Summary
Etter halen blodåre injeksjon av transposon-baserte integrering vektorer gjør stabil transfection murine hepatocytes i vivo. Her presenterer vi en praktisk protokoll for transfection systemer som gjør det muliggjør langsiktige grunnleggende uttrykk for en enkelt transgene eller kombinert konstituerende og doxycycline-induserbart uttrykk av transgene eller miR-shRNA i leveren.
Abstract
I forskning modeller av leverkreft, gjenfødelse, betennelse og fibrose er fleksibel systemer for i vivo genuttrykk og stanse svært nyttig. Etter halen blodåre injeksjon av transposon-baserte konstruksjoner er en effektiv metode for genetisk manipulering av hepatocytter som voksen mus. I tillegg til grunnleggende transgene uttrykk, kan dette systemet brukes til mer avanserte programmer, for eksempel shRNA-mediert genet sammenleggbare, Implikasjonen av CRISPR/Cas9 systemet å indusere genet mutasjoner eller induserbart systemer. Her er kombinasjonen av grunnleggende CreER uttrykk med induserbart uttrykk for en transgene eller miR-shRNA av valget presentert som et eksempel på denne teknikken. Vi dekker flere trinn prosedyren fra utarbeidelse av Tornerose-transposon konstruerer, injeksjon og behandling av mus og utarbeidelse av leveren vev for analyse av immunostaining. Systemet presentert er en pålitelig og effektiv tilnærming til å oppnå komplekse genetisk manipulasjon i hepatocytter. Det er spesielt nyttig i kombinasjon med grobunn/loxP-baserte musen stammer og kan brukes til en rekke modeller med forskning rundt leversykdom.
Introduction
Kronisk leversykdom presenterer store helse byrden verden1. Forsøksdyrutvalget modeller er viktige verktøy i studiet av leversykdom og har bidratt til å svare på komplekse spørsmål i leveren gjenfødelse, hepatic betennelse, og Steatose samt leverkreft2. Et betydelig antall av disse dyremodeller avhengige genmodifisering av leverceller. Effektive verktøy for å manipulere byggkorn under hepatocytter er derfor nyttig3. Etablerte metoder som oppdrett av genmodifiserte musen stammer eller generering av viral vektorer for hepatocyte infeksjon er enten tidkrevende, havn sikkerhet bekymringer, eller gir dårlig transgene uttrykk i hepatocytter i vivo 4 , 5. etter halen blodåre injeksjon (HTVI) er en alternativ metode for i vivo transfection hepatocytes muliggjør enkel, rask og kostnadseffektiv avhør av gen funksjon i leveren. For HTVI oppløses en vektor bærer ønsket DNA sekvensen i et volum saltoppløsning tilsvarende 10% av kroppsvekten til injisert dyret. Løsningen er deretter sprøytes inn hale venen i 5-10 s6. Overstiger blodsirkulasjon, flyter saltkildene fra de mindreverdige vena cava i leveren vener, fører til utvidelse av leveren og etter transfection av hepatocytter7. For å oppnå stabil genomisk integrasjon, blitt metoden kombinert med transposon-baserte vektorer, slik som sove skjønnhet -transposon systemet. Denne systemer formidler rekombinasjon målet vektorer med genomisk rekombinasjon nettsteder katalysert av en sovende skjønnhet -transposase8,9. Modeller av leveren fibrosis eller kreft er det ofte ønskelig å overexpress eller stillhet gener på bestemte tidspunkt av sykdom modell. For dette formålet, verktøy for induserbart genuttrykk som grobunn/LoxP-systemet eller tetracyclin-induserbart gene expression systemet (Tet-på) kan være brukt10.
Her beskriver vi en protokoll for i vivo transfection murine hepatocytes bruker HTVI av en Tornerose transposon-basert system. I tillegg til en protokoll for stabil, konstituerende uttrykk for en transgene under kontroll av en lever-spesifikke promoter, beskriver vi en mer avansert vektor-system som kombinerer grunnleggende tamoxifen-avhengige grobunn recombinase (CreER) uttrykk med den induserbart uttrykk av transgene eller microRNA-tilpasset shRNA (miR-shRNA), kalt pTC TET-systemet11. I dette vektor systemet samsvarer induserbart effekter av transgener eller miR-shRNAs for tetracycline-avhengige uttrykket i av ryggrad vektor med en recombinational kloning system, gir rask og enkel generering av nye vektorer12. Denne video-basert veiledningen dekker forberedelse egnet vektorer, injeksjon og behandling av mus å oppnå induserbart transgene/miR-shRNA uttrykk, og endelig utarbeidelse av leveren vev for analyse. Metoden beskrevet i denne protokollen ble utformet slik at kombinasjonen av grobunn/loxP mediert musen system med uttrykket eller sammenleggbare av noen genet valgfrihet, noe som gjør det til et allment gjeldende system i forskning av leversykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjer og bruk av forsøksdyr og ble godkjent av ansvarlig myndigheter (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland og Stanford institusjonelle dyr omsorg og bruke komiteen, Stanford, CA, USA). En liste over alle plasmider for kloning (trinn 1 til 4) angis i supplerende tabell S1.
1. kloning av et Transgene for grunnleggende genuttrykk
- Utforme primere for transgene forsterkning13,14.
- Legg til begrensning områder for PacI (TTAATTAA) på 5' slutten av fremover primer. Legge til begrensning områder for Volunteers (GGCGCGCC) eller FseI (GGCCGGCC) 5' slutten av omvendt primer.
- Forsterke transgene av PCR betingelser optimalisert for den ønskede transgene14. Rense ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig DNA rensing kit.
Merk: Annealing tid avhenger primerne designet i trinn 1.1., forlengelse tid avhenger av lengden på konstruere. For eksempel for en konstruksjon av 1000 bp lengde bruk 60 s forlengelse tid. - Fordøye transgene og vektor konstituerende gene expression15 med respektive begrensning nucleases (se trinn 1.2) og buffer i et totalt volum på 50 µL på 37 ° C over natten. For eksempel fordøye konstruksjon med 5 enheter PacI og 5 enheter FseI eventuelt (se trinn 1.2).
- Gel rense fordøyd vektor og sette inn ved hjelp av en kommersiell gel utvinning utstyr i henhold til produsentens instruksjoner. Utføre en standard ligation av 100 ng av vektor og 100-1000 ng av sette bruker 400 U T4 ligase ved 14 ° C i 16 h. varme deaktivere på 65 ° C for 10 min.
- Transformere kompetent bakterier med en standard varme-sjokk-protokollen16.
- Plate agar plater som inneholder 100 µg/mL ampicillin. Ruge på 30 ° C i 24 timer.
- Plukke enkelt kolonier, rense plasmider ved hjelp av en kommersiell miniprep kit i henhold til produsentens instruksjoner og kontroller sekvensen av Sanger sekvensering17 (sekvensering primer: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3).
- Bruk positiv koloniene for maxi skalere forsterkning av plasmider DNA og rense bruker en endotoxin-fri plasmider forberedelse kit18 i henhold til produsentens instruksjoner.
- Konstruksjonen er klar for injeksjon, dermed fortsette med trinn 5.
2. kloning av et Transgene for induserbart genuttrykk
- Utforme primere for transgene forsterkning13,14.
- Legge til begrensning områder for SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) eller KpnI (GGTACC) 5' slutten av fremover primer. Legge til begrensning områder for NotI (GCGGCCGC) eller XhoI (CTCGAG) 5' slutten av omvendt primer.
- Forsterke transgene av PCR betingelser optimalisert for den ønskede transgene14. Rense med en kommersiell DNA rensing kit.
- Fordøye det renset transgene og 4 µg av oppføringen vektor (pEN_TTmcs-vektor, se Tabellen for materiale)19 separat med passende begrensning nucleases (se trinn 2.2) og buffer i et totalt volum på 50 µL på 37 ° C over natten.
- Gel rense fordøyd vektor og sette inn ved hjelp av en kommersiell gel utvinning utstyr i henhold til produsentens instruksjoner. Utføre standard ligation med 100 ng av vektor og 100-1000 ng av sette bruker 400 U T4 ligase ved 14 ° C i 16 h. varme deaktivere på 65 ° C for 10 min.
- Transformere kompetent bakterier med en standard varme-sjokk-protokollen16.
- Plate agar plater som inneholder 15 µg/mL gentamicin. Ruge på 37 ° C for 16 h.
- Plukker enkelt kolonier rense plasmider og bekrefte sett inn ved sekvensering17 bruker pCEP frem primer: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3.
Merk: PCR på enkelt kolonier kan utføres uten forutgående rensing med primere pCEP frem og pCEP reversere (5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3). Dette trinnet kan nyttig for pre-utvalget av positiv kolonier. - Fortsett med trinn 4.
3. kloning av et miR-shRNA for induserbart Gene Knock-ned
- Utforme miR-shRNA oligonucleotides etter pSLIK kloning protokollen19. Anneal og rense oligonucleotides og fortynnes 1:20 i ddH2O.
- Digest 3 µg av oppføringen vektor med 5 U BfuAI ved 50 ° C i 3 h, deretter Deaktiver reaksjonen på 65 ° C for 20 min.
NOTE Hvis co uttrykk grønne fluorescerende protein (GFP), bruk pEN_TTGmiRc19 som en oppføring vektor, ellers bruk pEN_TTmiRc219. - Gel rense fordøyd vektor som i trinn 2.5. Utføre standard ligation av 100 ng av vektor og 1 µL av renset og fortynnet shRNA oligonucleotides (trinn 3.1) bruker 400 U T4 ligase ved romtemperatur for 1 h. varme deaktivere ved 65 ° C i 10 min.
- Transformere kompetent bakterier med en standard varme-sjokk-protokollen16.
- Plate agar plater som inneholder 15 µg/mL gentamicin. Ruge på 37 ° C for 16 h.
- Plukker enkelt kolonier, rense plasmider og kontrollere sett inn av Sanger sekvensering17 (sekvensering primer: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3).
- Fortsett med trinn 4.
4. recombinational kloning å generere klar-for-injeksjon kloner
- Mix 150 ng av oppføringen vektor (fra trinn 2 eller trinn 3) og 150 ng av pTC TET-vector20.
- Legg TE buffer til et totalt volum på 8 µL (pH = 8).
- Overføre LR-clonase enzym mix II (se Tabell of Materials) til is, ruge for 2 min. Vortex to ganger.
- Legge til 2 µL av LR-clonase enzym II reaksjonen og ruge ved 25 ° C i 1 time.
- Stoppe reaksjonen ved å legge til 1 µL proteinasen K-løsning. Inkuber ved 37 ° C i 10 min.
- Transformere Stbl3 kompetent bakterier med 2 µL recombinational måte blander med en standard varme-sjokk-protokollen16.
- Plate agar plater som inneholder 100 µg/mL ampicillin. Ruge på 30 ° C i 24 timer.
- Plukke enkelt kolonier, rense plasmider bruker en endotoxin-fri plasmider forberedelse kit18 i henhold til produsentens instruksjoner, og bekrefte vektor integritet av Sanger sekvensering17 (sekvensering primer 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3).
- Konstruksjonen er klar for injeksjon, fortsetter du med trinn 5.
5. forbereder løsning etter halen blodåre injeksjon
Merk: Utarbeidelse av konstruksjoner for grunnleggende og induserbart genuttrykk beskrives i trinn 1, 2, 3 og 4.
- Forberede sterilt 0,9% saltløsning injeksjon (gjør ikke bruk PBS). Bruk volum tilsvarer ca 10% av musen kroppsvekt. Eksempel: for en mus veier 20 g, forberede 2 mL løsningen.
- Forberede injeksjon vektorer som var renset med en endotoxin-fri plasmider rensing kit18 (se trinn 1.8 eller 4.8, henholdsvis).
- Legge til 10 µg eller 15 µg av endotoxin-fri Tornerose vektor konstruksjon (fra trinn 1 Bruk 10 µg, fra trinn 4 bruk 15 µg, henholdsvis) og 1 µg endotoxin-gratis pc-HSB521 per mL sterilt saltvann.
- Lagre løsning for opp til 4 h på 4 ° C. Må ikke fryses.
6. resultater etter halen blodåre injeksjon
- Bruke en restrainer for hale blodåre injeksjon (kommersielle eller forberedt fra en 50 mL konisk rør med hull for pust og halen). Fyll bunnen av røret med papir.
- Injeksjon, bruke mus for om 8-10 ukens av alderen med vekter på 20-25 g.
- Veie mus før injeksjon og forberede injeksjon volum etter kroppsvekt (tilsvarende 10% av kroppsvekten, se trinn 5.1). Forberede en steril 3 mL-sprøyte med en 27 G-nål injeksjon og fyll med et bestemt volum.
- Plass musen i restrainer. Justere mengden papir (se trinn 6.1) å forlate bare minimal plass for bevegelse men nok plass til å puste.
- Kontroller at musen er åndedrag regelmessig.
- Varm halen bruker en infrarød lampe for 30-60 s. nøye se etter tegn på overoppheting.
- Rengjør halen med en alkoholholdige vattpinnen.
- Sett inn nålen nesten vannrett i én av to laterale hale nær foten av halen.
Merk: Hvis vellykket, en liten mengde blod kan strømme tilbake i membran av nålen. Det anbefales ikke aktivt inneholder fordi noen ekstra bevegelse av nålen kan føre sine fortrengning og/eller skade i venen. - Injisere det totale volumet i halen venen i 8-10 s.
- Umiddelbart fjerne musen fra restrainer. Komprimere injeksjon såret minst 30 s eller til blødninger avtar.
- Plass musen i separate bur. Når musen er gjenopprettet etter prosedyren (ca 30-60 minutter), overføre musen tilbake til sin opprinnelige buret. Sjekke musen regelmessig for neste 24 h.
Merk: Mild sedasjon museklikk er rutinemessig observert for opptil 2 timer etter injeksjon. - Før du utfører ytterligere eksperimenter (dvs., trinn 7), vent 10-15 dager for klarering av ikke-integrerte vektorer.
7. induksjon av transfekterte CreER med Tamoxifen
FORSIKTIG: Tamoxifen er skadelig kan, bli kreft eller skade fruktbarhet. Se sikkerhetsdatabladet.
- Planlegge intraperitoneal tamoxifen injeksjoner på tre dager.
- På dag 1, løses 10 mg av tamoxifen i 40 µL etanol. Inkuber ved 55 ° C i 10 min. Vortex flere ganger til tamoxifen har oppløst.
- Legge til 960 µL maisolje. Inkuber i 5 minutter på 55 ° C. Vortex flere ganger for å få en klar løsning.
- Forberede løsningen i en 1-mL insulinsprøyte med en 27 G nål.
- Scruff musen ved å flytte av musen med tommelen og andre fingeren, fikse halen mellom undersiden av hånden og den fjerde og femte fingeren.
- Injisere 0,1 mL (= 1 mg av tamoxifen) av løsningen intraperitoneally i den venstre nederste delen av magen.
- Gjenta injeksjoner på dager to og tre.
8. induksjon av Tetracycline-avhengige genet eller shRNA uttrykk
FORSIKTIG: Doxycycline kan være skadelig. Se sikkerhetsdatabladet.
Merk: Avhengig av varigheten av forsøket,-doxycycline, kan leveres i drikkevann (trinn 8.1) eller chow (trinn 8.2)
-
For kort sikt eksperimenter (< 10 dager) administrere doxycycline via drikkevann ved hjelp av følgende protokollen.
- Oppløse 5 g sukrose i 100 mL vann fra springen. Autoclave.
- Oppløse 100 mg av doxycycline hyclate i 5 mL sucrose løsning (trinn 8.1.1) i en 15-mL konisk rør.
- Bruker en 10-mL sprøyte, sterile filter løsningen gjennom en 0,2 µm. Legge til sukrose løsningen i trinn 8.1.1.
- Supply doxycycline-sucrose løsning som drikkevann til musen. Sjekk daglig og erstatt når løsningen blir skyet indikerer bakteriell overgrowth (Erstatt klar løsning etter tre dager senest).
- For langsiktig eksperimenter (> 10 dager) eller eksperimenter følsomme for metabolske forandringer, bruke kommersielle doxycycline-chow (f.eksDoxycycline Hyclate Chow 0.625 g/kg) å unngå dehydration og/eller sukrose-induserte endringer i lever av behandlede dyr.
9. forberedelse av musen lever for analyse av Immunostaining
FORSIKTIG: Paraformaldehyde kan være skadelig. Se sikkerhetsdatabladet.
Merk: Timepoint når mus vil bli analysert, avhenger av eksperimentet. Det anbefales å analysere leveren vev etter ikke mindre enn tre dager med doxycycline behandling for å sikre tilstrekkelig induksjon av transgene eller shRNA.
- Forberede en 1 mL sprøyte med en 27 G nål med 1 mL 4% paraformaldehyde (PFA).
- Euthanize musen med en passende metode etter en godkjent dyr protokoll.
Merk: Retningslinjer for passende metoder for euthanasia kan variere avhengig av institusjonen. - Dissecting saks og anatomisk tang nøye åpne, bukhulen med en median laparotomy å avsløre leveren. Flytte tynntarmen til retten til å avsløre portalen blodåre og mindreverdig vena cava (IVC).
- Sette inn nålen av forberedt (se trinn 9.1) i IVC og kutt portalen blodåre. Injisere 1 mL av PFA sakte i IVC perfuse leveren vev og fjerne auto-fluorescerende røde blodlegemer (ønskelig hvis immunofluorescent flekker utføres).
- Fjerne leveren. Skyll i vann og overføre til 5-10 mL 4% PFA løsning.
- For parafinsnitt er fastsette vev for 36 – 48 h. vev klar for dehydrering og parafin innebygging.
-
Frosne deler, fikse vev i 4% PFA 1t.
- For cryoprotection, overføre til 10% sucrose løsning. Inkuber 60 min.
- Overføre til 20% sucrose løsning. Inkuber 60 min.
- Overføre til 30% sucrose løsning. Inkuber 12-16 h. Embed i embedding sammensatte frosne deler og fryse på 20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hva effekten av etter halen blodåre injeksjon: Andelen murine hepatocytter som er transfekterte hydrodynamically av en enkelt injeksjon er variabel og avhenger av flere parametere som injeksjon volum, injeksjon tid, mengden injisert DNA og størrelsen på de injiserte konstruere6, 22,23. Dessuten er hva effektivitet generelt lavere i større dyrene, der en større vaskulær diameter som større sinusformet område fører til en nedgang i samlede presset. For å visualisere hva effektivitet, ble HTVI av en CreER transposon konstruksjon utført i mus skjuler en Rosa26mTmG reporter genet etterfulgt av tamoxifen-mediert aktivering av den CreER konstruksjonen. Lav injeksjon volum eller langvarig injeksjon tid for tekniske årsaker resulterer i redusert transfection effektivitet med bare noen transfekterte hepatocytter synlig i hele leveren, mens optimal injeksjon gir høyere transfection effektivitet som avbildet av flekker etter HTVI av en CreER transposon (figur 1A). For å vurdere hva effekten, anbefales immunostaining den transfekterte transgene eller -som i tilfelle av CreER - med et egnet reporter. Alternativt kan transfection effektivitet estimeres fra mRNA uttrykk analyse av den transfekterte transgene.
Transfection hepatocytes pericentral: Etter etter injeksjon, kan en trykkgradient langs sinusformet plass - der trykket er høyest nær sentrale venen og laveste i periportal areal - føre til foretrukket transfection i pericentral området. Vi analyserte lever med en lav prosentandel av transgene-uttrykke hepatocytter og vurdert komponentenes plassering i leveren lobule av co-immunostaining for glutamin synthetase (GS), en markør for pericentral hepatocytter. Interessant, fleste av hepatocytter som viste reporter genuttrykk etter HTVI av en CreER konstruksjon gruppert rundt sentrale venen men ikke portal området (figur 1B) som angir høyere transfection effektivitet rundt sentrale venen.
I vivo imaging etter HTVI av et luciferase transposon: For å vurdere om enkeltutgave integrering observert etter HTVI av transposon konstruksjoner24 er tilstrekkelig for i vivo imaging vi injisert en transposon konstruksjon skjuler en luciferase uttrykk kassett under kontroll av en lever bestemt Promotoren konstruksjon. Musene ble injisert med luciferin og fotografert med en i vivo imaging system to uker etter HTVI (figur 2A). Bildebehandling viste robust og stabil luciferase bioluminescens i leveren 15 dager etter injeksjon og senere tidspunkt (figur 2B og data ikke vist). Disse resultatene viser at systemet kan med hell brukes å følge tilstedeværelsen av transfekterte celler i vivo av bioluminescens tenkelig.
Kombinert CreER og induserbart transgene eller shRNA uttrykk: Vi har tidligere genererte en transposon konstruksjon som kombinerer grunnleggende uttrykk for en induserbart grobunn recombinase (CreER) med induserbart uttrykk for en transgene eller en shRNA valg20 (figur 3A). Injeksjon av denne konstruksjonen i Rosa26mTmG-reporter mus og CreER aktivisering av tamoxifen viste robust uttrykk for reporter genet sammenlignes med resultatene som oppnås med en transposon konstruksjon for enkelt transgene uttrykk ( Finne 3B). Etter doxycycline behandling, kan induserbart transgene uttrykk visualiseres egnet antistoffer i transfekterte hepatocytter (Figur 3 c). For induserbart shRNA uttrykk anbefales bruk av en GFP-shRNA-konstruksjon som cytoplasmatiske GFP uttrykk oppdaget av immunostaining kan brukes som et surrogat markør for shRNA uttrykk (figur 3D). Av notatet er transgene eller shRNA uttrykk, bare synlig i et delsett av hepatocytter, som kan skyldes den relativt høye nivået av protein uttrykk kreves for gjenkjenning av immunostai-20.
Figur 1: Transfection hepatocytes ved HTVI. (A) variabel transfection effektivitet etter HTVI av en CreER-transposon i mus skjuler en Rosa26mTmG / + reporter og etterfulgt av behandling med tamoxifen. Transfekterte hepatocytter er positivt for membran-bundet grønne fluorescerende protein (GFP, grønn). (B) co flekker for CreER aktivert hepatocytter (grønn) i mus skjuler Rosa26mTmG reporter med sentrale blodåre markør glutamin synthetase (GS, rød). Her PV: portalen blodåre, CV: sentrale blodåre. Skala stolper representerer 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: I vivo avbildning av luciferase. (A) Transposon konstruere som inneholder en luciferase uttrykk kassett (ikke trukket skala). Injeksjon og behandling plan for visualisering av hepatisk luciferase uttrykk. SB: sleeping beauty anerkjennelse nettsteder, HTVI: etter halen blodåre injeksjon. (B) representativt bilde av hepatisk luciferase bioluminescens 15 dager etter HTVI av en transposon-luciferase konstruksjon med pHSB5 med en i vivo imaging system. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: kombinert CreER og induserbart genet/shRNA uttrykk. (A) Transposon konstruksjon for uttrykk for induserbart grobunn recombinase med uttrykk for en tetracycline-induserbart transgene eller shRNA (pTC Tet), ikke trukket å skalere. (B) grønne membran flekker angir transfekterte hepatocytter etter injeksjon av pTC Tet konstruksjon i Rosa26mTmG / + reporter mus og CreER aktivisering med tamoxifen. Skala linjen representerer 100 µm. (C) induserbart genuttrykk 5 dager etter at doxycycline behandling kan visualiseres immunostaining for transgene (YAP, rød) i transfekterte hepatocytter. (D) induserbart miR-shRNA uttrykk 5 dager etter doxycycline behandling angitt av cytoplasmatiske grønne fluorescerende protein (GFP) flekker av den GFP-shRNA konstruksjonen. Transfekterte hepatocytter er avbildet av membran-bundet GFP. Skalere barer i C) og D) representerer 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hva hepatocytes med etter halen blodåre injeksjon har blitt en etablert metode siden introduksjonen mer enn 15 år siden6. Injisert volumet overskrider blodsirkulasjon og munner fra de mindreverdige vena cava sinusoids av leveren7, fører til transfection på ca 10-20%, i noen tilfeller opp til 40% av hepatocytter25,26. Prediktorer for en vellykket hva er injisert volumet per injisert tid22,23. Derfor er en lav transfection effektivitet (figur 1A, venstre) vanligvis på grunn av unnlatelse av å opprettholde injeksjon hastigheten under prosedyre7. Men selv med en optimal teknikk, vil hva effektiviteten som kan oppnås ved HTVI forbli under sats ved virusinfeksjon med adenoviruses eller adeno-assosiert virus som kan nå nesten 100%5,27 . For å oppnå vellykket hale blodåre injeksjoner, er det avgjørende å sikre en stabil plassering av nålen i blodkaret. Dette er lett oppnådd i årer med større diameter nærmere til bunnen av halen. I tillegg er dilatasjon i venen ved oppvarming opp halen sterkt anbefalt. Best resultat oppnås ved hjelp av en infrarød lampe, men en ikke-infrarød varmelampe eller nedsenking av halen i varmt vann kan også brukes. I noen tilfeller supplement opp til 200 µL saltoppløsning ved intraperitoneal injeksjon rundt 30 minutter før HTVI vil forbedre hydration status dyrene som resulterer i utvidelse av blodårene. For å opprettholde en konstant injeksjon hastighet, bør halen av musen være grundig behersket for å unngå enhver bevegelse av halen, som kan resultere i forskyvning av nålen. For kontrollhensyn foreslår vi bruke en konstruksjon som kan gjenkjennes av immunostaining. Alternativt, hva effekten kan estimeres ved mRNA uttrykk analyse eller sekvensering av integrert DNA28.
Våre data indikerer at transposon integrering er fortrinnsvis observert i området pericentral i leveren lobule. Den dominerende transfection hepatocytes rundt sentrale venen er sannsynlig på grunn av den unike hemodynamics i HTVI som det også observert i ikke-transposon basert transfection29. Dette funnet kan være relevant for enkelte programmer, for eksempel induksjon av akutt leverskade ved CCl4, som hovedsakelig påvirker pericentral hepatocytter. I forbindelse med lav transfection effektivitet, kan CCl4 behandling derfor føre til betydelig reduksjon av antall transfekterte hepatocytter. I tillegg er HTVI begrenset bruk for målcellene periportal inkludert galle duct celler15.
I tillegg til systemer som benytter HTVI av transposon konstruksjoner for å oppnå stabil uttrykk for en enkelt transgene, presentert vi nylig et system som lar co uttrykk for CreER og induserbart uttrykk for et gen eller en miR-shRNA fra en enkelt vektor11 . Dette systemet er spesielt nyttig å forhøre bestemte gener i grobunn/LoxP-baserte musen stammer. Som effekter av transgener eller shRNA konstruksjoner er innført av en rask og pålitelig recombinational kloning prosedyre, kan systemet lett bli tilpasset for screening tilnærminger. Vector systemet formidler pålitelig induserbart uttrykk i vivo som er helt avhengig av levering av doxycycline11,30. Denne video-basert reiseguide gir trinnvise instruksjoner fra kloning av egnet vektorer over induksjon av genuttrykk til analyse av leveren vev.
Men for å sikre effektiviteten til systemet, flere aspekter bør holdes i bakhodet: for å opprettholde langsiktig uttrykk, genomisk integrering er formidlet på TA-områder av Tornerose transposase8,11. Siden integrering effektivitet er avhengig av transposon størrelse, er det viktig å holde størrelsen på transgene Konstruer oppmerksom designerne vektor31. Videre er uttrykk effektiviteten av induserbart gene produktet i leveren avhengig av rtTA3-arrangøren11. Optimal uttrykk resultater ved bruk av en vektor konstruksjon med en lever bestemte ApoE.HCR.hAAT-arrangøren anbefales (Addgene #85578), som viser det høyeste effektiviteten i en sammenligning av tre promoterere11. Med en optimalisert promoter konstruere, kan induserbart transgene/shRNA uttrykk registreres i immunostaining opp til 30% av transfekterte celler20. Hvis induserbart protein nivå finnes under en viss terskel som kreves for gjenkjenning av immunostaining, må dette bestemmes. Viktigere, kan ingen transgene/shRNA uttrykk være oppdaget av immunostaining i mus som ikke ble behandlet med doxycycline. Endelig er uttrykket av gener under kontroll av tetracycline svar element (TRE) avhengig av dosen av doxycycline32,33. For kort sikt eksperimenter er doxycycline administrasjon via drikkevann godt etablert34,35. Sukrose legges vanligvis til å gi en bedre smak. Men dette kan føre til polydipsi og dehydrering, og bruk av doxycycline chow er sterkt anbefalt for langsiktig eksperimenter36,37.
Oppsummert er etter halen blodåre injeksjon en allment etablert metode i leveren forskning. Dens anvendelse varierer fra studier av hepatitt B til leveren fibrosis eller hepatocellulært karsinom modeller38,39,40,41. Systemet er beskrevet i dette manuskriptet er spesielt nyttig i avhør av bestemt mål gener i grobunn/LoxP-baserte modeller av leversykdom. I tillegg kan overuttrykte i leveren også brukes for forskning hematologic sykdommer42,43 eller å takle immunologic spørsmål44,45. Utover analyse av bestemte gener av interesse, kan presentert systemet også lett tilpasses screening eller multipleksing tilnærminger. Denne video-basert guide vil derfor være nyttig for et stort fellesskap av forskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Krebshilfe, Tyskland (bevilgning nummer 111289 til UE), Lucile Packard Foundation for barns helse (Ernest og Amelia Gallo utstyrt postdoktorstipend - CTSA bevilgning nummer UL1 RR025744 til UE). Vi takker Dr. Mark A. Kay for vektor konstruksjoner og eksperimentelle råd og Dr Julien Sage for mus og eksperimentell støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
References
- Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
- Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A.
- Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
- Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Kanefuji, T., et al.
- Ivics, Z., Izsvak, Z.
- Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
- Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
- Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
- Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
- Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
- Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
- Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
- Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
- Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
- Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
- Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
- Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
- Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
- Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
- Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
- Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
- Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
- Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
- Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
- Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
- Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
- Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
- Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
- Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
- Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
- Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
- Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
- Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).
