Multiplexado de análisis de la inmunofluorescencia y la cuantificación de Intratumoral PD-1+ + de Tim-3 CD8 células+ T

Resumen

Estudio de microambiente tumoral puede identificar biomarcadores pronósticos o predictivos de la respuesta clínica a la inmunoterapia. Presentado aquí, es un método innovador basado en situ de la fluorescencia multiespectral de imágenes para analizar y contar automáticamente varias subpoblaciones de CD8⁺ T las células. Esta técnica reproducible y confiable es adecuada para análisis de grandes cohortes.

Resumen

Las células inmunes son importantes componentes del microambiente tumoral e influyen en el crecimiento del tumor y la evolución en todas las etapas de la carcinogénesis. En particular, está ahora bien establecido que el infiltrado inmune en tumores humanos puede correlacionan con el pronóstico y respuesta al tratamiento. El análisis de la infiltración inmunitaria en el microambiente del tumor se ha convertido en un reto importante para la clasificación de los pacientes y la respuesta al tratamiento.

La coexpresión de los receptores inhibitorios como programa celular muerte proteína 1 (PD1; también conocido como CD279), citotóxico linfocitos T asociados proteína 4 (CTLA-4), T-Cell de la inmunoglobulina y mucina que contienen proteína-3 (Tim 3; también conocido como CD366) y linfocitos Activación gen 3 (Lag-3; también conocido como CD223), es un sello de agotamiento de la célula de T. Hemos desarrollado una inmunofluorescencia multiparamétrico en situ tinción para identificar y cuantificar a nivel celular la coexpresión de estos receptores inhibitorios. En una serie retrospectiva de tejido congelado de los carcinomas de células renales (RCC), utilizando una tecnología de imágenes multiespectrales de fluorescencia junto con un software de análisis de imagen, se encontró que la expresión de PD-1 y Tim-3 el tumor infiltrante CD8⁺ T células se correlaciona con un pronóstico pobre en RCC. A nuestro conocimiento, esto representa el primer estudio que demuestra que este automatizado tecnología multiplex in situ puede tener alguna importancia clínica.

Introducción

En los últimos años, la inmunoterapia ha surgido como un tratamiento prometedor para muchos tipos de cánceres, incluyendo RCC. Particularmente, la inmunoterapia basada en la inhibición de los puestos de control inhibitorios como PD-1 y CTLA-4 se ha divulgado para ser clínicamente eficaz^{1,2,3,4,5, 6}. anticuerpos monoclonales contra CTLA-4, PD-1, o programa muerte ligando 1 (PD-L1) están ya aprobados en varios cánceres y conducen a respuestas clínicas duraderas en más del 20....

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo con arreglo a la declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de ética local (CPP Ile de France no. 2012-05-04). El consentimiento informado fue obtenido de los participantes incluidos en las cohortes.

1. tejido Material

1. Recoger muestras de tejido de la RCC en el día de la cirugía. Manejar al espécimen quirúrgico a temperatura ambiente (Departamento de patología).
2. Recoge una muestra de tumor de aproximadamente 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm de tamaño en un tubo seco. Congelación en nitrógeno líquido y almacenar a-80 ° C.
3. Las muestras de temperatura óptima de corte compuesto de la ....

Resultados

Utilizando el protocolo general descrito anteriormente, el objetivo fue cuantificar intratumoral CD8 células de⁺ T Co expresando los receptores inhibitorios PD-1 y Tim-3 en tejidos congelados de pacientes con CCR y correlacionar los resultados con los resultados clínicos²⁵.

Optimización de la tinción de CD8/PD-1/Tim-3:

Discusión

Modificaciones y resolución de problemas:

La calidad del tejido es un parámetro importante; puede comprobarse fácilmente por la coloración de hematoxilina y eosina.

Una de las ventajas de la técnica es la posibilidad de multiplexado stainings, pero para evitar el contagio del fluoróforo, recomienda para seleccionar longitudes de onda de emisión con delta de 10 mínimo de nm. Aquí, porque teníamos 4 stainings incluyendo DAPI, decidimos difundir hacia .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vectra 3 Imágenes Automatizadas de Patología Cuantitativa	Perkin Elmer	CLS142338
análisis celular inInform 2.1.	Perkin Elmer	CLS135781
R software	https://www.r-project.org
Dakopen pluma delimitadora	Dako	S2002
Tris Buffer Salin TBS Tablets	Takara, Bio Inc.	TAKT9141Z	pH7.6 100 comprimidos
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)	Takara, Bio Inc.	TAKT9142Z	pH 7,6 100 comprimidos
Sistema de bloqueo de biotina	Dako	X0590	Avidin 0,1% y Biotina 0,01%
suero de burro normal	Jackson Immunoresearch	017-000-001	5% vol./vol. concentración
Fluoroshield con DAPI	Sigma-aldrich	F6057	1.5 y micro; concentración de g/mL
Funda de vidrio Knittel	Knittel Glä ser,100039		24x60 mm 100 cubreobjetos
Conejo anti-CD8 Clon P17-V	novus	NBP1-79055	uso en 4µ g/mL
Ratón anti-PD-1 Clon NAT	abcam	ab52587	uso en 2 µ g/mL
Cabra anti-Tim-3	R& D	AF2365	uso en 3 y micro; g/mL
Conejo anti-PD-L1 Clon SP142	Roche 7309457001		uso en 1 µ g/mL
Ratón AF647 etiquetado pan- clon de queratina C11	Cell Signalling	4528	uso a 0,5 y micro; g/mL
Cabra anti-humano gal9	R& D	AF2045	uso a 0,3 y micro; g/mL
Cyan 5 burro conjugado anti-conejo	Jackson Immunoresearch	711-175-152	uso en 5 µ g/mL
de F(ab' biotinilado 2) burro anti-ratón IgG	Jackson Immunoresearch	715-066-150	uso en 3 y micro; g/mL
Alexa Fluor488 burro conjugado anti-cabra IgG	abcam	ab150133	uso a 5 µ g/mL
de estreptavidina Amersham marcada con Cy3		PA43001	uso en 3 & micro; g/mL
ratón de control negativo IgG1	Dako	X0931	uso a 2 µ g/mL
de IgG de suero de cabra	Sigma-aldrich	I5256	uso en 3 µ g/mL
de IgG de suero de conejo	Sigma-aldrich	I5006	uso en 4µ g/mL