Artículo de método

Multiplexado de análisis de la inmunofluorescencia y la cuantificación de Intratumoral PD-1+ + de Tim-3 CD8 células+ T

DOI:

10.3791/56606

⸱

8 de febrero de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estudio de microambiente tumoral puede identificar biomarcadores pronósticos o predictivos de la respuesta clínica a la inmunoterapia. Presentado aquí, es un método innovador basado en situ de la fluorescencia multiespectral de imágenes para analizar y contar automáticamente varias subpoblaciones de CD8+ T las células. Esta técnica reproducible y confiable es adecuada para análisis de grandes cohortes.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células inmunes son importantes componentes del microambiente tumoral e influyen en el crecimiento del tumor y la evolución en todas las etapas de la carcinogénesis. En particular, está ahora bien establecido que el infiltrado inmune en tumores humanos puede correlacionan con el pronóstico y respuesta al tratamiento. El análisis de la infiltración inmunitaria en el microambiente del tumor se ha convertido en un reto importante para la clasificación de los pacientes y la respuesta al tratamiento.

La coexpresión de los receptores inhibitorios como programa celular muerte proteína 1 (PD1; también conocido como CD279), citotóxico linfocitos T asociados proteína 4 (CTLA-4), T-Cell de la inmunoglobulina y mucina que contienen proteína-3 (Tim 3; también conocido como CD366) y linfocitos Activación gen 3 (Lag-3; también conocido como CD223), es un sello de agotamiento de la célula de T. Hemos desarrollado una inmunofluorescencia multiparamétrico en situ tinción para identificar y cuantificar a nivel celular la coexpresión de estos receptores inhibitorios. En una serie retrospectiva de tejido congelado de los carcinomas de células renales (RCC), utilizando una tecnología de imágenes multiespectrales de fluorescencia junto con un software de análisis de imagen, se encontró que la expresión de PD-1 y Tim-3 el tumor infiltrante CD8+ T células se correlaciona con un pronóstico pobre en RCC. A nuestro conocimiento, esto representa el primer estudio que demuestra que este automatizado tecnología multiplex in situ puede tener alguna importancia clínica.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En los últimos años, la inmunoterapia ha surgido como un tratamiento prometedor para muchos tipos de cánceres, incluyendo RCC. Particularmente, la inmunoterapia basada en la inhibición de los puestos de control inhibitorios como PD-1 y CTLA-4 se ha divulgado para ser clínicamente eficaz1,2,3,4,5, 6. anticuerpos monoclonales contra CTLA-4, PD-1, o programa muerte ligando 1 (PD-L1) están ya aprobados en varios cánceres y conducen a respuestas clínicas duraderas en más del 20% de los pacientes7. Sin embargo, no todos los pacientes son respondedores, el costo del tratamiento es alta, y estos tratamientos son tóxicos, llevando a graves autoinmunes-como efectos secundarios. Por lo tanto, el reto actual es identificar marcadores predictivos para esas nuevas inmunoterapias. La tasa de mutaciones en el tumor, la expresión de PD-L1 o los niveles de intratumoral CD8+ infiltración de células T se han divulgado para correlacionar con la respuesta clínica. Sin embargo, esta asociación sigue siendo demasiado débil para recomendar el uso de estos biomarcadores clínicos en la práctica clínica, salvo la prueba compañero para PD-L1 antes de la administración de Pembrolizumab en células no pequeñas lung cancer (NSCLC) pacientes8 ,9,1011,12. Se ha demostrado que la expresión conjunta de muchos receptores inhibitorios como PD-1 Tim 3, Lag-3, y CTLA-4, induce un fenotipo de agotamiento de la célula y la resistencia a la terapia13,14,15. Desde sangre periférica no es representativa del microambiente tumoral, es de gran interés para analizar las características fenotípicas de las células in situ. PD-1 y Tim-3 Co expresando las células de T son conocidas por ser células funcionalmente deterioradas en varios contextos13,16,17. En este estudio, el impacto pronóstico de la coexpresión de los receptores inhibitorios dos PD-1 y Tim-3 en CD8+ T las células fue evaluada.

Hasta ahora, estudiando la coexpresión de marcadores múltiples de tumor (TILs) los linfocitos de la infiltración se ha realizado principalmente por análisis de citometría de flujo, lo que es necesario trabajar en tumores frescos y por lo tanto perjuicio análisis retrospectivos. Convencionales en situ tinción, tinción sólo uno a la vez puede llevar a cabo, y la caracterización del tipo de la célula que expresa conjuntamente los marcadores no es posible. Por ejemplo, PD-L1 es expresada por muchos tipos de células del microambiente tumoral, lo que es difícil de definir por análisis inmunohistoquímica convencionales que las células que expresan PD-L1 son los más relevantes estudios correlativos. En este trabajo, hemos desarrollado un método innovador en situ multiparamétrico inmunofluorescencia con la cuenta de equipo correlacionar la co-expresión de PD-1 y Tim-3 por tumor infiltrante CD8+ las células T con los resultados clínicos en RCC. Esta técnica tiene varias ventajas, incluyendo la posibilidad de analizar a un nivel unicelular y marcadores múltiples al mismo tiempo usando una cámara multiespectral que puede captar intervalos restringidos > 10 nanómetro a través del cristal líquido filtros18. Por otra parte, el procedimiento es automático que permite un análisis acortado comparado con técnicas manuales19y una reproducibilidad inter-operador. En el campo del cáncer, varios estudios informaron convencer los stainings múltiples de moléculas inmunes como PD-1, PD-L1 y CD8 en carcinoma de células de Merkel, cáncer de pulmón y cabeza y cuello cáncer20,21,22, 23. el recuento celular automatizado es posible con capacitación por parte del usuario (paso de fenotipo). La fluorescencia se mide en los compartimientos diferentes de la célula (núcleo, citoplasma y membrana).

Aquí, diversos subconjuntos de la tumor-infiltración CD8+ T células expresando PD-1 y Tim-3 en una cohorte grande de RCC fueron contados y los resultados fueron correlacionados con las puntuaciones de gravedad clínica y parámetros de supervivencia. También es posible analizar la intensidad de fluorescencia de membrana en la resolución de celular con datos de la intensidad media de fluorescencia (IMF) como en la citometría. Lo que sabemos, esto representa el primer estudio informes pronóstico resultados utilizando esta técnica de conteo basado en proyección de imagen multiespectral.

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Protocolo

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Este estudio se llevó a cabo con arreglo a la declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de ética local (CPP Ile de France no. 2012-05-04). El consentimiento informado fue obtenido de los participantes incluidos en las cohortes.

1. tejido Material

  1. Recoger muestras de tejido de la RCC en el día de la cirugía. Manejar al espécimen quirúrgico a temperatura ambiente (Departamento de patología).
  2. Recoge una muestra de tumor de aproximadamente 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm de tamaño en un tubo seco. Congelación en nitrógeno líquido y almacenar a-80 ° C.
  3. Las muestras de temperatura óptima de corte compuesto de la capa. Sección de las muestras con un criostato a-20 ° C en secciones gruesas de 4-6 μm. Deje que las muestras de aire seco en las diapositivas por 12 h y guardarlas directamente a-80 ° C para evitar la desecación.
  4. Compruebe la calidad de la muestra mediante la visualización de una hematoxilina y eosina teñidos sección.

2. in Situ tinción de inmunofluorescencia de TILs

  1. Directrices de procedimiento
    1. Realizar todos los pasos experimentales a temperatura ambiente.
    2. Para todos los pasos, realizar las diluciones con Tris Buffer salino (TBS; véase Tabla de materiales).
    3. Realizar el lavado en TBS para todos los pasos excepto después de la incubación del anticuerpo primario. Para este último, utiliza Tris Buffer salina Tween20 (TBST, véase Tabla de materiales). Para la composición del tampón y reconstitución ver suplemento tabla 1.
    4. Utilizar una cámara de humedad para incubaciones de anticuerpo y una jarra de tinción para el lavado.
    5. No permita que la sección sequen durante el procedimiento.
  2. Tratamiento previo
    1. La diapositiva que contiene la muestra de tejido de descongelar y secar cuidadosamente la diapositiva alrededor de la muestra con una toalla de papel. Delimitar la zona de reacción que contiene el tejido con un bolígrafo de la barrera hidrofóbica (véase Tabla de materiales). Seco por 2 min.
    2. Fijar las muestras en acetona al 100% por 5 min, durante 2 min y lavar con TBS durante 10 minutos.
  3. Saturación y bloqueo
    1. Prepare los portaobjetos por 10 min con 3 gotas de avidina 0.1%, grifo o película de la diapositiva para distribuir la avidina y eliminar burbujas de aire y luego tratar por 10 min con 3 gotas de biotina 0,01% (véase Tabla de materiales), pulse, o la película. Lavado con TBS.
    2. Realizar un bloqueo de receptores Fc. Aplicar 100 μl de un volumen de 5% de suero normal diluido en suero de TBS. uso de la misma especie del anfitrión que el anticuerpo marcado secundario o terciario (véase Tabla de materiales); aquí, se utilizó suero de burro. Incubar durante 30 minutos.
    3. Durante la incubación, girar brevemente el anti-CD8, PD-1 y Tim-3 anticuerpos (Tabla de materiales). Preparar la mezcla de anticuerpos primarios en TBS como se describe en la tabla adicional 2.
  4. Inmuno-tinción para CD8, PD-1 y Tim-3
    1. Preparar la mezcla del anticuerpo primario. Consulte Tabla de materiales y tabla 2 suplementaria para los anticuerpos utilizados (anti-CD8, PD-1, Tim-3 y sus correspondientes anticuerpos secundarios) y sus concentraciones.
    2. Toque o mueva el suero restante de burro (agregado en el paso 2.3.2). Incube los portaobjetos con 100 μl de la mezcla de anticuerpos primarios no etiquetadas de 1 h en una cámara humidificada.
    3. Durante la incubación, brevemente la Cianina 5 anti-conejo AF488 anti de cabra y los anticuerpos anti-ratón biotinilado de la vuelta y preparar la mezcla de anticuerpos secundarios como se describe en la tabla adicional 2.
    4. Lave los portaobjetos en TBST por 5 min seco las diapositivas.
    5. Incube los portaobjetos con 100 μl de los anticuerpos secundarios durante 30 minutos en una cámara humidificada.
    6. Prepara la mezcla de anticuerpo terciario con Cy3-estreptavidina como se describe en la tabla adicional 2.
    7. Lave los portaobjetos en TBS 10 min seco las diapositivas.
    8. Incube los portaobjetos con 100 μl de la mezcla de anticuerpo terciario durante 30 minutos.
    9. Lave los portaobjetos en TBS 10 min seco las diapositivas.
  5. Montaje de la célula
    1. Montar las diapositivas en un 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, medio (DAPI de 1.5 μg/mL) con un cubreobjetos compatible para microscopía de fluorescencia de montaje que contiene diclorhidrato de DAPI (véase Tabla de materiales).
      Nota: Como un control negativo para cada experimento, se utilizó una diapositiva con los anticuerpos de isotipo-emparejados en la misma concentración como anticuerpos correspondientes. Para esta tinción se utilizan mouse IgG1, conejo IgG y anticuerpos de control negativo de IgG de cabra (véase Tabla de materiales). Como control positivo se utilizó humano amígdala hiperplásica que se conoce para ser positivo para los marcadores probados, para cada experimento. Una coloración típica se describe en los resultados (figura 1). Mono-tinción de CD8, PD-1 y Tim-3 se deben realizar individualmente (una tinción por diapositiva) con el mismo tratamiento previo y sin DAPI. También se debe realizar una diapositiva en las mismas condiciones experimentales sin ningún anticuerpo y sólo medio de montaje DAPI. Una diapositiva debe ser reflejada con idénticas condiciones experimentales sin ningún anticuerpo ni DAPI.

3. fluorescencia análisis y recuento celular automatizado

  1. Adquisición de imágenes con el microscopio automatizado
    1. Crear un protocolo.
      1. Abra el software del microscopio automatizado y el iluminador de fluorescencia.
      2. En la barra de menú, haga clic en "Archivo", "crear el protocolo," seleccione "DAPI", "FITC" y "TRITC."
      3. Haga clic en "Siguiente", "Sección de tejido," y haga clic en "Siguiente", "Nombre del protocolo". Elegir un clic nombre, por ejemplo, "CD8-PD-1-Tim-3" "Siguiente" y "guardar".
      4. Manualmente, coloque un portaobjetos en el escenario.
      5. En la barra de menú, haga clic en "setup", "configuración". Haga clic en "set Inicio Z" en la nueva ventana.
      6. Ajustar el tiempo de exposición con un control positivo , es decir un CD8 Deslice, PD-1 y Tim-3 triple teñidos con muestra DAPI.
      7. En la barra de control, haga clic en "ajustar la exposición."
      8. Ajuste el tiempo de exposición para cada filtro hasta que se obtiene una señal suficiente pero no saturación.
      9. Para imágenes monocromo, realizar lo siguiente:
      10. Elige la adquisición y en 'autofocus' elija Filtro DAPI.
      11. En el "límite de área de exploración", mueva el objetivo superior a la esquina superior izquierda de la diapositiva. Haga clic en "Marcar". Hacer lo mismo con la esquina inferior derecha.
        Nota: Este paso delimita la zona de baja potencia (proyección de imagen de LP) la proyección de imagen a 4 X; Tenga en cuenta lugar bien así que rodean todas las muestras de la serie.
      12. Para alta potencia (HP) la proyección de imagen, realizar lo siguiente:
      13. En 'Enfoque', elija "DAPI".
      14. En la banda de 'Adquisición', elija "DAPI", "", "Cy3" y FITC "Cy5". Haga clic en "Aceptar". En la barra de menú haga clic en "Archivo", "guardar el protocolo".
    2. Escanear las diapositivas.
      1. El protocolo de carga haciendo clic en "Archivo", "Protocolo de carga" de la barra de menús. Haga clic en "Inicio".
      2. Introduzca 'Laboratorio ID' (ubicación de la carpeta de almacenamiento de la imagen). Introduzca el ID de la diapositiva para identificar la diapositiva. Haga clic en "Siguiente".
      3. Haga clic en "Imagen monocromática" (para explorar la diapositiva entera bajo la luz de campo brillante y adquirir imágenes secuenciales usando un objetivo de 4 x).
        Nota: Esto produce una visión de escala de grises de la diapositiva.
      4. Haga clic en "Buscar ejemplar". Seleccione el área de tejido para ser escaneado en baja resolución (4 x): Mantenga pulsada la tecla 'Ctrl' y haga clic en un campo utilizando el cursor para seleccionar o deseleccionar los campos (figura 2A).
      5. Haga clic en "Imagen del LP" (4 imágenes) para la adquisición de imagen verde azul rojo fluorescente de cada campo.
      6. Para la selección de campo de caballos de fuerza, mantenga pulsada la tecla 'Ctrl' y haga clic en un campo utilizando el cursor para seleccionar o deseleccionar los campos que corresponden a la zona de los tejidos que se analizarán en alta resolución (20 x). Seleccione 5 campos (figura 2B).
      7. Haga clic en "HP Imaging" (20 x la proyección de imagen) para la adquisición de una imagen multiespectral de cada campo (figura 2).
      8. Haga clic en "Almacenamiento de datos" para almacenar imágenes en la carpeta que seleccionaron al principio en LabID.
        Nota: El proceso es resumido e ilustrado en la figura 2. Para cada paso (detección de tejido, selección de campo) un algoritmo puede ser incrementado y entrenado por el usuario para un proceso de análisis automatizado de todo.
  2. Análisis de imágenes de fluorescencia y célula automatizada contando con software de análisis acoplados
    1. Construir la biblioteca espectral.
      1. Abra el software de análisis de imagen.
      2. En el panel izquierdo, abra "Construcción de bibliotecas". En 'imagen de carga', haga clic en "Examinar" y seleccione un mono manchada imagen (p. ej., CD8/Cianina 5).
      3. Seleccione el fluoróforo (p. ej., Cianina 5). Haga clic en "extraer". Haga clic en "Guardar" para almacenar en la biblioteca. Haga clic en "Guardar".
      4. Repita el mismo proceso para PD-1 Tim 3 y DAPI mono manchado diapositivas con el fin de integrar el espectro de cada fluoróforo de interés.
        Nota: La biblioteca espectral de construcción integra el espectro para cada fluoróforo que se utiliza para el tejido específico (aquí, riñón), pero pueden usar bibliotecas de "sintéticas" que ya existen. Como el espectro de Autofluorescencia es estrictamente en relación con el tejido, es importante realizar una auto-fluorescencia y biblioteca espectral por proyecto.
    2. Cree un nuevo proyecto.
      1. En la barra de menú, haga clic en "Archivo", "Nuevo proyecto". En la pestaña 'Buscar característica', seleccione "segmentación de la célula". En la ficha 'Fenotipo', seleccione "fenotipo". Haga clic en "Crear".
      2. Integrar las imágenes representativas del proyecto.
        1. En la pestaña de 'Archivo', haga clic en "abrir imagen". Elegir 10 a 30 imágenes representativas de toda la serie. Agregar la diapositiva no manchado para quitar la autofluorescencia. En el panel derecho: fuente de la biblioteca selecta. Seleccione fluoróforo y los correspondientes a la biblioteca espectral previamente construida elegir a.
      3. Para quitar el tejido autofluorescencia, haga clic en el botón"AF" y seleccione el área de Autofluorescencia en la diapositiva en blanco.
      4. Tratamiento de imágenes y generación de la imagen compuesta.
        1. Haga clic en "Preparar todo" para integrar la biblioteca de fluorescencia y los espectros de Autofluorescencia para generar la imagen compuesta (figura 3). Haga clic en el icono de 'ojo' para abrir el panel de 'editor de vista' y seleccione los datos mostrados: seleccione los marcadores CD8, PD-1, Tim-3 y DAPI. Retire la autofluorescencia. Siga los pasos presentados por el software.
      5. Las células del segmento.
        1. Para el segmento de las células, en 'Compartimento', seleccione "Núcleos" y la "Membrana". En la pestaña de "Núcleos", sistema DAPI como contratinción nuclear.
        2. En la pestaña de "Máximo y mínimo (px)" entrar "40" y "176" como tamaños mínimos y máximos, respectivamente. Para la señal de 'Mínimo', conjunto "0.13". En la pestaña "Split", establecer "2.60". En la pestaña de "Núcleos", establecer "0.81". Seleccione "utilizar la señal de la membrana para facilitar la segmentación".
        3. Haga clic en "Celdas de segmento" en la parte inferior de la pantalla. Controlar la segmentación de los núcleos y membranas de las células y con diferentes parámetros de reintento si no coincide con la fluorescencia de DAPI y la membrana de las células.
          Nota: El software reconoce las células con la nuclear DAPI coloración y basado en el tamaño de celda. Ajustar los parámetros de la célula (tamaño, split, píxeles) de acuerdo con el proyecto.
      6. Fenotipo de las células.
        1. En la ficha 'Fenotipo', haga clic en "agregar". Crear células fenotipo categorías: CD8 (punto azul) / CD8-PD-1 (punto rojo) / CD8-PD-1-Tim-3 (punto verde) / otros (punto negro) (figura 4).
        2. Seleccione más de 5 ejemplos de células de cada categoría. Haga clic en "Clasificador del tren".
          Nota: Esto genera un algoritmo de Clasificación Estadística por el software.
        3. Haga clic en el "Fenotipo todos" para obtener el fenotipo de cada célula.
          Nota: El software da el fenotipo de una célula con un intervalo de confianza (IC) de precisión.
        4. Mejorar el algoritmo por el software del entrenamiento hasta que la diferencia entre el ojo y recuento automatizado es concordante (error < 5%). Elegir un CI que es aceptable para las células de interés.
          Nota: Hemos optado por realizar la capacitación sobre la base de CI de 55% como aceptable.
      7. Guarde el proyecto y algoritmo.
      8. En 'Archivo' Seleccione "proyecto". El nombre y haga clic en "Guardar".
    3. Realizar el análisis de lote de la serie.
      1. Seleccione "Análisis de lote". Seleccione el proyecto. Añadir las imágenes a analizar. Seleccione una carpeta de almacenamiento para los datos. Haga clic en "Ejecutar". Compruebe la calidad de la imagen compuesta. Verificar el fenotipado de todas las imágenes de la serie.
        Nota: El software de análisis de imagen acoplado integra todas las señales de celular compartimentos (membrana/citoplasma/núcleo). El paso de fenotipado es crucial aunque el entrenamiento del algoritmo puede ser un paso lento. Todos los datos de cada imagen están en un archivo .txt. Todos los datos de una celda (particularmente su fenotipo con su CI) están en una línea. Para cada diapositiva, la adquisición de imágenes y recuentos posteriores se realizaron en 5 campos.
  3. Integración de los datos y la generación de la cuenta de célula automatizada
    1. Calcular los datos con un programa estadístico.
      1. Calcular todos los datos de las 5 imágenes correspondientes a los 5 campos para 1 paciente. Utilizar una plataforma estadística y tiene un estadístico experimentado, administrador de datos o científico de datos realizar el análisis. Crear un script que cuenta automáticamente las celdas según su fenotipo, seleccionar el CI > 55%.
      2. Poner todos los archivos .txt de la serie en la misma carpeta.
    2. Extraer los datos.
      1. Poner todos los archivos de txt en una carpeta. Ejecute el script automático construido en paso 3.3.1. Abra el archivo .csv de salida generado por el script de R. Guardar como formato de .xl. La salida reúne al número de células para cada fenotipo (es decir, solo, CD8 CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) para cada paciente.
      2. Calcular el número promedio de células para cada paciente por campo: dividir el número de células por el número de campos (es decir, 5) para normalizar el número de células para cada paciente por campo.
      3. Calcular el porcentaje de células entre CD8 total de PD-1+ + T células y células de PD-1+ Tim-3+ entre CD8 total+ T las células. Vea la figura 5 para el Resumen de este paso.
        Nota: Idioma R (u otro software de programación de elección) es necesario crear y ejecutar los comandos correctamente, y así que un usuario experimentado o un científico estadístico/de datos es esencial. El programa de R puede calcular los datos del mismo paciente, pero el nombre de los 5 archivos de .txt de un paciente debe tener un principio idéntico, correspondiente a un identificador de paciente único.
  4. Análisis estadístico
    1. Utilizar software estadístico para el análisis estadístico de los resultados.
    2. Realizar análisis estadísticos apropiados con la ayuda de un estadístico.
      1. Usar la no paramétrica Wilcoxon firmó fila pruebas para comparación de PD-1 MFI entre dos fenotipos de células (figura 6). Correlacionar las características histológicas y covariable con la prueba chi-cuadrada de Pearson.
      2. Use un método de Kaplan-Meier para estimar supervivencia libre de progresión los modelos de regresión de Cox para estimar los efectos de la covariable en los resultados de tiempo hasta el evento, como la supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad.
      3. Considerar p-valores inferiores a 0,05 como significativo.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utilizando el protocolo general descrito anteriormente, el objetivo fue cuantificar intratumoral CD8 células de+ T Co expresando los receptores inhibitorios PD-1 y Tim-3 en tejidos congelados de pacientes con CCR y correlacionar los resultados con los resultados clínicos25.

Optimización de la tinción de CD8/PD-1/Tim-3:

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modificaciones y resolución de problemas:

La calidad del tejido es un parámetro importante; puede comprobarse fácilmente por la coloración de hematoxilina y eosina.

Una de las ventajas de la técnica es la posibilidad de multiplexado stainings, pero para evitar el contagio del fluoróforo, recomienda para seleccionar longitudes de onda de emisión con delta de 10 mínimo de nm. Aquí, porque teníamos 4 stainings incluyendo DAPI, decidimos difundir hacia ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por becas del Instituto Nacional del cáncer (INCA) (ET), Ligue contre le cáncer (ET), Cité Université de Paris Sorbonne (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), empresa Labex inmuno-Oncología (ET), CARPEM SIRIC (CG, ET). EdG fue financiado por una beca de la Fundación arco. EV y CD fueron financiados por una beca de php (bolsa année recherche). ChB es financiado por una beca de la Université Sorbonne París Cité (contrat doctoral). Los autores agradecen a Bristol Myers Squibb para su financiación en este proyecto. Los autores agradecen al Departamento de patología del hospital Européen Georges Pompidou y Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel y Gisèle Legall). Los autores agradecen la plataforma histología de PARCC, hospital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Vectra 3 Imágenes Automatizadas de Patología Cuantitativa Perkin ElmerCLS142338
análisis celular inInform 2.1.Perkin ElmerCLS135781
R softwarehttps://www.r-project.org
Dakopen pluma delimitadoraDakoS2002
Tris Buffer Salin TBS TabletsTakara, Bio Inc.TAKT9141ZpH7.6 100 comprimidos
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)Takara, Bio Inc.TAKT9142ZpH 7,6 100 comprimidos
Sistema de bloqueo de biotinaDakoX0590Avidin 0,1% y Biotina 0,01%
suero de burro normalJackson Immunoresearch017-000-0015% vol./vol. concentración
Fluoroshield con DAPISigma-aldrichF60571.5 y micro; concentración de g/mL
Funda de vidrio KnittelKnittel Glä ser,10003924x60 mm 100 cubreobjetos
Conejo anti-CD8 Clon P17-VnovusNBP1-79055uso en 4µ g/mL
Ratón anti-PD-1 Clon NATabcamab52587uso en 2 µ g/mL
Cabra anti-Tim-3R& DAF2365uso en 3 y micro; g/mL
Conejo anti-PD-L1 Clon SP142Roche 7309457001uso en 1 µ g/mL
Ratón AF647 etiquetado pan- clon de queratina C11Cell Signalling4528uso a 0,5 y micro; g/mL
Cabra anti-humano gal9R& DAF2045uso a 0,3 y micro; g/mL
Cyan 5 burro conjugado anti-conejoJackson Immunoresearch711-175-152uso en 5 µ g/mL
de F(ab' biotinilado 2) burro anti-ratón IgGJackson Immunoresearch715-066-150uso en 3 y micro; g/mL
Alexa Fluor488 burro conjugado anti-cabra IgGabcamab150133uso a 5 µ g/mL
de estreptavidina Amersham marcada con Cy3PA43001uso en 3 & micro; g/mL
ratón de control negativo IgG1DakoX0931uso a 2 µ g/mL
de IgG de suero de cabraSigma-aldrichI5256uso en 3 µ g/mL
de IgG de suero de conejoSigma-aldrichI5006uso en 4µ g/mL

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
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