

Wir führen dann eine Induktion eine atriale Tachykardien mit programmierte Stimulation mit Mäusen unter einem pathologischen Zustand. Abbildung 4 zeigt eine optische Aufnahme von einer induzierten AT in einem murinen Atrium gebeizt mit di-4-ANEPPS. Die Maus erfährt eine transversale Aortenstenose Verengung Verfahren um eine Drucküberlastung auf das Atrium 10 Tage vor dem Experiment6anzuwenden. Wir induzieren AT durch dreifache Extrastimuli Tempo (120/100/100/80) und die Ausbreitung der reentrant Schaltung zu beobachten.

Figure 1
Abbildung 1: Optische Entschlüsselungssystem. a. Generalversammlung der Elektrophysiologie/optische Mapping-System. b. schematische Darstellung der Zusammensetzung des optischen Mapping-System: der blaue Pfeil zeigt das Anregungslicht durch die Lichtquelle erzeugt. Das Objektiv kann mit dem Turm ausgetauscht werden. Das emittierte Licht aus dem bunten Herzen wird zwischen Kamera 1 und 2 aufgeteilt. Kamera 1 erkennt die Langwellen-Signale für die Membran-Spannung und Kamera 2 nimmt die Wellenlängen mit einem Bandpassfilter von 580 ± 20 nm für die Ca2 + vorübergehend. Während des Verfahrens der EKG und Perfusion Druck werden kontinuierlich erfasst, und das EKG-Signal ist auch gleichzeitig die optische Karte recording-Software importiert. c. Vorbereitung der isolierten Herzen: die Herzen sind mit einer stumpfen Nadel über die Aorta ascendens Durchblutung kanülierte. Für gleichzeitige ECG Aufnahmen die Kathode an die Kanülierung Nadel angeschlossen ist, und die Anode mit der Pin-Elektrode wird in die ventrikuläre Spitze eingefügt. d. Kanülierung Rohr und die Elektroden: das Herz ist mit einer abgestumpften 21-Gauge-Nadel für Perfusion (Kanülierung Nadel) kanülierte. Eine 1-Französisch Größe Stimulation Elektrode (Elektrode) befindet sich im rechten Vorhof durch eine Polyethylen-Rohr in die überlegene Vena Cava eingefügt. Die Glas-Kammer wird durch erwärmte Wasser zirkuliert in den Hohlraum der Kammer bei 37 ° c erwärmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Aktivierung der Karte im Atrium. a. Vertreter Aktivierung Karten in der Ansicht von ventral mit 5 X Objektiv und b. in der hinteren Ansicht mit einem 1,6 X Objektiv. (Links Panel) Schematische Darstellung der isolierte Herz und Atrium. (Rechte Abbildung) Karte der Aktivierung des linken Vorhofs mit di-4-ANEPPS Färbung auf 10.000 Bilder/s erzielt. Die Aufnahme erfolgt unter konstanten Tempo mit der anregenden Elektrode platziert im rechten Vorhof. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Dual Aufnahme des Aktionspotentials und Ca2 + vorübergehend in den linken Vorhof. a. Schaltplan für das isolierte Herz. b. repräsentatives Bild von der Intensität der Fluoreszenz in den linken Vorhof mit RH237 für die Membrane Spannung (Vm) und Rhod2AM für die Ca2 + vorübergehend. Die Aufnahme erfolgt mit einer 5 X Objektiv bei 1.000 Bildern/s. c. Gleichzeitige Aufnahme von der EKG (oben), RH237 Signal (Mitte) und Rhod2AM Signal (unten), während konstante Tempo mit der Stimulationselektrode im rechten Vorhof. Die schwarzen Pfeile zeigen die Stimulation Spitzen und gelben Pfeilen die ventrikuläre Erregung. Eine leichte Streuwirkung aus dem Ventrikel kann auch (gelbe Pfeilspitzen) sowohl in der RH237 und Rhod2AM Signal beobachtet werden. d. eine zusammengeführte RH237 und Rhod2AM-Spur. Das Aktionspotential und vorübergehende Ca2 + Änderungen werden gleichzeitig erfasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Zuordnung der Aktivierung während atriale Tachykardie. (Links Panel) Schematische Darstellung der isolierte Herz. (Mitte Platte) Aktivierung der Karte während eine atriale Tachykardie (AT). AT war durch dreifache Extrastimuli Tempo induziert geliefert von den rechten Vorhof. (Rechte Abbildung) Aktivierung-Karte während Sinusrhythmus inmitten derselben Maus. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Film 1. Repräsentative Film des Membranpotentials im Atrium mit Färbung mit di-4-ANEPPS. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Film 2. Repräsentative Filme der Aktivierung Zuordnung während atriale Tachykardie und Sinus-Rhythmus. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Discussion

Optische Abbildung ist ein gut etabliertes Manöver für das Studium der kardialen Elektrophysiologie7und ist ein sehr nützliches Werkzeug, um nicht nur ventrikuläre Arrhythmien8,9, sondern auch Vorhofflimmern beurteilen10,11 . Gleichzeitige Zuordnung der transmembranen Potenzial und Ca2 + Transienten ist hilfreich für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen von Rhythmusstörungen bei Herzinsuffizienz und anderen Herzerkrankungen12,13. Vergleicht man die andere elektrophysiologische Bewertungsmethoden, wie z. B. die Verwendung einer einzelnen Zelle oder Zellen Blatt, einer der absoluten Vorteile der optischen Abbildung in der perfundierten Herzen ist die Bewertung des Musters Wärmeleitung im intakten Atrium und Ventrikel, nicht nur bei Sinusrhythmus, sondern auch während der induzierten Arrhythmien14. Versuch, murine Herzen, vor allem das Atrium als Surrogat des Menschen nutzen aufgetreten Schwierigkeiten vor allem aufgrund ihrer geringen Größe, aber die Maus ist ein attraktives experimentellen Modell im Hinblick auf die Beurteilung in einem gentechnisch veränderte Tier Modell, und dieses Problem überwunden werden müssen. Unser Ansatz bietet eine Richtung um es zu beheben.

Obwohl unser optische Zuordnung Apparat im Grunde ähnlich wie das konventionelle System für ganze murinen Herzen15war, hat unsere Methode den Vorteil der murine Atrium durch einige Änderungen an es zu bewerten. Zunächst verfolgten wir um eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung von bis zu 0,1 ms/Rahmen und 20 µm/Pixel und diese hochauflösende Abbildung dazu beigetragen, eine genauere Messung der Wärmeleitung Geschwindigkeit und Vermehrung Muster im murinen Atrium zu erhalten. Zweitens wird zur Vermeidung von unnötigen mechanischen Schäden oder Dehnung des Atriums, die elektrophysiologischen Eigenschaften 16,17verändern könnte, eine innewohnende Nadel direkt in das LV zur Druckreduzierung der Intra-Kammer eingefügt, statt durch die LA einzufügen, wie in der vorherigen Studie15. Darüber hinaus der Tempo Reiz wird durch eine Sondergröße gemacht 1-Französisch Elektrode Katheter platziert in der RA geliefert, aber nicht durch eine Nadelelektrode, die das Atrium verletzen könnte. Alle Pins werden bei der Festsetzung der atrial Appendage vermieden, die verwendet wurden in der letzten Studie15. Drittens ist ein programmierte Stimulation Protokoll atriale Tachyarrhythmien induzieren in Bezug auf die Bewertung des zugrunde liegenden Mechanismus der die Arrhythmien, entscheidende18,19. Wir führen identisch mit der programmierten Anregung elektrophysiologische Studien, einschließlich Burst Stimulation und bis zu dreifache Extrastimuli Tempo, mit einer Änderung des Schrittmachers Intervalls für die Maus-Herz. So konnte neben der Grundlinie Messparameter, das Protokoll Inducibility des AT bewerten. Im Bedarfsfall wird die Inducibility des AT mit der Verwaltung von Isoproterenol oder anderen Drogen bewertet. Nach unserer Erfahrung zeigen die Wildtyp Mäusen kaum irgendwelche ATs auch nach eine vollständige Stimulation-Protokoll. So sollten die Inducibility AT wichtige Informationen für die Bewertung des Beitrags von mehreren pathologischen Zuständen wie genetische Mutationen, chirurgische Eingriffe und die Gabe von Medikamenten11sein. Diese Änderungen konnten die genaue elektrophysiologische Bewertung im intakten murinen Atrium optimieren.

Diese Methode hat auch einige Einschränkungen. Erstens mit einer maximalen räumlichen Auflösung mit einer 5 X Objektiv, das Sichtfeld (FOV) beschränkt sich auf einen Teil des Atriums (zB. nur die linken atrial Anhängsel wie dargestellt in Abbildung 2a). Ein 1,6 X-Objektiv ist für den Erhalt der größeren FOV des Atriums, manchmal vorzuziehen (Abb. 2 b). Zweitens ist es ohne Befestigung des Atriums mit Stiften, manchmal schwierig die atriale Wärmeleitung Eigenschaften richtig messen da Vorhofflimmern Fläche gekrümmt ist. Also legten wir das Deckglas auf seiner Oberfläche zu glätten es statt der Festsetzung es durch Stifte. Diese Methode ist auch vorteilhaft für Bewegung Artefakt aus Schwingungen der Lösung zu verhindern. Drittens: mit unserer Methode, es ist ziemlich schwierig, die gesamte FOV, zu erhalten, die vordere und hintere Ansicht richtig zu verwenden ist also wichtiger in unserem Ansatz als in den anderen Ansatz wie in Abbildung 2dargestellt. Der Vorteil der anterioren Ansicht wäre die klare Beobachtung der Wiedereintritt bei pathologischen Zuständen, vor allem in die Anhängsel (Abbildung 4). Auf der anderen Seite die hintere Ansicht hat einen Vorteil erlangen eine gute Sicht auf das Vorhofflimmern hinteren Wand, und möglicherweise eine detaillierte Erfassung der Aktivität aus der myokardialen Hülse auslösen. Wenn es schwierig ist, eine entsprechende Ansicht zu erhalten und mit unserer Methode die gekrümmte Oberfläche glätten, kann das Atrium mit minimalen Spannung durch Stifte fixiert werden.

Mit unserer Methode gibt es 3 mögliche Probleme, mangelnde Färbung, Tempo und Arrhythmie Induktion. Für das Scheitern der Färbung, wenn keine oder leichte Fluoreszenz beobachtet, sollten Sie überprüfen, ob der optische Zuordnung Apparat richtig montiert ist, und ob das Reagenz entsprechend gespeichert und verwendet. Der Zustand der Perfusion Lösung ist auch entscheidend, das kann auch Auswirkungen auf die elektrophysiologischen Eigenschaften des Herzens selbst, also den Zustand der Lösung einschließlich den pH-Wert, Temperatur, und ob gab es genügend Belüftung muss streng überwacht werden. Es ist auch wichtig, eine Luft-Embolie im Herzen zu vermeiden. Für Tempo scheitern, wenn das Tempo Reize das Atrium begeistern können nicht überprüfen Forscher, ob die Verdrahtung korrekt mit einem Schaltkreis-Tester ist. Wenn das Tempo Reize richtig ausgegeben werden, ist das Problem der Kontakt der Elektrode mit dem Gewebe. Neupositionierung der Elektroden kann das Problem beheben, und unser Ansatz, mit dem Tempo Katheter erleichtert. Für Schwierigkeiten bei der Arrhythmie Induktion RV Tempo für die Induktion von einem AT in einigen wenigen Fällen einsetzbar. Verwenden einen vierpolige Elektrode Katheter, von dem die distalen zwei Elektroden und proximalen Elektroden in der RV und RA, bzw. gefunden werden können, ist es einfacher Wechsel des Schrittmachers Website von RA zu RV. Dieser Katheter ist auch nützlich für die ventrikuläre Erregung zu verlagern, wenn eine gleichzeitige ventrikuläre Aktivierungssignal das Vorhofflimmern Anregungssignal Masken.

Diese Methode trägt zur Beurteilung des Genotyp-Phänotyps-Interaktionen in der AF im Zusammenhang mit Gene neu durch die neuartige Studien wie GWAS, vor allem für die Gene mit denen die Untersuchung konnte nicht zeigen, durch andere Ansätze gefunden. Mit dem Fortschritt von Geräten und Techniken können der elektrophysiologischen Eigenschaften der Pulmonalvene Hülse, die die wichtige Quelle des AF20, in der intakten Herz mit diesem Ansatz bewertet werden.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit ist unterstützt das Programm zur Verbesserung der Forschungslandschaft für junge Forscher aus Sondermitteln Koordination für die Förderung von Wissenschaft und Technik (SCF) (zu T.S), Grants-in-Aid für wissenschaftliche Forschung (Nr. 16 K 09494, T.S, Nr. 26293052, zu T.F) aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) von Japan. Wir freuen uns über Brainvision und Herrn Kenji Tsubokura für die technische Unterstützung, und wir schätzen auch Mr. John Martin für seine sprachliche Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Blebbistatin SIGMA B0560-1MG E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping
RH237 Biotium 61018 Voltage-sensitive dye
Rhod2AM Biotium 50024 Ca indicator
Pluronic F-127 20% solution in DMSO Biotium #59000 To enhance the staining with Rhod2AM
Di-4-ANEPPS Wako 041-29111 Voltage-sensitive dye
Dimethyl sulfoxide Wako 046-21981 Solvent for reagents
Bottle top filter Corning 430513 For filtering Tyrode's solution
Haparin Sodium Mochida Pharmaceutical Co., Ltd N/A To avoid blood clots in the coronary artery
Air stone (φ8 mm x 10 mm) Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho N/A for aeration
Pentobarbital Kyoritsu Seiyaku Corporation N/A For an anesthesia
Programmable stimulator Fukuda Denshi BC-05 Fukuda Denshi kindly rented us.
Power Lab AD Instruments Powerlab 26/8SP To record blood pressure and electrocardiogram
Bio Amp AD Instruments ML132 Amprifier for electrocardiogram
BP Amp AD Instruments FE117 Amprifier for blood pressure
LabChart AD Instruments Version 7 Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram
Disposable BP transducer AD Instruments MLT0670 pressure transducer
1-Fr custom made electrode catheter Unique Medical N/A To pace right atrium
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) Natume Seisakujo SP31 Put into superior vena cava to introduce electrode catheter
Millex-SV 5.00 μm Merk Millipore SLSV025LS To filter the circulating Tyrode
24-gauge indwelling needle TERUMO SR-FS2419 Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber
21-gauge needle TERUMO SN-2170 We cut the tip of needle and blunted it by filing
25-guage needle TERUMO NN-2525R
1-ml syringe TERUMO SS-01T
PVC tube TERUMO SF-ET0525 for Langendorff's perfusion circuit
Three-way stopcock TERUMO TS-TL2K for Langendorff's perfusion circuit
Petri dish As one 3-1491-01
Custum made heating glass coil Motohashi Rika N/A to keep temperature of perfusion solution
Custum made warming glass chamber Motohashi Rika N/A to keep temperature of perfusion solution
Constant temperature circulating device Lauda E100 connected to heating coil and warming chamber
Cover glass (25 mm × 60 mm) Matsunami C025601 Put on the atria to flatten the recording area
Perista pump ATTO SJ-1211 peristaltic pump
Stemi DV4 Carl Zeiss N/A Stereomicroscope
MiCAM ULTIMA-L2 Brainvision Inc. UL-L2 Optical mapping System
BV_Ana Software Brainvision Inc. BV_Ana Data Analysis Software
THT Macroscope Brainvision Inc. THT-ZS Epi-Illumination Unit
LED Light Source Brainvision Inc. LEX2-G
Dichroic Mirror 560nm Brainvision Inc. DM560 Epi-Illuminatinon
Excitation Filter 520/35nm Semrock, Inc. FF01-520/35-25
Projection lens Plan S 1.0X Carl Zeiss 435200-0000-000
Focus Drive Carl Zeiss 435400-0000-000
Objective lens Revolver Carl Zeiss 435302-0000-000
Manual Focus Column Carl Zeiss 435400-0000-000
Macroscope Base Carl Zeiss 435430-9901-000
Straight Light Guide MORITEX Corporation MSG10-2200S Epi-Illuminatinon
Condenser Lens MORITEX Corporation ML-50
PLANAPO 5.0X Leica Microsystems 10447243 Objective Lens
PLANAPO 1.0X Leica Microsystems 10447157 Objective Lens
PLANAPO 1.6X Leica Microsystems 10447050 Objective Lens
Beam-Splitter Brainvision Inc. FLSP-2
Dichroic Mirror 665nm Brainvision Inc. DM665 Beam-Splitter
Emission Filter 572/28nm Edmund Optics #84-100 Rhod2-AM
Emission Filter 697/75nm Semrock, Inc. FF01-697/75-25 RH237 and Di-4-ANEPPS
0.2 mL PCR tube Greiner Bio-One 671201
aluminum foil Toyo alumi 0020

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References

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Elektrophysiologische Bewertung der murinen Atria mit hochauflösenden optischen Mapping
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Ihara, K., Sugiyama, K., Takahashi, K., Yamazoe, M., Sasano, T., Furukawa, T. Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping. J. Vis. Exp. (132), e56478, doi:10.3791/56478 (2018).

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