Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Summary

Como las mitocondrias son sólo un pequeño porcentaje de la célula de la planta, tienen que ser purificado para una gama de estudios. Las mitocondrias pueden ser aisladas de una variedad de órganos de la planta de homogeneización, seguido de centrifugación gradiente diferencial y densidad para obtener una fracción altamente purificada mitocondrial.

Abstract

Las mitocondrias son organelos esenciales involucrados en numerosas vías metabólicas en las plantas, en particular la producción de trifosfato de adenosina (ATP) de la oxidación de compuestos reducidos como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y flavina adenina dinucleótido (FADH₂). La anotación completa del genoma de Arabidopsis thaliana ha establecido como el más ampliamente utilizado sistema de modelo de planta, y así la necesidad de purificar las mitocondrias de una variedad de órganos (hojas, raíz o flor) es necesaria aprovechar las herramientas que ya están disponibles para Arabidopsis estudiar biología mitocondrial. Las mitocondrias están aisladas por la homogeneización del tejido usando una variedad de enfoques, seguido por una serie de pasos de centrifugación diferencial produce un pellet mitocondrial cruda que más se purifica mediante gradiente de densidad coloidal continua centrifugación. Posteriormente se retira el material coloidal densidad por múltiples pasos de centrifugación. A partir de 100 g de tejido foliar fresco, 2-3 mg de mitocondrias puede rutinariamente obtener. Experimentos respiratorios en las mitocondrias Mostrar tasas típicas de 100-250 nmol O₂ min^-1 mg proteína mitocondrial total^-1 (tasa de NADH-dependiente) con la capacidad de utilizar diferentes sustratos e inhibidores para determinar que sustratos son ser oxidados y la capacidad de las alternativa y citocromo oxidasas terminales. Este protocolo describe un método de aislamiento de las mitocondrias de las hojas de Arabidopsis thaliana mediante gradientes de densidad coloidal continua y un eficiente mediciones respiratoria de las mitocondrias planta purificada.

Introduction

La historia de la investigación mitocondrial planta va detrás más de 100 años¹. Las mitocondrias intactas se aisló por primera vez en la temprana década de 1950 utilizando centrifugación diferencial. La aparición de un gradiente de densidad coloidal en la década de 1980 permitió que las mitocondrias ser purificada sin sufrir ajuste osmótico. Mientras que las mitocondrias purificadas gradiente son convenientes para la mayoría de los casos, debido a la sensibilidad de la espectrometría de masas, contaminantes aún relativamente de menor importancia pueden ser detectados y pueden ser asignados inadecuadamente una localización mitocondrial². El uso de electroforesis de flujo libre puede quitar ambos plastidic y peroxisoma contaminación³, pero sin flujo de electroforesis es una técnica altamente especializada y no es necesaria para la gran mayoría de los estudios. Además, cuando determinar la ubicación de una proteína debe ser recordado doble o múltiples objetivos de proteínas ocurre en las células. Más de 100 proteínas específicas duales se describen para cloroplastos/plástidos y mitocondrias⁴y un número de proteínas dirigida a las mitocondrias y los peroxisomas también se conocen⁵. Además, la reubicación de proteínas bajo estímulos específicos, por ejemplo, el estrés oxidativo, es un tema emergente en la biología de la célula⁶. Por lo tanto, debe ser considerado en el contexto de la biología que estudia la localización de las proteínas, y una variedad de métodos se utilizan para determinar y verificar la ubicación².

Las mitocondrias son generalmente aisladas de los tejidos vegetales por homogeneización, un equilibrio es necesario entre rompiendo la pared celular para liberar las mitocondrias y no dañar las mitocondrias. Tradicionalmente con patata y coliflor, homogeneización implica el uso de aparatos domésticos licuadora/exprimidor para hacer un extracto líquido en un tampón con varios componentes para mantener la actividad. Aislamiento de mitocondrias de hojas de guisante, (un material popular para aislamiento mitocondrial utilizando plantas de semillero jóvenes (~ 10 días), utiliza una batidora para lyse las células como el material de la hoja es suave. Con la disponibilidad de líneas de knock-out insertional T-DNA de Arabidopsis thaliana , la necesidad de ser capaz de purificar las mitocondrias para llevar a cabo estudios funcionales ha requerido el desarrollo de métodos para aislar mitocondrias de hoja, raíz o flor tejido. En general los métodos desarrollados para otras plantas trabajaban bien⁷, con la gratificación que moler del material necesario para ser optimizado. Para Arabidopsis esto puede lograrse en una variedad de maneras (véase abajo) y difiere entre tipos de tejidos (raíz versus shoot). El uso de la gradiente continuo también puede ser optimizado como la densidad de las mitocondrias de distintos órganos o etapas de desarrollo medio pueden migran diferentemente. Así, para la separación máxima la densidad del gradiente puede ser refinada para lograr la mejor separación.

Una vez purificada la mitocondria puede utilizarse para una variedad de estudios, incluyendo los experimentos de absorción de proteína y tRNA, ensayos de actividad enzimática, las medidas de la cadena respiratoria y mancha blanca /negra occidental análisis. Las mitocondrias aisladas pueden utilizarse también para los análisis de espectrometría de masas de la abundancia de la proteína. Objetivo reacción múltiple monitoreo análisis (MRM) permite la cuantificación de definido de las proteínas, pero requieren el desarrollo de los ensayos significativos. En cambio, cuantificación por dimetil u otro isótopo etiquetas⁸, proporciona un enfoque de descubrimiento en la identificación de las diferencias en el proteoma completo que puede utilizarse para descubrir nuevos conocimientos biológicos.

Protocol

Este protocolo se utiliza para el aislamiento de las mitocondrias intactas de Arabidopsis thaliana órganos cultivados en suelo mediante gradientes de densidad coloidal continua. Después de la recolección de material todos los procedimientos se llevan a cabo a 4 ° C.

1. preparación del tampón de lavado, medio y soluciones de gradiente

1. Preparar 300 mL de pulido medio (menos ascorbato y cisteína) y 200 mL de tampón de lavado x 2 según la tabla 1 un día antes del aislamiento, mantenerlos en frío a 4 ° C.
   Nota: Agregar ascorbato de sodio y L-cisteína (base libre) a una concentración final de 17,84 m y 20,36 m, respectivamente, en el medio de moliendo en la mañana de la aislamiento. Si se utilizan las mitocondrias para inmunoblot o azul nativo-poliacrilamida gel análisis de electroforesis (BN-PAGE), hacer 2 x solución de lavado sin BSA.
2. Preparación de gradientes en la mañana del aislamiento mitocondrial (figura 1 y tabla 1).
   1. Hacer las soluciones gradiente pesadas y ligeras en dos vasos; 35 mL de cada uno es suficiente para dos tubos de gradiente.
   2. Lavar las cámaras del pourer del gradiente y tubería peristáltica de PVC con agua desionizada y asegurar un flujo uniforme a través del tubo de todos los tubos.
   3. Colocar 2 tubos de centrífuga (50 mL) en un ángulo leve en el hielo con las salidas de tubería peristáltica de PVC pegada en el interior de los tubos para asegurar que la solución gradiente corre por el lado de los tubos.
   4. Cierre la conexión entre las cámaras internas y externas (palanca negra hacia abajo). Coloque el pourer del gradiente en un agitador magnético con una barra de agitación pequeño en la cámara interior.
   5. Verter la solución gradiente pesado de 35 mL en la cámara interior (cámara con salida de la tubería). Pipetear en los tubos de dos centrífuga colocados en hielo hasta la mitad queda con la velocidad de la bomba peristáltica para rápido (300 mL/h) la solución gradiente fuerte.
   6. Verter la solución de gradiente ligero 35 mL en el externa (cámara sin salida de la tubería). Abra la conexión entre las cámaras (palanca de empuje negro para arriba hasta la mitad) y permite soluciones mezclar suavemente. Mezclar las soluciones con el agitador magnético.
   7. Que las soluciones se ejecute lentamente (60 mL/h) hasta que toda la mezcla degradada ha salido de las cámaras dando por resultado dos 0 – 4.4% (w/v) tubos de relleno de degradado de polivinilpirrolidona (PVP). Mantener los gradientes en el hielo hasta que esté listo para usar en paso 2.12.
      Nota: Una vez que el gradiente se ha preparado, diluir 2 x medio de lavado 1 x con agua desionizada prechilled y mantenga frío a 4 ° C.

2. homogeneización y aislamiento mitocondrial

1. Cortar tejido entero roseta de 4 – semanas de edad plantas Arabidopsis cultivadas en suelo con tijeras, por lo menos 80 plantas será requeridas para 1 preparación.
   Nota: 10-14 días agua culturas, mínimo 5 preparación de macetas o 2 semana de edad plántulas cultivadas en placas de agar de Murashige y Skoog Basal sal mezcla (MS), mínimas de 4 platos, también pueden ser utilizadas.
2. Colocar la mitad del material vegetal que ha sido cortado en trozos pequeños en un mortero grande previamente refrigerado 4 ° C con 75 mL de medio de molienda (tabla 1) y moler extensivamente durante varios minutos hasta que no se quedan grandes piezas de tejido.
3. Humedezca previamente 4 capas de material de la filtración (22-25 μm tamaño de poro) con pulido medio y filtrar el homogeneizado las 4 capas de material de la filtración a través de un embudo de plástico en un erlenmeyer de 500 mL.
4. Moler la mitad restante de tejido con otro 75 mL de medio de molienda.
5. Combinar homogenados en los materiales de filtración y tanto como posible homogeneizado a través del filtro.
6. Moler el tejido restante restante en el material de filtración otra vez con lo restantes 150 mL de pulido medio, filtro otra vez en el frasco cónico de 500 mL.
7. Centrifugar el homogeneizado filtrado en 8 tubos de centrífuga plástico de 50 mL previamente enfriada a 2.500 x g a 4 ° C en un rotor de ángulo fijo durante 5 minutos.
8. Vierta el sobrenadante en tubos de centrífuga limpio (50 mL; evitar perturbar el sedimento verde) y centrifugar a 17.500 x g a 4 ° C por 20 min en un rotor de ángulo fijo.
9. Deseche todo pero < 3 mL del sobrenadante por aspiración (o retirar suavemente sin perturbar el pellet). Con cuidado Resuspender el precipitado en el sobrenadante residual con un pequeño pincel fino.
10. Añadir 10 mL de 1 x de tampón de lavado a cada tubo y combinar 4 tubos en tubo de centrífuga limpio 1 (es decir, resultante en 2 tubos).
11. Rellenar estos tubos con tampón de lavado 1 x 50 mL y repetir pasos 2.7-2.9.
12. Piscina crudos pellets mitocondriales en 1 tubo con un gotero y dispersan uniformemente con el pincel fino (puede usarse una pequeña cantidad de tampón de lavado pero el volumen final debe ser menos de 3 mL para caber en la parte superior del gradiente). Suavemente la capa la suspensión mitocondrial con un gotero en los 2 continua 0 – 4.4% (w/v) PVP gradientes.
13. Equilibrar los tubos por peso (1 x de tampón de lavado) y centrifugar a 40.000 x g a 4 ° C durante 40 minutos Asegúrese de que la rotura se ha apagado. Las mitocondrias se migrarán a una banda cerca del fondo del tubo, o pueden estar presentes en la solución de pesado en la parte inferior del tubo (identificado por una banda turbia, amarillenta; Figura 2).
14. Retire con cuidado la superior 5 cm de la solución por encima de la banda mitocondrial por la aspiración.
15. Distribuir la solución restante que contiene la mitocondria en 2 tubos limpios y llenan de 1 x de tampón de lavado. Distribuir uniformemente el gradiente de densidad coloidal y mitocondrias que cubre la boca del tubo con una película plástica de la parafina y invirtiendo varias veces. Centrifugar 15 min a 31.000 x g a 4 ° C con el frenado lento.
    Nota: Antes de la centrifugación, asegúrese de que las mitocondrias y el gradiente de densidad coloidal restante se distribuyen uniformemente. De lo contrario, el gradiente de densidad coloidal puede concentrarse en la parte inferior del tubo y prevenir la granulación de las mitocondrias.
16. Eliminar el sobrenadante por aspiración, llene el tubo de lavado 1 x 50 mL de tampón e invertir otra vez para asegurar una mezcla. Centrifugar 15 min a 31.000 x g a 4 ° C con el frenado lento.
17. Aspirar el sobrenadante y recoger los pellets mitocondriales en tan pequeña un volumen (~ 500 μl) como sea posible usando una pipeta con modificada 200 μL puntas (cortadas la punta un poco por encima de su extremo para aumentar su apertura). Coloque las mitocondrias en un tubo de 1,5 mL y mantener en hielo para su uso inmediato o tienda a-80 ° C.
    Nota: Si las mitocondrias se utilizará para la electroforesis del gel de la sulfato-poliacrilamida de sodio dodecyl (SDS-PAGE), BN-PAGE, o análisis del immunoblot, usan 1 x de tampón de lavado sin BSA para el lavado final (es decir, paso 2.15 y 2.16).
18. Determinar la concentración de proteínas de las mitocondrias mediante el método de Bradford.
    Nota: Para alícuotas de BN-PAGE centrifugar a 4 ° C y pellets tienda a-80 ° C hasta su uso. Para mediciones de consumo de oxígeno, pueden utilizarse sólo las mitocondrias recién aisladas.

3. mediciones de consumo de oxígeno

Nota: El consumo de oxígeno por recién aislada planta mitocondrias pueden analizarse con un electrodo de oxígeno de Clark-tipo, permitiendo la determinación de la integridad mitocondrial, citocromo c vía actividad y actividad de la vía alternativa.

1. Instalación del software
   1. Instalar licencia oxígeno control de software en el equipo utilizado para las mediciones de consumo de oxígeno.
2. Preparación de medio de la respiración, sustratos, soluciones químicas y el electrodo de oxígeno de Clark-tipo
   1. Preparar el medio de la respiración (300 mM sacarosa, 10 mM NaCl, 5 m m KH₂PO₄, 2 mM de MgSO₄, 0.1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA), TES (pH 7.2) de 10 mM) utilizado para los ensayos de consumo de oxígeno.
   2. Preparación de sustratos, inhibidores y efectores utilizados para medir la respiración mitocondrial (tabla 2). Puede ser preparados antes y almacenados a-20 ° C.
      Nota: Neutralizar el pH de soluciones ácidas tales como ácidos orgánicos a pH 7,0 con NaOH antes de uso.
   3. Caliente el medio de la respiración a la misma temperatura que la cámara de ensayo (25 ° C).
   4. Montar el electrodo de oxígeno de Clark-tipo como se describe en el protocolo del fabricante.
   5. Colocar 1 mL de agua saturada de aire (agua saturada de aire se obtiene agitando vigorosamente una pequeña cantidad de agua desionizada en un matraz cónico grande) en la cámara de medición. Para encender el agitador, haga clic en el botón “Velocidad de agitado”. Haga clic en el botón “On” y seleccione la velocidad del agitador a 65 rpm. Haga clic en “Aceptar” para continuar. Agitar continuamente el agua a 25 ° C.
3. Calibración del electrodo de oxígeno
   1. Caliente el agua que se utilizarán para la calibración a la misma temperatura que la cámara de ensayo (25 ° C).
   2. Espere a que la corriente estabilizar y calibrar el electrodo de oxígeno.
   3. Para iniciar la calibración del electrodo de oxígeno, haga clic en el botón “Calibrate”, seleccione “Calibración de fase líquida” y “Agua saturada de aire”.
   4. (Calibración del oxígeno (fase líquida) – paso 1 de 5) abrirá una ventana nueva. Seleccione el canal para calibrar (el canal de) que la caja de control del electrodo está conectada) e introducir variables (juego “Temperatura de la cámara” a 25 ° C y la “Presión atmosférica” a 101,32 kPa). Haga clic en “Aceptar” para continuar.
   5. En el siguiente paso (paso 2 de 5), configurar la velocidad del agitador (65 rpm) y haga clic en “Aceptar” para continuar.
   6. En el paso 3 de 5, esperar la señal llegar a una meseta. El término “Meseta alcanzado, presione OK para continuar” aparecerá en la caja. Haga clic en “Aceptar” para continuar.
   7. En el paso 4 de 5, establecer cero oxígeno en la cámara mediante la adición de Ditionito de sodio 5 mg. Haga clic en “Aceptar” para continuar.
      Nota: Una disminución en la concentración de oxígeno debe ser visible en el rastro y debe llegar a 0.
   8. En el último paso de calibración (paso 5 de 5), esperar la señal llegar a una meseta. El término “Meseta alcanzado, presione OK para continuar” aparecerá en la caja. Haga clic en “Aceptar” para continuar.
   9. Haga clic en “Guardar calibración” para guardar la calibración. Se abrirá una nueva ventana. Haga clic en “Aceptar” para confirmar para guardar la nueva calibración de la caja de control de oxígeno.
      Nota: Después de la calibración, el etiquetado “oxígeno (nmol/mL)” aparecerán en el eje y.
   10. Después de la calibración, limpiar la cámara de medición de enjuague la cámara con agua (al menos 5 – 10 veces) para asegurar la limpieza apropiada. Coloque 1 mL del medio de la respiración en la medición de la cámara y permitir que la membrana se equilibre durante unos minutos hasta que la huella del consumo de oxígeno es lineal.
   11. Adaptar la escala de la huella de consumo de oxígeno para obtener una visión de buena pendiente. Haga clic en “Zoom XY” e introduzca variables (posición “Oxígeno” 0 – 300 y el “tiempo eje” 0 – 45 minutos).
4. Determinación de la integridad mitocondrial
   1. Con el émbolo abierto, añadir 970 μl de medio de respiración de aire saturado a la cámara de reacción.
   2. Añadir 30 mitocondrias μl aislado o 150 μg de la proteína mitocondrial total determinada después de aislamiento de las mitocondrias (proteína total debe incluirse en los cálculos luego) a la cámara de reacción mediante una pipeta con una punta de corte.
   3. Agitar la suspensión mitocondrial continuamente con un agitador magnético de la barra (65 rpm) a 25 ° C para aire-saturar la solución.
   4. Sellar la cámara con el émbolo, haga clic en “Iniciar grabación” para registrar el consumo de oxígeno y permite el seguimiento de consumo de oxígeno estabilizar (1-2 min).
   5. Determinar la tasa de consumo de oxígeno manualmente después de añadir 10 mM ascorbato y 25 μm citocromo c durante 5 minutos obtener la tasa de “antes de detergente”.
      Nota: Para la adición de sustratos, inhibidores y efectores directamente en el rastro de la etiqueta, haga clic en el botón “Agregar evento Mark” e introduzca la correspondiente designación de etiqueta. Haga clic en “Aceptar” para continuar.
   6. Determinar la tasa de consumo de oxígeno manualmente por 3 min después de añadir el detergente de 0,05% (v/v) para dar el tipo “después de detergente”. Haga clic en “Detener grabación”.
   7. Haga clic en el botón “Tabla de tasas de cambio”. 2 cursores aparecerán como líneas verticales en la pantalla graph. Haga clic y arrastre el par de cursores de tasa a las posiciones necesarias en el rastro para definir el intervalo de frecuencia. Mover el intervalo de frecuencia a lo largo de la traza usando los cursores izquierdo tasa. Establecer el intervalo de frecuencia utilizando el cursor de derecha tasa. El oxígeno monitoreo software automáticamente dibuja una línea de mejor ajuste entre los dos cursores mientras se mueven los cursores de intervalo de velocidad a lo largo de la traza.
   8. Una vez definido el intervalo de la tasa deseada y la posición, introduce el índice en la tabla con un clic derecho en 1 de los 2 cursores y seleccionar “Añadir velocidad a mesa”. Haga clic en el botón “Agregar” para confirmar para mostrar el índice en la tabla de índice principal.
   9. Calcular la integridad mitocondrial dividiendo la tasa de “antes de detergente” la tasa “después de detergente”, expresada como un porcentaje y restar de 100.
5. Determinación de la respiración mitocondrial
   1. Con el émbolo abierto, añadir 970 μl del medio de la respiración de aire saturado a la cámara de reacción. Añadir 500 μm ATP y mitocondrias μl aislado 30 o 150 μg de la proteína mitocondrial total usando una pipeta con una punta cortada al medio de la respiración en la cámara de reacción.
   2. Agitar la suspensión mitocondrial continuamente con un agitador magnético de la barra (65 rpm) a 25 ° C.
   3. Cerca de émbolo, haga clic en “Iniciar grabación” para registrar el consumo de oxígeno y esperar 1-2 min para la tasa de consumo de oxígeno se estabilice (cuando la huella del consumo de oxígeno es lineal). Añadir succinato 5 mM. Registro de la tasa de consumo de oxígeno durante unos 2 minutos.
      Nota: Para la adición de sustratos, inhibidores y efectores directamente en el rastro de la etiqueta, haga clic en el botón “Agregar evento Mark” e introduzca la correspondiente designación de etiqueta. Haga clic en “Aceptar” para continuar.
   4. Añadir 1 mM adenosina difosfato (ADP). Continúan registrando la tasa de consumo de oxígeno durante 2 minutos.
   5. Añadir 1 mM NADH. Registro de la tasa de consumo de oxígeno durante 4-8 minutos. Esta tasa es la capacidad de la respiración a través de la citocromo oxidasa.
   6. Añadir 1 mM cianuro de potasio (KCN) (o 2.5 myxothiazol μm o 5 μm antimycin A) para inhibir la vía de citocromo c y continuar a grabar durante unos 2 minutos observar el consumo de oxígeno a través de la oxidasa alternativa.
   7. Añadir 5 mM Ditiotreitol (DTT) y piruvato de 10 mM para activar completamente la oxidasa alternativa. Continuar a grabar durante 5-7 min: es la capacidad de la oxidasa alternativa.
   8. Añadir 500 μm n-propil galato (nPG) y grabación de 2 minutos. Esto evalúa la tasa de consumo de oxígeno residual que no puede ser químicamente inhibido. Reste esta tasa de las otras tasas registradas, ya que no es probable ser mitocondrial en origen. Consumo de oxígeno sigue produciendo después de la inhibición de la citocromo c y camino AOX (por KCN y nPG) es muy probable que venga de peroxidasas presentes como contaminantes en la mitocondria aislada⁹.
   9. Haga clic en “Detener grabación”.
   10. Haga clic en el botón “Tabla de tasas de cambio” introduce la tasa de la tabla con un clic derecho en uno de los dos cursores y seleccionar “Añadir a la tabla de tasas”. Haga clic en el botón “Agregar” para confirmar para mostrar el índice en la tabla de índice principal.
       Nota: Cuando agrega efectores disuelto en solventes orgánicos (por ej., antimicina A, nPG, myxothiazol), la cámara y el émbolo debe ser aclarados con etanol y agua entonces para asegurar la limpieza apropiada.

Representative Results

Discussion

Por lo general, aislamiento de mitocondrias de Arabidopsis deja rendimientos encima de 3 mg de mitocondrias de aproximadamente 80-100 3 – 4 semana – viejas plantas, aunque a menudo se logra rendimientos de más de 5 mg con fondo pulido. El rendimiento varía con condiciones de crecimiento y disminuye dramáticamente como hojas marchitaron, aunque las mitocondrias estructura parece mantenerse bien durante la senescencia⁹. Una de las características más importantes para obtener un buen rendimiento es el método de molienda para lisar las células para liberar las mitocondrias. Mientras que un número de aparato mecánico molienda están disponible para su compra, para Arabidopsis moler en un mortero y una maja logra consistentemente buenos resultados en términos de rendimiento, como descompone mediante lisis de las células con poco daño a los organelos. Mecánicas amoladoras son rápidos, que requieren optimización y la cantidad de molienda requerido puede variar según el tejido. Con un mortero y maja, es a menudo conveniente y más eficiente si el tejido es cortado o cortado con un cuchillo o tijeras antes de molerlo. Como se indica, todas las medidas que llevará a cabo a 4 ° C y todo el procedimiento desde el final de la molienda para obtener un pellet lavado de mitocondrias purificadas debe tomar aproximadamente 4 horas. Como rastros de detergentes u otros reactivos en tubos o vertedores gradiente pueden disminuir considerablemente el rendimiento, todos los componentes utilizados en estos procedimientos son lavados sin detergente y no usa en otros procedimientos. Finalmente, es importante que las mitocondrias están suficientemente separadas de las otras fracciones en el gradiente para que puedan ser quitados y ser lavado. Si están demasiado cerca de la parte inferior del tubo, significa que la mezcla de las soluciones ligeras y pesadas debe ser regular, para permitir que más de la solución pesada a echar antes de mezclar. Por el contrario, si la banda aparece difusa y es alta en el tubo, mezcla de necesidades que se produzca un poco antes.

El método descrito aquí se puede usar para el aislamiento de las mitocondrias de Arabidopsis flor y raíz tejido^11,12. Para las raíces, es conveniente crecer en cultivo hidropónico y necesita 100 g de peso fresco para obtener cantidades de 2 mg de mitocondrias. Para moler las raíces deben cortarse en trozos pequeños antes de moler en un mortero y una maja, y aumento de rendimientos pueden obtenerse por afilar el tejido de la raíz, en un mortero o en una licuadora. Para tejido floral donde la función mitocondrial es a menudo mejorada¹³, moler con un mortero y Maja funciona bien, pero la cantidad limitada de material significa que una gran cantidad de plantas debe ser cultivada para cosechar el tejido. Las mitocondrias han sido aisladas de una variedad de órganos de Arabidopsis usando métodos similares o ligeras modificaciones^14,15 y de arroz (Oryza sativa)¹⁶.

Las limitaciones del método descrito son i) la gran cantidad de semillas necesarias para el aislamiento mitocondrial ii) sólo tejidos específicos de Arabidopsis y el arroz en este método de aislamiento, iii) pequeñas cantidades de varios contaminantes (tales como proteínas peroxisomales) todavía existieron en las mitocondrias purificadas. Las mitocondrias obtenidas usando los métodos descritos anteriormente son convenientes para una variedad de estudios, que van desde estudios de absorción de oxígeno para análisis de espectrometría de masas cuantitativa de la abundancia de la proteína. Las mitocondrias purificadas degradadas todavía contiene pequeñas cantidades de diversos contaminantes, tales como proteínas peroxisomal³. Una comparación con las listas de organelas definidas puede usarse para determinar los cambios en las proteínas mitocondriales, como la cantidad de contaminación por proteínas no mitocondriales es pequeña (< 10%) y se comparan las muestras similares, por lo que el tipo y grado de proteínas no mitocondrial es similar. Análisis de la abundancia de proteínas por SDS-PAGE u otros enfoques basados en gel pueden llevarse a cabo con relativamente pequeñas cantidades de mitocondrias (2-20 μg), usando diferentes cantidades de mitocondrias para comprobar la linealidad de la detección de anticuerpos (figura 3). Mientras que porin (voltaje dependiente anión canal (VDAC)) se utiliza a menudo como un control de carga para la cuantificación, en nuestra experiencia la abundancia relativamente grande de esta proteína puede significar que la respuesta no es lineal si se cargan grandes cantidades de proteína en el gel , por lo que siempre debe verificar la linealidad de la respuesta de anticuerpos al utilizar estos controles de carga. La importancia de este enfoque de aislamiento de las mitocondrias es que a diferencia de los gradientes que utilizan sacarosa como el material para formar el gradiente de densidad, gradientes de densidad coloidal no requieren ajuste osmótico de las mitocondrias purificadas como se requiere con sacarosa. Esto significa que hay menos posibilidades de ruptura de las mitocondrias purificadas y después del lavado para retirar el material coloidal de la densidad, puede ser utilizados directamente en una variedad de pruebas o aplicaciones.

Manchas blancas de tejido, donde se detectan proteínas mitocondriales de extractos totales de la hoja o tejido, son un atractivo enfoque para medir la cantidad de proteínas mitocondriales en ese tejido. Dado el volumen generalmente bajo de las mitocondrias en comparación con otros organelos, la detección de la proteína mitocondrial en el tejido todo extractos deben interpretarse con cierta cautela, como proteína mitocondrial puede estar más allá de la detección en estos enfoques. Controles cuidados, donde las mitocondrias purificadas son al junto a extractos de tejido para migración idéntica y linealidad de detección, deben llevarse a cabo para tener confianza en estos enfoques.

Con la ayuda de un electrodo de oxígeno de Clark-tipo, cambios en la presión parcial de oxígeno de una solución pueden ser medidos. El electrodo real consiste en un cátodo de platino y un ánodo de plata, que son conectadas por un puente de KCl y cubierto por un papel empapado en electrolito (papel de fumar) y una membrana permeable al oxígeno (membrana de politetrafluoretileno). Una tensión de 600-700 mV conduce a la reducción de oxígeno, dando una relación lineal entre la concentración de oxígeno y la tensión. Electrodos de oxígeno están disponibles comercialmente de diferentes empresas. Cada empresa tendrá sus propias instrucciones sobre el montaje y la instalación del electrodo de oxígeno. Sin embargo, en general la plata ánodo y el cátodo de platino del disco del electrodo deben limpiarse con la ayuda de un electrodo de limpieza kit o una pluma del borrador antes del montaje. Es importante asegurarse de que no forma burbujas de aire durante el montaje (por ejemplo, entre la membrana de politetrafluoroetileno y el papel de cigarrillo). Después del montaje, el disco del electrodo debe ser conectados a la cámara con el cátodo de platino hacia arriba en la base de la cámara de reacción. La cámara sí mismo está rodeada por una chaqueta de agua asegurando el control de la temperatura. Es muy importante que la cámara siempre queda llena de agua, ya que la membrana se seca y crack lo contrario. Además, la membrana no debe ser tocada por pipetas o jeringas, al agregar compuestos a la cámara, para evitar desgarros.

Antes del ensayo, el medio de la respiración debe ser calentado a la misma temperatura que la cámara de ensayo (en la mayoría de los casos 25 ° C) y la membrana se debe equilibrar en tampón de respiración durante unos minutos. Después de ensayos de cierre el émbolo para el consumo de oxígeno, la adición de moléculas efectoras debe realizarse utilizando jeringas no desechables microlitro (por ejemplo micro jeringas) o gel desechable, puntas de pipeta de carga. Si utiliza jeringas micro, tiene que asegurarse de que la jeringa se enjuaga bien con 100% de etanol y agua entre adiciones, para evitar contaminar soluciones. Esto se aplica también para el lavado de la cámara entre mediciones. Los reactivos más utilizados en los análisis de consumo de oxígeno son solubles en agua y pueden extraerse fácilmente múltiples enjuagándose con agua (aproximadamente cinco veces) entre las mediciones. Sin embargo, algunos productos químicos utilizados para los ensayos sólo son solubles en nPG, myxothiazol y solventes orgánicos, como la antimicina A. Por lo tanto, la cámara debe enjuagarse con un disolvente orgánico (etanol al 50% (v/v)) entre ensayos para eliminar residuos de estas moléculas y luego con agua (aproximadamente 5 veces) para agotar los residuos.

Materials

ADP	Sigma-Aldrich	A2754	Chemical
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	Chemical, dissolve in ethanol
AOX antibody	from Tom Elthon		Elthon et al., 1989
Ascorbate	Sigma-Aldrich	A0157	Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp.
ATP	Sigma-Aldrich	A26209	Chemical
Bovine serum albumin (BSA)	Bovogen	BSAS 1.0	Chemical
Clarity western ECL substrate	Bio-Rad Laboratories	1705061	Chemical
Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells	Bio-Rad Laboratories	5678104	Chemical
Cyanide	Sigma-Aldrich	60178	Chemical
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C3131	Chemical
Difco Agar, granulated	BD Biosciences	214530	Chemical
Dithiotreitol	Sigma-Aldrich	D0632	Chemical
EDTA disodium salt	Sigma-Aldrich	E5134	Chemical
Gamborg B-5 Basal Medium	Austratec	G398-100L	Chemical
Gamborg Vitamin Solution (1000x)	Austratec	G219-100ML	Chemical
Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate	Bio-Rad Laboratories	1706516-2ml	Chemical
Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate	Bio-Rad Laboratories	1706515-2ml	Chemical
L-Cysteine	Sigma	C7352-100G	Chemical
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	230391	Chemical
Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS)	Austratec	M524-100L	Chemical
Myxothiazol	Sigma-Aldrich	T5580	Chemical, dissolve in ethanol
NADH	Sigma-Aldrich	N8129	Chemical
Ndufs4 antibody	from Etienne Meyer		Meyer et al., 2009
n-Propyl gallate	Sigma-Aldrich	P3130	Chemical, dissolve in ethanol
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	Chemical, colloidal density gradient
Polyvinylpyrrolidone (PVP40)	Sigma-Aldrich	PVP40	Chemical
Potassium cyanide	Sigma-Aldrich	60178	Chemical
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655	Chemical
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Chemical
Sodium chloride	Chem-Supply	SA046	Chemical
Sodium dithionite	Sigma-Aldrich	157953	Chemical
Sodium L-ascorbate	Sigma	A4034-100G	Chemical
Succinate	Sigma-Aldrich	S2378	Chemical
Sucrose	Chem-Supply	SA030	Chemical
TES	Sigma-Aldrich	T1375	Chemical
Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O)	Sigma-Aldrich	221368	Chemical
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit	Bio-Rad Laboratories	1704271	Chemical
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	X100	Chemical, detergent
Western Blocking Reagent	Sigma	11921681001	Chemical
Balance	Mettler Toledo	XS204	Equipment
Beakers	Isolab	50 mL
Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-26XP	Equipment
Centrifuge tubes	Nalgene	3117-9500	Equipment
Circulator	Julabo	1124971	Attached to oxygen electrode chamber
Conical flask	Isolab	500 mL
Dropper		3 mL
Fixed angle rotor	Beckman Coulter	JA25.5	Equipment
Funnel	Per Alimenti	14 cm	For filtering
Gradient pourer	Bio-Rad	165-4120	For preparation of gradients
Magnetic Stirrer ATE	VELP Scientifica	F20300165	Equipment
Miracloth	VWR	EM475855-1R	Filtration material
Mortar and pestle	Jamie Oliver	Granite, 6 Inch	Equipment
O2view	Hansatech Instruments		Oxygen monitoring software
Oxygraph Plus System	Hansatech Instruments	1187253	Clark-type oxygen electrode
Paintbrush	Artist first choice	1008R-12
Parafilm	Bemis	PM-996	plastic paraffin film
Peristaltic pump	Gilson	F155001	For preparation of gradients
PVC peristaltic tubing	Gilson	F117930	For preparation of gradients
Water bath	VELP Scientifica	OCB	Equipment