Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato

Resumen

El presente estudio describe un método sencillo de detectar niveles endógenos de la fosforilación Rab10 quinasa repetición rica en leucina 2.

Resumen

Mutaciones de la cinasa repetición rica en leucina 2 (LRRK2) han demostrado estar relacionados con la enfermedad de Parkinson familiar (FPD). Puesto que la activación anormal de la actividad quinasa de LRRK2 se ha implicado en la patogénesis de la EP, es esencial establecer un método para evaluar los niveles fisiológicos de la actividad quinasa de LRRK2. Estudios recientes revelaron que LRRK2 fosforila a miembros de la familia de Rab GTPase, incluyendo Rab10, bajo condiciones fisiológicas. Aunque la fosforilación de Rab10 endógeno de LRRK2 en células cultivadas podría detectarse por espectrometría de masas, ha sido difícil de detectar por immunoblotting debido a la pobre sensibilidad de anticuerpos específicos de fosforilación actualmente disponibles Rab10. Aquí, describimos un sencillo método para detectar los niveles endógenos de Rab10 fosforilación de LRRK2 basado en immunoblotting utilizando sodio electroforesis dodecyl del sulfato gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) combinado con una enlace de fosfato etiqueta (P-), que es N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- tris (pyridin-2-yl-metil) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. El presente Protocolo no sólo proporciona un ejemplo de la metodología que utiliza la etiqueta P pero también permite la evaluación de cómo mutaciones así como tratamiento y administración de inhibidor u otros factores alteran la señalización corriente abajo de LRRK2 en células y tejidos .

Introducción

PD es una de las enfermedades neurodegenerativas más comunes, que afecta predominante a las neuronas dopaminérgicas en el cerebro medio, dando por resultado la disfunción de los sistemas de motor en personas de edad avanzada¹. Mientras que la mayoría de los pacientes desarrollará PD de manera esporádica, hay familias que heredar la enfermedad. Se han encontrado mutaciones en varios genes vinculados con FPD². Uno de los genes causales de la FPD es LRRK2, en el que ocho mutaciones sin sentido (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S y I2020T) vinculadas a un dominante heredado FPD llamada PARK8 hasta ahora han sido reportados^3,4,5. Varios estudios de Asociación de genoma completo (GWAS) de pacientes con EP esporádicos también han identificado variaciones genómicas en el locus del LRRK2 como factor de riesgo para PD, lo que sugiere que la anormalidad en la función de LRRK2 es una causa común de la neurodegeneración en los esporádicos y PARK8 FPD^6,7,8.

LRRK2 es una proteína grande (2.527 aminoácidos) que consiste en un dominio repetición rica en leucina, un Ras de unión a GTP dominio de proteínas complejas (ROC), un C-terminal de dominio, un dominio de la cinasa de serina/treonina proteína y WD40 dominio repetición⁹ROC (CDR). Las ocho mutaciones FPD localizar en estos dominios funcionales; N1437H y R1441C/G/H/S en el dominio ROC, Y1699C en el dominio de la COR, G2019S y I2020T en el dominio de la cinasa. Puesto que la mutación G2019S, que es lo más frecuentemente encontrado mutación en PD pacientes^10,11,12, aumenta la actividad de la quinasa de LRRK2 en 2-3 veces en vitro¹³, se presume que el aumento anormal de fosforilación de los substratos de LRRK2 es tóxico para las neuronas. Sin embargo, ha sido imposible estudiar si se altera la fosforilación de sustratos fisiológicamente relevantes de LRRK2 en pacientes con EP familiar/esporádico debido a la falta de métodos de evaluación en muestras derivadas.

Fosforilación de la proteína es generalmente detectada por immunoblotting o análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) usando los anticuerpos específicamente reconociendo el estado fosforilado de proteínas o por análisis de espectrometría de masa. Sin embargo, la estrategia anterior a veces no se puede aplicar debido a las dificultades en la creación de anticuerpos específicos de fosforilación. Etiquetado metabólico de las células con fosfato radiactivo es otra opción para examinar niveles fisiológicos de la fosforilación de cuando los anticuerpos específicos de fosforilación no están disponibles. Sin embargo, requiere una gran cantidad de materiales radiactivos y por lo tanto implica algunos equipos especializados para protección radiológica¹⁴. El análisis de espectrometría de masa es más sensible frente a estos métodos inmunoquímicos y llegó a ser popular en el análisis de la fosforilación de la proteína. Sin embargo, la preparación de la muestra es desperdiciador de tiempo y costosos instrumentos son necesarios para el análisis.

Un subconjunto de la familia de Rab GTPase como Rab10 y Rab8 fue divulgado recientemente como sustratos fisiológicos directos para LRRK2 basan en el resultado de un análisis a gran escala phosphoproteomic del¹⁵. Entonces hemos demostrado que la fosforilación Rab10 fue aumentada por mutaciones de la FPD en fibroblastos embrionarios de ratón y en los pulmones de knockin ratones¹⁶. En este informe, optamos por emplear una electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE)-método en el cual una molécula de P-tag es co polimerizada en geles de SDS-PAGE (etiqueta P SDS-PAGE) para la detección de los niveles endógenos de la fosforilación Rab10, basado en porque todavía le faltaba un anticuerpo altamente sensible específico para Rab10 fosforilada. Nosotros hemos podido detectar la fosforilación de Rab8 endógeno debido a la pobre selectividad de anticuerpos disponibles para Rab8 total. Por lo tanto, decidimos enfocarnos en la fosforilación Rab10. LRRK2 fosforila Rab10 en Thr73 ubicación en el centro de la región altamente conservada "interruptor II". Conservación de los sitios de fosforilación entre proteínas Rab podría ser una de las razones por qué anticuerpos phosphospecific reconociendo distintas proteínas Rab son difíciles de hacer.

La fosforilación de Rab8A por LRRK2 inhibe la Unión de Rabin8, un factor de intercambio del nucleótido guanina (GEF) que activa Rab8A intercambiando el PIB consolidado con GTP¹⁵. Fosforilación de Rab10 y Rab8A por LRRK2 también inhibe la Unión de los inhibidores de la disociación de PIB (GDIs), que son esenciales para la activación de las proteínas Rab extrayendo proteínas Rab PIB-limite de membranas¹⁵. Colectivamente, se presume que la fosforilación de proteínas Rab por LRRK2 les impide la activación aunque el mecanismo molecular exacto y consecuencias fisiológicas de la fosforilación no quedan claros.

P-etiqueta SDS-PAGE fue inventado por Kinoshita et al. en 2006: en este método, acrilamida covalente fue juntada con la etiqueta P, una molécula captura de fosfatos con alta afinidad, que copolymerized en SDS-PAGE gel¹⁷. Porque las moléculas de P etiqueta en un gel de SDS-PAGE selectivamente retardan la movilidad electroforética de las proteínas fosforiladas, etiqueta P SDS-PAGE puede separar proteínas fosforiladas de los no-phosphorylated (figura 1). Si el proteína de interés es fosforilado en residuos múltiples, se observará una escalera de bandas correspondientes a las formas fosforiladas diferencialmente. En el caso de Rab10, observamos sólo una banda cambiada de puesto, lo que indica que Rab10 es fosforilado en Thr73. La gran ventaja de la etiqueta P SDS-PAGE en immunoblotting con anticuerpos específicos de fosforilación es que Rab10 fosforilada puede detectarse por immunoblotting con fosforilación-anticuerpos inespecíficos (es decir, reconocimiento total Rab10) Tras ser trasladado en las membranas, que suele ser más específicos, sensibles y disponibles de fuentes comerciales y académico. Otra ventaja de usar la etiqueta P SDS-PAGE es que se puede obtener una estimación aproximada de la estequiometría de la fosforilación, que es imposible por immunoblotting con anticuerpos específicos de fosforilación o por el etiquetado metabólico de las células con radiactivo fosfatos.

Aparte del uso de acrilamida etiqueta P barata y algunas modificaciones menores relacionados con ella, el método actual de detección de Rab10 fosforilación de LRRK2 sigue un protocolo general de immunoblotting.Por lo tanto, debe ser sencillo y fácilmente ejecutable en cualquier laboratorios donde immunoblotting es una práctica habitual, con cualquier tipo de muestras incluyendo proteínas purificadas, lysates de la célula y homogenados de tejido.

Protocolo

1. preparación para la SDS-PAGE de etiqueta P

1. Quitar y desechar el medio de los platos de 10 cm en la que las células se cultivan utilizando una aspiración y lavar las células con tamponada con fosfato solución salina de 5 mL Dulbecco (DPBS) por primer DPBS agregando al lado de los platos para evitar perturbar la capa de células y manualmente los platos detrás de la roca y varias veces.
2. Retire y deseche la DPBS mediante una succión y añadir 2 mL de tripsina 0.25% (p/v) diluido en DPBS y con cuidado los platos para cubrir la capa de células. Poner los platos en un incubador de CO₂ (37 ° C, aire humidificado, 5% CO₂) durante 5 minutos.
3. Después de su uso y con una pipeta desechable para romper las células separadas, recoger la suspensión de células en un tubo de 15 mL y medir la densidad de células usando un hematocitómetro bajo un microscopio¹⁸.
4. Diluir las células 2,5 × 10⁵ células/mL con medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplidas con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina y 100 de μg/mL estreptomicina. Añadir 2 mL (5 × 10⁵ células) de la suspensión celular diluido en cada pocillo de las placas de 6 pozos.
5. Crecen las células durante la noche en un incubador de CO₂ (37 ° C, aire humidificado, 5% CO₂).
6. Transfección en células HEK293
   Nota: Si la fosforilación de Rab10 endógeno debe ser examinado, proceda al paso 1.7. Plásmidos utilizados en este protocolo se pueden obtener de los autores a petición. Véase Tabla de materiales para obtener información breve y Figura S1 para su DNA secuencias.
   1. Alícuota a 200 μL de DMEM en tubos de 1,5 mL.
   2. A cada tubo, agregue ambos 0.266 μg (concentración final de 1.33 μg/mL) de un plásmido de codificación HA-Rab10 y 1.066 μg (concentración final de 5.33 μg/mL) de un plásmido codificación 3 × LRRK2 bandera de stocks de plásmido de 500 μg/mL. Luego añadir 4 μL de solución 1 mg/mL de polietilamina (disuelto en 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.0) y mezclar inmediatamente la solución con un vórtex durante 5 s.
   3. Deje que los tubos reposar a temperatura ambiente durante 10 min y añadir el contenido de un tubo de gota a gota a un bien con una micropipeta. Manualmente y suavemente rock las placas de cultivo y hacia atrás varias veces para dejar la mezcla de transfección difusa uniformemente a lo largo del pozo.
7. Que las células crecen para otro 24-36 h en un incubador de CO₂ (37 ° C, aire humidificado, 5% CO₂).
8. Si la fosforilación de Rab10 endógeno debe ser examinado, tratar células con y sin inhibidores de LRRK2 para 1 h antes de la lisis de las células.
   1. Preparar las soluciones madre de LRRK2 inhibidores disolviendo los inhibidores en dimetil sulfóxido (DMSO) al 10 mM. Se recomienda utilizar MLi-2 y GSK2578215A, que son altamente específicos y potentes inhibidores de LRRK2. Almacene las soluciones stock a-80 ° C.
   2. Preparar las acciones de trabajo de los inhibidores diluyendo las soluciones stock con DMSO: por MLi-2, preparar 10 μm y 30 LRRK2 endógeno y sobreexpresado, respectivamente. Para GSK2578215A, prepare 1 mM y 3 mM para LRRK2 endógeno y sobreexpresado, respectivamente.
   3. Añadir 2 μl de las acciones de trabajo de MLi-2 o GSK2578215A a la mitad de uno con una micropipeta y con cuidado la placa manualmente hacia adelante y hacia atrás varias veces para dejar los inhibidores difusa uniformemente a lo largo del pozo.
   4. Añadir 2 μl de DMSO a un pozo diferente como un control negativo en una manera similar a los del inhibidor en paso 1.8.3.
   5. Poner las placas a la incubadora y las células de 1 h de la cultura.
9. Lisar las células.
   1. Poner las placas de hielo. Retire y deseche los medios de comunicación. Lavar las células por primera agregando 2 mL DPBS al lado de los platos para evitar molestar a la célula de la capa y roca manualmente los platos hacia adelante y hacia atrás varias veces.
   2. Quite y deseche la DPBS y agregue a la células 100 μl del buffer de lisis (50 mM Tris-HCl de pH 7,5, 1% (v/v) polyoxyethylene(10) Octylpheny éter, 1 mM EGTA (glicol de etileno-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-ácido etilendiaminotetraacético), ortovanadato de sodio 1 mM, 50 mM fluoruro de sodio, glicerofosfato-β de 10 mM, pirofosfato de sodio 5 mM, 0,1 μg/mL microcistina-LR, 270 mM sacarosa, cóctel del inhibidor de la proteasa).
   3. Inclinación de las placas de hielo y raspe las células usando un raspador celular reunir tanto celular lysate como sea posible. Recoger los lisados utilizando una micropipeta en tubos de 1,5 mL (previamente enfriados en hielo).
      PRECAUCIÓN: Microcistina-LR puede ser fatal si se traga o contacto con la piel.
10. Dejar los tubos reposar en hielo durante 10 min para lisis completa. Aclarar los lysates de la célula por centrifugación (20.000 × g, 10 min a 4 ° C) y transferir el sobrenadante a nuevos tubos de 1.5 mL previamente enfriados en hielo.
11. Medir la concentración de proteína (μg/μl) de los lisados despejados por el análisis de Bradford.
    1. Preparar albúmina de suero bovino (BSA) normas (0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 mg/mL) diluyendo la solución con agua destilada. Diluir los lysates de la célula autorizado por 20-fold con agua destilada.
    2. Poner 5 μL/pocillo de las normas de la BSA, blanco (agua destilada) y cada célula diluido lisado en una placa de 96 pocillos por triplicado.
    3. Añadir 150 μL/pocillo del reactivo de ensayo de Bradford, utilizando una micropipeta de 12 canales y dejar la placa reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    4. Medir la absorbancia a 595 nm en un lector de placas y comparar con estándares de BSA.
12. 100 μl de las muestras se preparan para SDS-PAGE. La concentración de proteína de las muestras es de 1 μg/μl para HA-Rab10 sobreexpresado y 2 μg/μl de Rab10 endógena.
    1. Las concentraciones cuantificadas de paso 1.11.4, calcular el volumen (μL) de los lysates de la célula equivalente a 100 μg (sobreexpresada HA-Rab10) o 200 μg (Rab10 endógena) dividiendo la cantidad de proteína (μg 100 o 200 μg) por la concentración de proteína de lisados (μ g/μL).
    2. Añada 25 μl del tampón de muestra de SDS-PAGE de Laemmli 4 × (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 8% (p/v) de SDS, glicerol 40% (v/v), azul de bromofenol 0,02% (w/v), 4% (v/v) β-mercaptoetanol) a nuevos tubos de 1,5 mL almacenados temperatura ambiente.
    3. Agregar el volumen calculado de la célula lisados a cada tubo y mezclan con un vórtex durante 5 s a temperatura ambiente.
    4. Llevar el volumen total a 100 μl con el tampón de lisis y mezclar con un vórtex durante 5 s a temperatura ambiente.
13. Suplemento con 10 mM MnCl₂ para calmar al agente quelante. Añadir 1 μl de 500 mM MnCl₂. Mezclar con un vórtex durante 5 s a temperatura ambiente.
    Nota: Las muestras que contienen MnCl₂ pueden no ser convenientes para el normal de SDS-PAGE.

Este paso es necesario debido a la presencia del agente quelante (como el ácido etilendiaminotetracético (EDTA), EGTA, etc.) en el buffer de lisis. De lo contrario, Mn^{2 +} iones juntados a etiqueta P acrilamida serán disociados por los agentes quelantes y SDS-PAGE de etiqueta P no funcionará correctamente.

Hervir las muestras a 100 ° C por 5 min y almacenar las muestras por debajo de-20 ° C hasta su uso. Las muestras cocidas pueden guardarse hasta al menos 6 meses.

2. fundición geles de SDS-PAGE de etiqueta P

Nota: Geles deben hacerse el mismo día como correr los geles. Los geles pueden realizarse bajo condiciones de luz ambiente.

1. Preparar solución stock de acrilamida 5 mM etiqueta P disolviendo primero la 10 mg de polvo sólido etiqueta P acrilamida completamente con 100 μl de metanol y luego traer a 3.3 mL añadiendo agua bidestilada.
   Nota: La acrilamida de la etiqueta P es sensible a la luz. La solución preparada debe almacenarse en la oscuridad a 4 ° C hasta su uso.
2. Placas limpio sencillo y entalladas rociar etanol al 70% y limpiándola con una toalla de papel. Montar las placas de gel. Las dimensiones de las placas de gel usadas en este protocolo particular son 80 o 100 mm de largo por 100 mm de ancho. Separadores de silicona limpia se ponen entre el llano y con muescas de la placas y las placas ensambladas se sujetan con clips binder.
   Nota: Puede utilizarse cualquier tipo de placas de gel de SDS-PAGE ordinario.
3. Poner un peine que utiliza (17-pozo canutillo) en las placas de gel montado y marca en la placa la posición de la parte inferior de los pocillos del gel con un marcador permanente.
4. Preparar 10 mL de mezcla de gel de acrilamida de 10% (10% (p/v) acrilamida (acrylamide:bis-acrilamida = 29: 1), 375 mM Tris-HCl (pH 8.8), 0.1% (p/v) de SDS) en un tubo de 15 mL.
   Nota: La óptima concentración de acrilamida puede variar dependiendo de los reactivos usados. Tetramethylethylenediamine (TEMED) y amonio persulfato (APS) no se debe agregar en este punto.
5. Añadir 100 μl de acrilamida de etiqueta P de 5 mM y 10 μl de 1 M MnCl₂ soluciones en concentraciones finales de 50 μm y 100 μm, respectivamente.
   Nota: Las concentraciones óptimas de la etiqueta P acrilamida y MnCl₂ también pueden variar dependiendo de los reactivos usados.
6. Añadir 15 μl de TEMED a la mezcla del gel a una concentración final de 0,15% (v/v) y luego 50 μl de 10% (p/v) APS a una concentración final de 0.05% (w/v). Mezclar bien agitando suavemente el tubo para 5 s y verter en las placas montadas inmediatamente hasta una altura que es 2 mm más abajo que la posición marcada en el paso 2.3.
7. Suavemente de la capa 2-propanol en la solución de gel para aplanar la parte superior del gel de separación.
8. Dejar los geles reposar 30 min a temperatura ambiente. No es necesario proteger a los geles de la luz.
   Nota: Puede tardar más tiempo para los geles fijar bajo temperatura ambiente frío. Desgasificación de la mezcla de gel antes de agregar el TEMED y el APS ayuda a acelerar este paso. Para ello, la mezcla de gel se puede preparar en un matraz Erlenmeyer de 100-200 mL conectado a una succión. Desgasificar la solución durante 10 minutos.
9. Retire la capas 2-propanol absorbiendo con una toalla de papel.
10. Lavado del espacio superior de los geles por llenar el espacio con agua destilada de una botella de lavado y descarte el agua vertiendo apagado en Cuenca. Repita el lavado 3 veces.
11. Eliminar el agua residual que queda en el espacio superior de los geles absorbiendo con una toalla de papel.
12. Preparar 3 mL de mezcla de gel de acrilamida de 4% (4% (w/v) acrilamida (a: crylamide:bis-acrilamida = 29: 1), 125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 0.1% (p/v) de SDS) en un tubo de 15 mL.
    Nota: No agregue etiqueta P acrilamida o MnCl₂ solución a la mezcla de gel de apilamiento.
13. Agregar 7.5 μl de TEMED y 24 μl de 10% (p/v) APS en concentraciones finales de 0.25% (v/v) y 0.08% (w/v), respectivamente. Mezclar bien agitando suavemente el tubo para 5 s y vierta la mezcla en la parte superior del gel de separación. Inmediatamente poner peines apropiados (canutillos de plástico de 17 pozos que acomodar hasta 25 μl de las muestras, por ejemplo).
14. Dejar los geles reposar 30 min a temperatura ambiente. No es necesario proteger a los geles de la luz. Después el gel de apilamiento, ejecutarlos sin almacenaje adicional.

3. SDS-PAGE e Immunoblotting

1. Quitar los peines de los geles. Luego retire los espaciadores de silicio y luego los clips de los geles.
2. Poner los geles fundidos en gel tanques y arreglar el gel al tanque de sujeción con los clips de la carpeta.
3. Vierta el buffer corriente (25 mM Tris, 192 mM glicina, 0.1% (p/v) de SDS) en la parte inferior y superior de los geles. Limpieza pozos por descarga el buffer corriente utilizando una jeringa de 5 mL y una aguja de 21G para eliminar piezas de gel.
4. Eliminar burbujas de aire desde el espacio de la parte inferior de los geles con una aguja doblada unida a una jeringa. Para hacer una aguja doblada, doble una aguja de 21G en medio de la aguja manualmente para que el ángulo entre la punta y la base de la aguja se convierte en 30-45 °.
5. Desactivación de precipitados causados por la adición de MnCl₂ a 20.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente para obtener muestras de claras.
6. Carga de 10 μg proteínas para la detección de la fosforilación de Rab10 sobreexpresado y 30 μg proteínas de Rab10 endógena.
   Nota: Es crítico para cargar un volumen igual de muestras en todos los pocillos. Calles vacías deben colocarse con el tampón de muestra de 1 × Laemmli SDS-PAGE. Si las muestras contienen MnCl₂, añadir la misma concentración de MnCl₂ para las muestras simuladas.
7. Bien cargado con un marcador de peso molecular (MWM) debería también complementarse con tampón de SDS-PAGE de Laemmli 1 × así que el volumen de muestras cargados es igual en todos los pocillos.
   Nota: Una vez más, si las muestras contienen MnCl₂, añadir la misma concentración de MnCl₂ al MWM. Como alternativa, puede usarse un MWM libre de EDTA.
8. Correr los geles a 50 V para apilar (aproximadamente 30 minutos) hasta que el frente de tinte se cruza en el gel de separación.
9. Después de las muestras de la pila, cambiar el voltaje a 120 V para la separación hasta que la parte delantera del tinte llega a la parte inferior de los geles (aproximadamente 50 y 80 min de 80 y 100 mm de longitud y geles, respectivamente).
   Nota: Se espera que el patrón de migración de la MWM sea distinto en geles de SDS-PAGE normales. No debe utilizarse para estimar el peso molecular de proteínas en geles de SDS-PAGE de etiqueta P pero puede utilizarse para comprobar la reproducibilidad de los geles de la etiqueta P. Consulte la discusión para más detalles.
10. Lave los geles para quitar MnCl₂ de los geles.
    1. Vierta a la transferencia búfer (48 mM Tris, 39 mM glicina, 20% (v/v) de metanol) que contiene 10 mM EDTA y 0.05% (w/v) SDS en un recipiente (por ejemplo, grandes barcos de pesaje).

El volumen del buffer debe ser suficiente para cubrir un gel.

Retire el gel de separación de las placas de gel y poner un gel en un envase. Descarte el gel de apilamiento.

Deja los geles en un agitador oscilante (~ 60 rpm) durante 10 min a temperatura ambiente.

Repita los pasos de lavado en total 3 veces.
Nota: Utilice buffer fresca para cada lavado.

Lavar el gel una vez por 10 min con el tampón de transferencia que contiene 0,05% (p/v) de SDS para eliminar el EDTA. El volumen del buffer debe ser suficiente para cubrir un gel.

Electro-transferencia a nitrocelulosa o del polivinilideno difluoruro (PVDF) las membranas utilizando tanques de mojado.

1. Coloque un papel de filtro (10 x 7 cm) sobre una almohadilla de esponja para la transferencia. Coloque el gel en el papel de filtro. Asegúrese de que no hay burbujas de aire entre el papel de filtro y el gel.
2. Poner una membrana (10 x 7 cm) sobre el gel y asegúrese de que no hay burbujas de aire entre el gel y la membrana.
3. Poner otro papel de filtro (10 x 7 cm) en la membrana y, una vez más, asegúrese de que no hay burbujas de aire entre la membrana y el papel de filtro.
4. Coloque otra almohadilla de esponja en el papel de filtro. Poner la pila de papeles de filtro de membrana en un cassette para la transferencia.
5. Poner el cassette en un tanque de la transferencia, asegúrese de que la membrana se encuentra entre el gel y el ánodo cargado positivamente.
6. Conecte el tanque a una fuente de alimentación y poner el depósito en una caja de espuma de estireno llenada con agua helada. Iniciar transferencia a 100 V durante 180 minutos.
   Nota: Traslado prolongado es necesario puesto que la transferencia de proteínas de geles de SDS-PAGE de etiqueta P no son tan eficientes que de normales geles de SDS-PAGE. Enfriamiento eficiente es esencial para evitar que se derritan los geles durante la transferencia.

Verificar la transferencia

1. Quite las membranas de los geles con unas pinzas y remoje las membranas en una solución de Ponceau S (0.1% (peso/volumen) Ponceau S, ácido acético al 5% (v/v)) para teñir proteínas transferidas en las membranas en un recipiente de plástico. El volumen de la solución debe ser suficiente para cubrir una membrana.
2. Incubar las membranas durante 1 min a temperatura ambiente, meciendo manualmente.
   Nota: Una escalera de bandas debe ser visible en cada carril.
3. Recoger la membrana de la solución de tinción con pinzas y ver si la escalera de bandas tiene patrón uniforme y la intensidad en cada carril donde las muestras hayan sido cargadas.
4. Después de comprobar la coloración, retirar la solución de tinción y añadir tampón TBST (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) polyoxyethylenesorbitan monolaurato). El volumen del buffer debe ser suficiente para cubrir una membrana.
   Nota: La solución de Ponceau S puede recogerse y reutilizarse varias veces.
5. Roca de las membranas en TBST en un agitador oscilante (~ 60 rpm) a temperatura ambiente hasta que no queden bandas visibles en las membranas.
6. Repetir el lavado con TBST fresco durante 5 minutos.

Retire y deseche el TBST. Bloque añadiendo 5% (p/v) de leche descremada disuelta en TBST y oscilante en un agitador (~ 60 rpm) durante 1 h a temperatura ambiente. El volumen de la solución de bloqueo debe ser suficiente para cubrir una membrana.

Preparar soluciones de anticuerpo primario mediante la dilución de anticuerpos primarios (anti-Rab10 para Rab10 endógeno) y el anticuerpo anti-HA para HA-Rab10 sobreexpresado en 10 mL por cada membrana de la solución de bloqueo (véase Tabla de materiales para las concentraciones).

Retire y deseche la solución de bloqueo y añadir el anticuerpo primario. Incubar las membranas en un agitador oscilante (~ 60 rpm) durante una noche a 4 ° C.

Retirar la solución de anticuerpo primario y añadir TBST para lavar las membranas. El volumen del buffer debe ser suficiente para cubrir una membrana.

Incubar las membranas durante 5 min en un agitador oscilante (~ 60 rpm) a temperatura ambiente. Repita el lavado (paso 3.16) en total 3 veces con TBST fresco cada vez.

Preparar soluciones de anticuerpo secundario por dilución del anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano (HRP) en 10 mL por cada membrana de la solución de bloqueo. Uso de anti-IgG anticuerpos marcados con HRP para membranas sondeadas con el anticuerpo anti-Rab10 y anticuerpos de IgG anti-ratón marcado con HRP para aquellos sondeado con el anti-HA anticuerpo (véase Tabla de materiales para la concentración).

Retire y deseche el TBST después del tercer lavado y añadir la solución de anticuerpo secundario. Incubar las membranas en un agitador oscilante (~ 60 rpm) durante 1 h a temperatura ambiente.

Lavar las membranas en TBST durante 10 minutos, repita el lavado paso en total 3 veces, similares al paso 3.17.

Desarrollo de las membranas mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL).
Nota: Tiempo de exposición puede variar dependiendo de la solución de ECL y el sistema utilizado para la detección de la quimioluminescencia.

1. Activar un sensor equipado con un dispositivo de carga acoplada (CCD) de cámara y un ordenador conectado al reproductor de imágenes. Inicie el software de control para el reproductor de imágenes. Espere hasta que alcanza la temperatura de la cámara CCD-25 ° C.
2. Poner 1 mL de la solución de ECL para una membrana en una envoltura de plástico extendido en un banco.
3. Poner una membrana gel hacia arriba en la solución de ECL y entonces rápidamente Dale la vuelta para que ambos lados de la membrana están cubiertos con la solución.
4. Recoger la membrana y escurrir dejando a un lado del toque de la membrana una toalla de papel para 5 s.
5. Poner la membrana entre películas claro (por ejemplo, bolsas de papel claro).
   Nota: No se recomienda papel plástico para envolver las membranas. Las películas claro utilizadas para envolver la membrana deben ser tan plano como sea posible sin arrugas visibles para evitar el fondo irregular.
6. Coloque la membrana sobre una bandeja negra. Poner la bandeja en el reproductor de imágenes y cierre la puerta.
7. Haga clic en el botón de "Enfoque" en la ventana del software de control. Comprobar que la membrana esté correctamente posicionada. Haga clic en el botón "Volver".
8. Seleccione "Precisión" para "Tipo de exposición". Seleccione "Manual" para "Tiempo de exposición" y establezca el tiempo de exposición en 1 s.
9. Seleccione "Alto" para la "Resolución de sensibilidad". Dejar "Añadir la digitalización imagen" desactivada. Haga clic en el botón "Start" para tomar una imagen.
10. Guardar la imagen que apareció en la pantalla de la computadora como un archivo TIFF.
11. Repetir la toma de imágenes con el tiempo de exposición de 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 s y 180 s. Cuando se toma la última imagen, compruebe "Añadir la digitalización imagen" por lo que la imagen digital, no la quimioluminescencia, de la membrana puede tomarse simultáneamente.
12. Seleccionar la mejor imagen con mayor rango dinámico y sin ninguna saturación píxeles (mostrados en rojo) en los grupos de interés.
    Nota: Las películas de radiografía convencional también pueden utilizarse para detección¹⁹.

Resultados

Sistema de sobreexpresión: Fosforilación de la HA-Rab10 por 3 × bandera-LRRK2 en HEK293 células:

Las células HEK293 fueron transfectadas con 0.266 μg de HA-Rab10 tipo de salvaje y 1.066 μg 3 × bandera LRRK2 (mutante de tipo salvaje, quinasa inactiva (K1906M), o mutantes FPD). Fosforilación de Rab10 fue examinada por etiqueta P SDS-PAGE seguido immunoblotting usando un anti-HA anticuerpo (figura 2). 10 ...

Discusión

Aquí, describimos un método robusto y fácil de detectar Rab10 fosforilación de LRRK2 nivel endógeno basado en la metodología de la etiqueta P. Porque el anticuerpo actualmente disponible contra Rab10 fosforilada sólo funciona con las proteínas sobreexpresadas¹⁵, el presente método utiliza la etiqueta P SDS-PAGE es la única manera de evaluar los niveles endógenos de la fosforilación Rab10. Por otra parte, el presente método permite la estimación de la estequiometría de la fosforilación en las célul...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
solución salina tamponada >con
fosfato (DPBS)			150 mM de NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 en agua MilliQ y esterilizado en autoclave
Cloruro de sodio	Nacalai Tesque	31320-34
Hidrógeno disódico de sodiofosfato 12-agua	Wako	196-02835
Cloruro de potasio	Wako	163-03545
Fosfato de dihidrógeno de potasio	Wako	169-04245
2,5% Tripsina (10X)	Sigma-Aldrich	T4549	Diluido 10 veces con DPBS estéril para la preparación de la solución
de trabajoDulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Wako	044-29765
Suero fetal bovino	BioWest	S1560	Inactivado por calor a 56 & grados; C por 30 min
Penicilina-Estreptomicina (100X)	Wako	168-23191
HEPES	Wako	342-01375
Hidróxido de sodio	Wako	198-13765
Polietilenimina HCl MAX, Lineal, Mw 40,000 (PEI MAX 40000)	PolySciences, Inc.	24765-1	La solución madre se preparó en 20 mM de HEPES-NaOH pH 7,0 a 1 mg/mL y luego se ajustó el pH a 7,0 con NaOH
Dimetilsulfóxido Wako		045-28335
Tris	STAR	RSP-THA500G
Ácido clorhídrico	Wako	080-01066
Polioxietileno(10) Octilfenil éter	Wako	160-24751	equivalente a Triton X-100
Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA)	Wako	346-01312
Ortovanadato de sodio(V)	Wako	198-09752
Fluoruro de sodio	Kanto Chemical	37174-20
β-Ácido glicerofosfórico Sal disódica Pentahidratado	Nacalai Tesque	17103-82
Sodio pirofosfato decahidratado	Kokusan Chemical 2113899
Microcistina-LR	Wako	136-12241
	Sacarosa Wako	196-00015
Cóctel completo de inhibidores de proteasas sin EDTA	Roche	11873580001	Disuelva una tableta en 1 ml de agua, que se puede almacenar a -20 & grados; C durante un mes. Úselo en dilución 1:50 para la lisis celular
Pierce Coomassie (Bradford) Kit de ensayo de proteínas	Thermo Fisher Scientific	23200
Dodecil sulfato de sodio	Nacalai Tesque	31607-65
Glicerol	Wako	075-00616
Azul de bromofenol	Wako	021-02911
β-mercaptoetanol	Kanto Chemical	25099-00
Etanol	Wako	056-06967
Metanol	Wako	136-01837
Acrilamida de unión a fosfato	Wako	AAL-107	Acrilamida P-tag
40% (p/v) solución de acrilamida	Nacalai Tesque	06119-45	Acrilamida:Bis = 29:1
Tetrametiletilendiamina (TEMED)	Nacalai Tesque	33401-72
persulfato de amonio (APS)	Wako	016-08021	10% (p/v) se preparó disolviendo el polvo de persulfato de amonio en agua MilliQ
2-propanol	Wako	166-04831
Cloruro de manganeso tetrahidratado	Sigma-Aldrich	M3634
Precision Plus Protein Prestained Standard	Bio-Rad	1610374, 1610373, 1610377	Marcador de peso molecular utilizado en el protocolo
WIDE-VIEW Marcador de tamaño de proteína preteñido III	Wako	230-02461
Glycine	Nacalai Tesque	17109-64
Amersham Protran NC 0.45	GE Healthcare	10600007	Membrana de nitrocelulosa
Durapore Filtro de membrana	EMD Millipore	GVHP00010	PVDF membrana
Papeles de filtro No.1	Advantec	00013600
Ponceau S	Nacalai Tesque	28322-72
Ácido acético	Wako	017-00251
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	polioxietilenosmonolaurato de orbitán
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Wako	345-01865
Leche desnatada en polvo	Laboratorios Difco	232100
Immunostar	Wako	291-55203	Solución ECL (Sensibilidad normal)
Immunostar LD	Wako	290-69904	Solución ECL (Alta sensibilidad)
Solución de tinción CBB	casera		1 g CBB R-250, 50% (v/v) de metanol, 10% (v/v) de ácido acético en 1 L de agua MilliQ
CBB R-250	Wako	031-17922
CBB decolorante solución	casera		12% (v/v) de metanol, 7% (v/v) de ácido acético en 1 L MilliQ agua
Nombre	Empresa	>Número de catálogo	>Comentarios
>Anticuerpos
anti-HA anticuerpo	Sigma-Aldrich 11583816001		Se utiliza a 0,2 μ g/mL para inmunotransferencia.
anti-Rab10 anticuerpo	Cell Signaling Technology	#8127	Utilizado a 1:1000 para inmunotransferencia. La especificidad fue confirmada por CRISPR KO en Ito et al., Biochem J, 2016.
anti-pSer935 anticuerpo	Abcam	ab133450	Utilizado en 1 μ g/mL para inmunotransferencia.
anticuerpo anti-LRRK2	Abcam	ab133518	Utilizado en 1 μ g/mL para inmunotransferencia.
anti-&alfa;-tubulina anticuerpo	Sigma-Aldrich	T9026	Utilizado en 1 μ g/mL para inmunotransferencia.
anticuerpo anti-GAPDH	Santa-Cruz	sc-32233	Utilizado a 0.02 μ g/mL para inmunotransferencia.
Peroxidasa AffiniOvejas puras anti-ratón IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	515-035-003	Utilizado a 0,16 μ g/mL para inmunotransferencia.
Peroxidasa AffiniCabra pura anti-conejo IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-003	Utilizado a 0.16 μ g/mL para inmunotransferencia.
Name	Company	Número de catálogo	Comments
>InhibitorsGSK2578215A
	de MedChem Express	HY-13237	se preparó en DMSO a 10 mM y se almacenó a -80 ° C
MLi-2	Proporcionado por el Dr. Dario Alessi (Universidad de Dundee)		La solución madre se preparó en DMSO a 10 mM y se almacenó a -80 ° C
Nombre	Company	Número de catálogo	Comments
Plásmidos
Rab10/pcDNA5 FRT A HA	Proporcionado por el Dr. Dario Alessi (Universidad de Dundee)		Este plásmido expresa Rab10 humano marcado con HA amino-terminal.
LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10	Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)		Ito et al., Biochemistry, 46: 1380– 1388 (2007). Este plásmido expresa LRRK2 humano de tipo salvaje marcado con amino-terminal 3xFLAG.
LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10	Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)		Ito et al., Biochemistry, 46: 1380– 1388 (2007). Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante inactivo K1906M quinasa marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.
LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10			Este documento. Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante N1437H FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.
LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10	Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante R1441C FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.
LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10	Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante R1441G FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.
LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10	Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante R1441H FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.
LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10			Este documento. Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante R1441S FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.
LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10	Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante Y1699C FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.
LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10	Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante G2019S FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.
LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10	Proporcionado por el Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). Este plásmido expresa aminoterminalmente el mutante I2020T FPD marcado con 3xFLAG de LRRK2 humano.
Nombre	Company	Número de catálogo	Comentarios
Equipos
CO2 incubadora	Thermo Fisher Scientific	Forma Series II 3110 Pipeta automática con camisa
	Drummond	Pipet-Aid PA-400
Micropipeta P10	Nichiryo	00-NPX2-10	0.5– 10 μ
L Micropipeta P200	Nichiryo	00-NPX2-200	20– 200 μ L
Micropipeta P1000	Nichiryo	00-NPX2-1000	100– 1000 μ L
Puntas para micropipeta P10	STAR	RST-481LCRST	Puntas estériles
para micropipeta P200	FUKAEKASEI	1201-705YS Puntas	estériles
para micropipeta P1000	STAR	RST-4810BRST	Pipeta estéril
disponente de 5 mL	Greiner	606180	Pipeta estéril
desgastable de 10 mL	Greiner	607180	Pipeta estéril
de 25 mL disporsable	Falcon		357535 Hematocitómetro estéril
	Sunlead Glass	A126	Microscopio Neubeuer mejorado
	Olympus	CKX53
Platos de 10 cm	Falcon	353003	Para cultivo
de tejidos Placas de 6 pocillos	AGC Techno Glass	3810-006	Para cultivo
de tejidosMezclador de vórtice	Scientific Industries	Vortex-Genie Rascadores de 2
celdas	Sumitomo Baquelita	MS-93100
Tubos de 1,5 mL	STAR	RSV-MTT1.5
Tubos de 15 mL	AGC Techno Glass	2323-015
Tubos de 50 mL AGC	Techno Glass	2343-050
Centrífugas	TOMY	MX-307
Placas de 96 pocillos	Greiner	655061	No apto para cultivo de tejidos
Lector de placas	Molecular Devices	SpectraMax M2e
SDS– Tanques PAGE	Nihon Eido	NA-1010
Tanques de transferencia	Nihon Eido	NA-1510B
Placas de gel (con muescas)	Nihon Eido	NA-1000-1
Placas de gel (lisas)	Nihon Eido	NA-1000-2
Espaciadores de silicio	Nihon Eido	NA-1000-16
Peines de 17 pocillos	Nihon Eido	Hecho a medida
Pinzas de carpeta	Nihon Eido	NA-1000-15
5 mL jeringa	Terumo	SS-05SZ
21G	Terumo	NN-2138R
Power Station 1000 VC	ATTO	AE-8450 Fuente de	alimentación para SDS– PÁGINA y transferencia
Grandes botes de pesaje	Ina Optika	AS-DL
Contenedores de plástico	COMO UN	CASO PS No.4	10 x 80 x 50 mm
Agitador oscilante	Titech	NR-10
Caja de espuma de estireno	genérica		Las dimensiones internas deben caber en un tanque de transferencia (200 x 250 x 250 mm).
ImageQuant LAS-4000	GE Healthcare		Un generador de imágenes equipado con una cámara CCD refrigerada para la detección de ECL