Dispositivos microestructurados para microinyección optimizado y la proyección de imagen de larvas de pez cebra

Summary

Microinyección de embriones de pez cebra y larvas es una técnica difícil pero crucial en muchos modelos de pez cebra. Aquí, presentamos una gama de herramientas de microescala para ayudar en la estabilización y la orientación del pez cebra para la microinyección y la proyección de imagen.

Abstract

Pez cebra han emergido como un poderoso modelo de varias enfermedades humanas y una herramienta útil para una gama cada vez mayor de estudios experimentales, que abarca la biología del desarrollo fundamental a través de las pantallas genéticas y químicas a gran escala. Sin embargo, muchos experimentos, especialmente los relacionados con infección y modelos de xenoinjerto, dependen de la microinyección y la proyección de imagen de los embriones y larvas, que son técnicas laboriosas que requieren habilidades y conocimientos. Para mejorar la precisión y el rendimiento de las técnicas de microinyección actuales, hemos desarrollado una serie de dispositivos microestructuradas para orientar y estabilizar embriones de pez cebra en 2 días post fertilización (dpf) en posición ventral, dorsal o lateral antes del procedimiento. Para ayudar en la proyección de imagen de los embriones, también hemos diseñado un dispositivo simple con los canales que Oriente 4 pez cebra lateralmente en paralelo contra un cubreobjetos de vidrio. Juntos, las herramientas que presentamos aquí demuestran la efectividad de enfoques photolithographic generar dispositivos útiles para la optimización de las técnicas de pez cebra.

Introduction

Pez cebra se han convertido en un poderoso modelo para muchos campos, de los estudios de desarrollo biología fundamental a escala genética y química pantallas^1,2. Rutina manipulaciones genéticas, como la sobreexpresión del gen, caída, CRISPR/Cas9 mutagénesis y transgénesis dependen de microinyección de material genético en el zigoto unicelular, que ha llevado al desarrollo de simple, fácil de usar, comercialmente herramientas disponibles para orientar y estabilizar huevos para inyección³. Otros enfoques, como el trasplante y la infección, a menudo requieren microinyección en la posterio....

Protocol

Microinyección de larvas fue aprobado por la Subcomisión de Hospital General de Massachusetts en investigación Animal cuidado bajo protocolo 2011N000127.

1. fabricación de dispositivo

Nota: Todos asistida por ordenador (CAD) archivos para diseñar máscaras de fotolitografía aquí descritos (figura 1) están disponibles para su descarga. Véase tabla de materiales para los enlaces.

1. Fabricación de la oblea del molde principal en una sala limpia de clase 1.000 utilizando técnicas photolithographic estándar⁷. De los canales y arreglos de discos de microestru....

Results

El enfoque descrito aquí muestra el diseño (figura 1) y la fabricación de dispositivos para el uso con 2 pez cebra de la PD, utilizando técnicas de (figura 3) litografía suave y photolithographic (figura 2). Este método permite la prueba rápida de muchas iteraciones de diseño y las modificaciones y alteraciones y optimización de dimensiones microestructura para uso con el pez cebra en otras etapas de.......

Discussion

Aquí, describimos el uso de los dispositivos recientemente desarrollado para facilitar 2 PD pez cebra microinyección⁵e introducir un dispositivo de montaje libre de agarosa simple imagen conveniente de embriones. Estas herramientas destacan la utilidad de técnicas photolithographic para la fabricación de dispositivos útiles para técnicas de pez cebra.

Hemos encontrado dispositivos MSA particularmente útil para la inyección de células o partículas tienden a la agregación.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhsives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Para la fundición de los dispositivos. El kit incluye monómero PDMS e iniciador
Agarosa de baja temperatura de gelificación	Sigma Aldrich	A9414-10G	Para la fundición de dispositivos de agarosa
PFDTS silano	Sigma Aldrich	448931-10G	Para la fundición de moldes PDMS negativos
Tricaína (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-10G	Para anestesiar pez cebra
Rodamina Dextrano 70.000 Da	ThermoFisher	D1818	Para rastrear microinyecciones
Leucotrieno B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	Quimioatrayente de neutrófilos
N-Forilmetionina-leucil-fenilalanina (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	Quimioatrayente de neutrófilos
15 cm Placa de Petri	Fisher scientific	08-757-148	Para fundición de la oblea maestra
Placas de 6 pocillos con fondo de vidrio	MatTek	P06G-0-20-F	Para dispositivos de imagen
Microcapilares de vidrio de borosilicato	World Scientific Instruments	TW-100-4	Para agujas de microinyección
Pipetas de transferencia	Sigma Aldrich	Z350796	Para la transferencia de embriones de pez cebra Puntas
microcargador	Fisher Scientific	E5242956003	Para cargar las agujas de microinyección
Punzón Harris Uni-Core de 1,5 mm	Ted Pella Inc.	15111-15	Para perforar puertos en dispositivos de imagen PDMS
Nº 11 Bisturí	Herramientas de Ciencia Fina	10011-00	Para cortar PDMS
Dumont Nº 5 Pinzas	Herramientas de Ciencia Fina	11252-10	Para la descorionación de embriones y la rotura de puntas de aguja de microinyección
Marzhauser Micromanipulador	ASI	MM33-R	Para la manipulación de aguja de microinyección
Soporte	magnéticoMSC	SPI - 87242624	Para el montaje del micromanipulador
MPPI-3 Controlador Picopump	ASI	MPPI-3	Para controlar el volumen y la temporización de la microinyección
Microscopio fluorescente invertido EVOS	ThermoFisher	EVOS FL	Para obtener imágenes de embriones inyectados Microscopio
de disección	Nikon	SMZ745	Para la visualización de la microinyección
AutoCAD Software	Autodesk		Descargue archivos de AutoCAD desde: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 y en la página wiki de protocolos de la comunidad ZFIN: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki