Divulgamos un método quirúrgico para administrar medicamentos al oído interno de un primate no humano, el tití común (Callithrix jacchus), a través de la membrana de ventana redonda.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Un procedimiento quirúrgico para la administración de medicamentos para el oído interno en una no humanos primates común tití (Callithrix jacchus)
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Investigación de la audiencia se larga ha facilitado por modelos de roedores, aunque en algunas enfermedades, no pueden ser recapitulados síntomas humanos. El tití común (Callithrix jacchus) es un mono de nuevo mundo pequeño, fácil de manejar, que tiene una anatomía similar del hueso temporal, incluyendo las cadenas de huesecillos del oído medio y oído interno a los seres humanos, que en comparación con la de roedores. Aquí, Divulgamos un abordaje racional, seguro y reproducible para el nicho de la ventana redonda coclear para la entrega de medicamentos para el oído interno del tití común. Adoptamos la timpanotomía posterior, un procedimiento usado clínicamente en cirugía humana, para evitar la manipulación de la membrana timpánica que puede causar pérdida de oído conductor. Este procedimiento quirúrgico no condujo a cualquier pérdida de audición significativa. Este enfoque fue posible debido a la estructura de la gran bulla del tití común, aunque deben considerarse cuidadosamente el canal semicircular lateral y la parte vertical del nervio facial. Este método quirúrgico nos permite realizar la administración segura y precisa de drogas sin pérdida de la audición, que es de gran importancia en la obtención de prueba de concepto para la investigación traslacional pre clínico.
Introducción
Pérdida de oído sensorineural (SNHL) se presenta predominante del daño o deficiencia en la cóclea. Causas comunes de SNHL incluyen envejecimiento (p. ej. presbiacusia), defectos genéticos, exposición a ruidos fuertes, infección y medicamentos ototóxicos1. La Organización Mundial de la salud (OMS) estima que más 360 millones de personas, que representan 5.3% de la población mundial, sufren pérdida2de la audiencia. También se estima que 1 de 900 a 1 en 2.500 recién nacidos se han moderado, severo y pérdida de oído permanente congénita profunda y aproximadamente uno de cada tres adultos mayores de 65 años tienen algún grado de pérdida auditiva3. Sin embargo, no existe ningún tratamiento clínico eficaz de pérdida de la audición para estos pacientes.
Investigación de audiencia durante mucho tiempo se ha realizado con roedores o modelos de conejillo de Indias, y muchos enfoques, tales como la terapia génica y terapia regenerativa, se han sugerido como un tratamiento para la pérdida de la audición. Sin embargo, hay una gran diferencia entre los seres humanos y roedores en términos del sistema auditivo, y es muy difícil de traducir modelos animales a aplicaciones humanas. El tití común (Callithrixjacchus C.), un mono de nuevo mundo originario de la Amazonia, se ha convertido en un modelo de primates no humanos atractivos para diversos estudios de investigación básica por varias razones. En primer lugar, su anatomía y la fisiología son más similares a los de los seres humanos en lugar de roedores. En segundo lugar, la información biológica básica sobre esta especie, incluyendo enfermedades, redes neuronales, la conducta y el genoma, se caracteriza bien. Procesamiento auditivo y vocal, la codificación cortical de periodicidad, la representación de la echada y las interacciones auditivo vocal de titíes comunes también han sido reportados4,5,6,7 , 8 , 9 , 10. en estudios histológicos recientes, los investigadores identificaron patrones de expresión distintivo de 20 genes de sordera y cambiadores de anión en la cóclea de lo tití común y encontró que cinco genes que son causantes de sordera progresiva y tres intercambiadores de aniones, tenían patrones de expresión diferentes a las de roedores11,12. Estos perfiles nos llevan a creer que el tití común es una potente herramienta para la investigación de audiencia.
Los atributos más marcados de lo tití común como un animal experimental son los siguientes:
- Fácil manejo con un tamaño de cuerpo pequeño en comparación con algunas especies de monos del mundo: titís adultos pesan 300-400 g y son aproximadamente 60 cm de altura, que es similar a las ratas.
- Altamente reproductiva primates: monos tití alcanzan la madurez sexual a una edad de 18 meses y son capaces de soportar dos veces al año y producir 4 a 6 crías anualmente.
- Modificaciones genéticas están disponibles: Sasaki E et al. logrado crear13 de transgénicos y knock-out14 primates tití mediante modificaciones genéticas implicadas en trastornos neurológicos (por ejemplo, Parkinson de la enfermedad y la enfermedad de Alzheimer).
- Las células madre embrionarias (ES) y pluripotentes inducidas (iPS) células han sido establecidos15,16. Aunque es bastante difícil mantener el mismo número de titíes en comparación con roedores, la disponibilidad de células madre o células iPS proporciona pruebas en vitro que reducirán el número de en vivo ensayos requeridos.
Para facilitar mejor la investigación traslacional en el campo de la sordera y su tratamiento potencial, hemos establecido un protocolo de estudio por imágenes con CT y MRI, anestesia general y pruebas de audición con respuestas auditivas de tallo cerebral (ABR). Estos sistemas experimentales pueden darnos mejores oportunidades para obtener prueba preclínica de los estudios de concepto que son esenciales para tender un puente sobre los boquetes entre los roedores estudios y ensayos clínicos. Aquí, Divulgamos un método quirúrgico para administrar medicamentos al oído interno de lo tití común a través de la membrana de ventana redonda. Para obtener una visión clara alrededor de la ventana redonda, sin manipular la membrana timpánica que puede causar una pérdida de oído conductor, es útil para enfoque de la cavidad mastoide. Clínico, este enfoque, denominado "tympanotomy posterior" está bien establecido y utilizado generalmente para el implante coclear, cirugía de colesteatoma. Creemos que tympanotomy posterior nos permite realizar la administración exacta de drogas sin la inducción de pérdida de la audición.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos experimentales se realizaron en la Universidad de Jikei, Tokio Japón. Manejo de animales y procedimientos experimentales fueron aprobados por la atención institucional del Animal y uso de la Universidad de Jikei (aprobación no: 26-060) y realizado de acuerdo con las directrices institucionales para el uso de animales de laboratorio en el Jikei Universidad, que de acuerdo con las directrices para la correcta conducta de Animal experimentos por el Consejo de ciencia de Japón (2006). Cuidado de los animales se realizó según las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Instituto de laboratorio de recursos animales, 1996).
1. preoperatorio examen
- Tener una exploración de tomografía computarizada (TC) craneal de animales (monos tití común) para facilitar la identificación de estructuras anatómicas individuales por lo menos un mes antes de la cirugía.
- Llevar a cabo una prueba audiométrica de al menos un mes antes de la cirugía.
Nota: Aquí, se utilizó el ABR para evaluar el estado de la audiencia. Brevemente, un electrodo positivo por vía subcutánea fue colocado en el vértice y un electrodo negativo de referencia en la base dorsal del oído estimulado. El electrodo de tierra se colocó por vía subcutánea en la parte dorsal del cuello. 17 , 18 abr fueron evocado con tono burst (ráfaga de 1,0 ms tono duración con subida de 0,1 ms y tiempo de caída). El nivel de sonido se redujo luego en pasos de 10 dB de su máxima amplitud. En cada nivel de sonido, 512 respuestas fueron hechas un promedio (con la polaridad del estímulo alternada). ABR umbral se define como el nivel de presión sonora (SPL) en que podía detectarse cualquier onda.
2. anestesia
- Animales rápidos de la noche antes de la cirugía bajo anestesia general.
- Administrar 4% de isoflurano y aire ambiental a 5-6 mL/min con la ventilación de la mascarilla a la cara o en una cámara de inducción para la inducción lenta (figura 1A). Confirmar que el animal no responde a estímulos dolorosos, como el pinchazo del dedo del pie.
- Anesthestize titíes comunes con la inyección intramuscular (en el músculo femoral) de una combinación de medetomidina (0,04 mg/kg), midazolam (0,4 mg/kg) y butorfanol (0,4 mg/kg).
- Inyecte ampicilina (0.08 mg/g) por vía subcutánea 30 minutos o más antes de la incisión en la piel como un antibiótico preoperatorio.
- Coloque el tití en la posición supina con la cabeza hacia la parte superior y extiende la cabeza y el cuello. Fijar el maxilar a la mesa con un hilo de nylon y tire de la lengüeta para obtener una buena vista o utilizar un laringoscopio para visualizar la epiglotis y la entrada de la laringe como alternativa (figura 1B).
- Inserte un tubo endotraqueal a lo largo de la superficie laríngea de la epiglotis.
Nota: Es posible utilizar un catéter intravenoso calibre 16 o 6-francés medidor de sonda de alimentación, como un tubo endotraqueal (figura 1). - Compruebe el EtCO2 del tubo endotraqueal para confirmar que ha sido bien colocada en la tráquea. Después de que el tubo ha sido colocado y comprobado movimiento de gas respiratorio, fijar el tubo endotraqueal al rostro de Tití con cinta.
- Mantener anestesia entre 1-3% isoflurano durante la operación.
- Monitorizar la SpO2, EtCO2, temperatura corporal y rectal de la temperatura durante las operaciones. Realizar todos los procedimientos en una esterilla para evitar una reducción en la temperatura corporal.
3. preoperatoria preparación
- Preparar el tití en una posición supina e inclina la cabeza a un ángulo de 30-45 grados hacia el lado no-quirúrgico (figura 2A).
- Afeite la región poste-auricular de la parte dispositiva.
- Desinfectar la zona quirúrgica con alcohol y povidona yodo, tanto en la región poste-auricular y conducto auditivo externo.
- Coloque una lámina de paño quirúrgico con un agujero redondo en el tití (figura 2B).
4. cirugías
- Inyectar el 1% de clorhidrato de lidocaína (con epinefrina 1: 100.000, 0.1-0.2 mL) por vía subcutánea en el sitio de la incisión de la piel. Hacer una incisión en la piel postauricular con hoja No.15 de forma redonda.
- Hemostasia, aplique presión sobre la zona sangrante con una gasa empapada en 1:5,000 diluidos epinefrina. Cauterización bipolar también es eficaz (figura 2).
- Abrir el tejido blando de la región poste-auricular así cartílago auricular (c) y músculo auricular posterior (m) puede ser reconocido. Exponer el hueso del canal auditivo externo que debe ser visible en el cartílago (Figura 3A).
- Para confirmar la profundidad de la membrana timpánica, exponer la parte huesuda de la llanta timpánica que puede ser reconocida como la adherencia de la piel y hueso en la parte más profunda del conducto auditivo posterior.
Nota: Este paso nos permite reconocer la profundidad de la parte lateral de la cavidad del oído medio es (Figura 3A). - Pelar los músculos poste-auriculares (músculo esternocleidomastoideo músculo splenius de la cabeza y vientre posterior del músculo digástrico) hacia lo caudal, separado del hueso temporal. Luego exponer la superficie lateral del hueso temporal (asterisco en la figura 3B).
- Hacer un agujero de aproximadamente 5 mm detrás de canal auditivo externo con un bur. de diamante de 1,0 mm (figura 3). Utilice una velocidad de taladro de 1.000 8.000 rpm dependiendo del sitio de perforación.
Nota: Una velocidad lenta es adecuada para la delicada manipulación cerca el canal semicircular o nervio facial. Goteo de la solución salina en lugar adecuadamente para evitar la lesión térmica de perforación. - Agrande el orificio de perforación y confirme la posición del canal semicircular horizontal (HSC), que protruye hacia la cavidad mastoide (figura 3D).
- Confirme la posición del nervio facial cuya parte vertical corre anterior de HSC. Taladro y quite todos los tabiques de hueso, si existen, para obtener una visión clara de la hendidura facial, que se encuentra en el centro del área triangular entre el nervio facial y tympani del chorda.
- Hacer un pequeño agujero de perforación entre la parte vertical del nervio facial y la timpánica borde (asterisco en la Figura 4A) con una fresa de diamante de diámetro de 0,6 mm a 1.000 rpm.
- Mueva la fresa paralela a la pared posterior del canal para evitar daños en el nervio facial, que puede ser visto como una línea de color rosa a través del hueso enrarecido. Detener la perforación inmediatamente antes de que el nervio se expone como una estructura de línea blanca (Figura 4B).
- Asegúrese de que el nicho de la ventana redonda puede visualizarse a través del orificio (figura 4). Entonces, administrar medicamentos dentro del nicho con una aguja de calibre 25 o más delgada. Para conservar los medicamentos en el nicho de la ventana redonda, lugar de una solución viscosa en el nicho (figura 4).
- Después de confirmar que hemostasia esté controlado, cerca de las capas (capa epidérmica y capa cutánea) con sutura interrumpida simple con hilos absorbentes 6-0.
- Fijar gasa sobre la herida quirúrgica y colocar un vendaje.
5. posoperatorio cuidado
- Administrar clorhidrato de atipamezole (0,15 mg/kg) por vía intramuscular en el músculo femoral para antagonizar la medetomidina.
- Cuando se inicia la respiración espontánea, retire el tubo endotraqueal.
- Mantener el tití común en unidad de cuidados intensivos en el 30% O2, 29 ° c hasta que la anestesia pase para completar la excitación.
- Confirmar que hay no hay hallazgos sugestivos de disfunción vestibular como nistagmo y devolver el animal a la jaula de cría.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Timpanotomía posterior se realizó sin ninguna complicación como infección del sitio quirúrgico, sangrado con lesión vascular o disfunción vestibular, que a veces se produce con la manipulación del oído medio. Realizamos tympanotomy posterior en la oreja derecha del tití común de 7 años y había administrado 1 μl de tampón fosfato salino para el nicho de la ventana redonda. Abr se midieron antes y dos meses después de la cirugía (figura 5A-B). ...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El volumen del flujo sanguíneo coclear es extremadamente pequeño, estima que en el orden de 1/1.000.000 de la salida cardíaca total en los seres humanos, y el acceso es limitado por la presencia de la barrera sangre-cóclea que separa el oído interno de la circulación general19 ,20. Por estas razones, droga o administración de vector viral en el oído interno es favorable, no a través de la administración sistémica sino por administración directa. En ratón y cobay...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El trabajo es apoyado por becas a M.F. del gobierno japonés MEXT KAKENHI (24592560, 15 H 04991 y 15 K 15624) y la Fundación de Ciencias de Takeda a M.F. y Jikei Universidad estratégico priorizar investigación del fondo a H.J.O.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| tití común | CLEA Japón | EDM:C.Tití (Jic) | |
| isoflurano | Phizer | ||
| medetomidina | ZENOAQ | ||
| midazolam | astellas | ||
| butorfanol | Meiji Seika | ||
| ampicilina | Meiji Seika | ||
| clorhidrato de lidocaína | AstraZeneca | ||
| Rosca absorbente 6-0 | ETHICON | RD-1 | |
| clorhidrato de atipamezol | ZENOAQ | ||
| salina tamponada con fosfato | Wako | 045-29795 | |
| Onda de sobretensión | Morita | TR-900-OR | |
| Barra de diamante 006 | Morita | 14070057 | |
| Barra de diamante 010 | Morita | 14070081 | |
| unidad de cuidados intensivos | Menix | P-100 |
Referencias
- Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hear Res. 349, 138-147 (2017).
- World Health Organization. Deafness and hearing loss (Fact sheet N8300). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs300/en/ (2015).
- Thompson, D. C., et al. Universal newborn hearing screening: summary of evidence. JAMA. 286 (16), 2000-2010 (2001).
- Wang, X. Neural coding strategies in auditory cortex. Hear Res. 229 (1-2), 81-93 (2007).
- Wang, X. On cortical coding of vocal communication sounds in primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (22), 11843-11849 (2000).
- Bendor, D., Wang, X. The neuronal representation of pitch in primate auditory cortex. Nature. 436 (7054), 1161-1165 (2005).
- Bendor, D., Wang, X. Neural coding of periodicity in marmoset auditory cortex. J Neurophysiol. 103 (4), 1809-1822 (2010).
- Eliades, S. J., Wang, X. Sensory-motor interaction in the primate auditory cortex during self-initiated vocalizations. J Neurophysiol. 89 (4), 2194-2207 (2003).
- Eliades, S. J., Wang, X. Dynamics of auditory-vocal interaction in monkey auditory cortex. Cereb Cortex. 15 (10), 1510-1523 (2005).
- Eliades, S. J., Wang, X. Neural substrates of vocalization feedback monitoring in primate auditory cortex. Nature. 453 (7198), 1102-1106 (2008).
- Hosoya, M., Fujioka, M., Ogawa, K., Okano, H. Distinct Expression Patterns Of Causative Genes Responsible For Hereditary Progressive Hearing Loss In Non-Human Primate Cochlea. Sci Rep. 6, 22250(2016).
- Hosoya, M., Fujioka, M., Kobayashi, R., Okano, H., Ogawa, K. Overlapping expression of anion exchangers in the cochlea of a non-human primate suggests functional compensation. Neurosci Res. 110, 1-10 (2016).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Sato, K., et al. Generation of a Nonhuman Primate Model of Severe Combined Immunodeficiency Using Highly Efficient Genome Editing. Cell Stem Cell. 19 (1), 127-138 (2016).
- Sasaki, E., et al. Establishment of novel embryonic stem cell lines derived from the common marmoset (Callithrix jacchus). Stem Cells. 23 (9), 1304-1313 (2005).
- Tomioka, I., et al. Generating induced pluripotent stem cells from common marmoset (Callithrix jacchus) fetal liver cells using defined factors, including Lin28. Genes Cells. 15 (9), 959-969 (2010).
- Harada, T., Tokuriki, M. Effects of click intensity and frequency on the brain-stem auditory evoked potentials in the common marmoset (Callithrix jacchus). J Vet Med Sci. 59 (7), 561-567 (1997).
- Harada, T., Tokuriki, M., Tanioka, Y. Age-related changes in the brainstem auditory evoked potentials of the marmoset. Hear Res. 128 (1-2), 119-124 (1999).
- Juhn, S. K., Hunter, B. A., Odland, R. M. Blood-labyrinth barrier and fluid dynamics of the inner ear. Int Tinnitus J. 7 (2), 72-83 (2001).
- Nakashima, T., et al. Disorders of cochlear blood flow. Brain Res Brain Res Rev. 43 (1), 17-28 (2003).
- Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane. J Vis Exp. (97), (2015).
- Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hear Res. 151 (1-2), 106-114 (2001).
- Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in the endolymphatic sac. Hum Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The functional and structural outcome of inner ear gene transfer via the vestibular and cochlear fluids in mice. Mol Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
- Nakagawa, T., et al. Topical insulin-like growth factor 1 treatment using gelatin hydrogels for glucocorticoid-resistant sudden sensorineural hearing loss: a prospective clinical trial. BMC Med. 8, 76(2010).
- Piu, F., et al. OTO-104: a sustained-release dexamethasone hydrogel for the treatment of otic disorders. Otol Neurotol. 32 (1), 171-179 (2011).
- Plontke, S. K., et al. double blind, placebo controlled trial on the safety and efficacy of continuous intratympanic dexamethasone delivered via a round window catheter for severe to profound sudden idiopathic sensorineural hearing loss after failure of systemic therapy. Laryngoscope. 119 (2), 359-369 (2009).
- Wenzel, G. I., Warnecke, A., Stover, T., Lenarz, T. Effects of extracochlear gacyclidine perfusion on tinnitus in humans: a case series. Eur Arch Otorhinolaryngol. 267 (5), 691-699 (2010).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
