Como las mitocondrias son sólo un pequeño porcentaje de la célula de la planta, tienen que ser purificado para una gama de estudios. Las mitocondrias pueden ser aisladas de una variedad de órganos de la planta de homogeneización, seguido de centrifugación gradiente diferencial y densidad para obtener una fracción altamente purificada mitocondrial.
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Artículo de método
Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana
En este artículo
Resumen
Resumen
Las mitocondrias son organelos esenciales involucrados en numerosas vías metabólicas en las plantas, en particular la producción de trifosfato de adenosina (ATP) de la oxidación de compuestos reducidos como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y flavina adenina dinucleótido (FADH2). La anotación completa del genoma de Arabidopsis thaliana ha establecido como el más ampliamente utilizado sistema de modelo de planta, y así la necesidad de purificar las mitocondrias de una variedad de órganos (hojas, raíz o flor) es necesaria aprovechar las herramientas que ya están disponibles para Arabidopsis estudiar biología mitocondrial. Las mitocondrias están aisladas por la homogeneización del tejido usando una variedad de enfoques, seguido por una serie de pasos de centrifugación diferencial produce un pellet mitocondrial cruda que más se purifica mediante gradiente de densidad coloidal continua centrifugación. Posteriormente se retira el material coloidal densidad por múltiples pasos de centrifugación. A partir de 100 g de tejido foliar fresco, 2-3 mg de mitocondrias puede rutinariamente obtener. Experimentos respiratorios en las mitocondrias Mostrar tasas típicas de 100-250 nmol O2 min-1 mg proteína mitocondrial total-1 (tasa de NADH-dependiente) con la capacidad de utilizar diferentes sustratos e inhibidores para determinar que sustratos son ser oxidados y la capacidad de las alternativa y citocromo oxidasas terminales. Este protocolo describe un método de aislamiento de las mitocondrias de las hojas de Arabidopsis thaliana mediante gradientes de densidad coloidal continua y un eficiente mediciones respiratoria de las mitocondrias planta purificada.
Introducción
La historia de la investigación mitocondrial planta va detrás más de 100 años1. Las mitocondrias intactas se aisló por primera vez en la temprana década de 1950 utilizando centrifugación diferencial. La aparición de un gradiente de densidad coloidal en la década de 1980 permitió que las mitocondrias ser purificada sin sufrir ajuste osmótico. Mientras que las mitocondrias purificadas gradiente son convenientes para la mayoría de los casos, debido a la sensibilidad de la espectrometría de masas, contaminantes aún relativamente de menor importancia pueden ser detectados y pueden ser asignados inadecuadamente una localización mitocondrial
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Protocolo
Este protocolo se utiliza para el aislamiento de las mitocondrias intactas de Arabidopsis thaliana órganos cultivados en suelo mediante gradientes de densidad coloidal continua. Después de la recolección de material todos los procedimientos se llevan a cabo a 4 ° C.
1. preparación del tampón de lavado, medio y soluciones de gradiente
- Preparar 300 mL de pulido medio (menos ascorbato y cisteína) y 200 mL de tampón de lavado x 2 según la tabla 1 un día antes del aislamiento, mantenerlos en frío a 4 ° C.
Nota: Agregar ascorbato de sodio y L-cisteína (base libre) a una concentración final de 17,84 m y 20,36....
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Resultados
Mediante este protocolo, hemos podido detectar diferentes proteínas mitocondriales por SDS-PAGE e immunoblotting. Como se muestra en la Figura 3A, la proteína aislada de tejido de la cultura del agua es suficiente para detectar una banda débil (2 μg). Intensidad de la señal aumenta proporcionalmente a las cantidades cargadas. De las mitocondrias aisladas de tejidos cultivados en placas (figura 3B), la respuesta al estrés de luz a.......
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Discusión
Por lo general, aislamiento de mitocondrias de Arabidopsis deja rendimientos encima de 3 mg de mitocondrias de aproximadamente 80-100 3 - 4 semana - viejas plantas, aunque a menudo se logra rendimientos de más de 5 mg con fondo pulido. El rendimiento varía con condiciones de crecimiento y disminuye dramáticamente como hojas marchitaron, aunque las mitocondrias estructura parece mantenerse bien durante la senescencia9. Una de las características más importantes para obtener un buen rendimiento es e.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por un australiano Consejo centro de excelencia en la investigación en planta de energía CE140100008 de biología, un australiano Consejo futuro beca de investigación (FT130100112) y MWM, una beca de investigación de Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fundación, Alemania) a JS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Antimicina química A | Sigma-Aldrich | A8674 | Químico, disuelva en etanol |
| anticuerpo AOX | de Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbato | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbato oxidasa de Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Albúmina sérica bovina química (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Claridad química |
| Sustrato ECL occidental | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Chemical Free Prefabricados 8-16% 18 pocillos | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Cianuro químico |
| Sigma-Aldrich | 60178 | químico | |
| Citocromo c | Sigma-Aldrich | C3131 | Químico |
| Difco Agar, granulado | BD Biosciences | 214530 | |
| Químico Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Químico |
| Sal disódica EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | Químico |
| Gamborg B-5 Medio basal | Austratec | G398-100L | Químico |
| Gamborg Solución Vitamínica (1000x) | Austratec | G219-100ML | Producto químico |
| de cabra Anti-ratón IgG (H + L)-HRP Conjugado | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Químico |
| de Cabra Anti-Conejo IgG (H + L)-HRP Conjugado | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | |
| L-cisteína | Sigma | C7352-100G | Sulfato |
| de magnesio químicoSigma-Aldrich | 230391 | Chemical | |
| Murashige & Skoog Mezcla de sales basales (MS) | Austratec | M524-100L | Químico |
| Myxotiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Químico, disuelva en etanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Químico |
| Anticuerpo Ndufs4 | de Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Galato de propilo | Sigma-Aldrich | P3130 | Químico, disuelva en etanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Químico, gradiente de densidad coloidal |
| Polivinilpirrolidona (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Químico |
| Cianuro de potasio | Sigma-Aldrich | 60178 | Químico |
| Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Piruvato | Sigma-Aldrich | P2256 | Químico |
| Cloruro de sodio | Chem-Supply | SA046 | Químico |
| Ditionito de sodio | Sigma-Aldrich | 157953 | químico |
| L-ascorbato de sodio | Sigma | A4034-100G | |
| Químico Succinato | Sigma-Aldrich | S2378 | Químico |
| Sacarosa | Chem-Supply | SA030 | Químico |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | |
| Pirofosfato tetrasódico químico (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Químico |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Kit de transferencia de nitrocelulosa | Bio-Rad Laboratories 1704271 Chemical | ||
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Químico, detergente |
| Reactivo de bloqueo occidental | Sigma | 11921681001 | Equilibrio químico |
| Mettler Toledo | XS204 | Equipos | |
| Vasos de precipitados | Isolab | 50 mL | |
| Centrífuga | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | |
| Equipos Tubos de centrífuga | Nalgene | 3117-9500 | Equipo |
| Circulador | Julabo | 1124971 | Acoplado a cámara de electrodos de oxígeno |
| cónico | Isolab | 500 mL | |
| Gotero | 3 mL | ||
| Rotor de ángulo fijo | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipo |
| Embudo | por alimento | 14 cm | Para filtrar |
| Vertedor de gradiente | Bio-Rad | 165-4120 | Para la preparación de gradientes |
| Agitador magnético ATE | Equipo de F20300165 VELP Scientifica | ||
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Material de filtración |
| Mortero y mortero | Jamie Oliver | Granito, equipo de 6 pulgadas | |
| O2view | Hansatech Instruments | Software de monitorización de oxígeno | |
| Sistema Oxygraph Plus | Hansatech Instruments | 1187253 | Electrodo de oxígeno tipo Clark |
| Pincel | Artist primera elección | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | película de parafina plástica |
| Bomba peristáltica | Gilson | F155001 | Para la preparación de gradientes |
| Tubo peristáltico de PVC | Gilson | F117930 | Para la preparación de gradientes Baño de |
| agua | VELP Scientifica | OCB | Equipo |
Referencias
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell
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Reimpresiones y permisos
