Artículo de método

El establecimiento de un ensayo de colonización pulmonar para la visualización de células tumorales en tejidos pulmonares de la circulación

DOI:

10.3791/56761

⸱

16 de junio de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Trauma Office, Children's National Health System

En este artículo

Resumen

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Un modelo animal es necesario para descifrar el papel de las células del tumor (CTC) en la promoción de la colonización durante la metástasis del cáncer de pulmón en circulación. Aquí, hemos establecido y realizado con éxito un en vivo ensayo a prueba específicamente el requisito de fibronectina poliméricos (polyFN) Asamblea CTC para la colonización del pulmón.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metástasis es la principal causa de muerte por cáncer. El papel de la circulación de las células del tumor (CTC) en la promoción de metástasis del cáncer, en el cual la colonización pulmonar por CTC críticamente contribuye a principios procesos metastásicos de pulmón, se ha investigado vigorosamente. Así, los modelos animales son el único enfoque que captura el proceso completo sistémico de metástasis. Teniendo en cuenta que tiene problemas en los diseños experimentales para examinar las contribuciones de CTC a la extravasación de los vasos sanguíneos, se estableció un ensayo de colonización en vivo pulmón en que a largo plazo la fluorescencia de la célula-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl éster (CFSE), fue utilizado para identificar células tumorales suspendido y perfusión del pulmón fue realizada para claro no específicamente atrapado CTC antes de la extirpación de pulmón, proyección de imagen confocal y la cuantificación. Polimérico fibronectina (polyFN) montado en superficies CTC se ha encontrado para mediar la colonización del pulmón en el establecimiento final de los tejidos del tumor metastásico. Aquí, para probar específicamente el requisito de polyFN Asamblea CTC para la colonización del pulmón y la extravasación, se realiza a corto plazo ensayos de colonización pulmonar en el cual suspendieron Lewis lung carcinoma células (SRL) estable expresan FN-shRNA (shFN) o despegue en tiempo mínimo-shRNA (shScr) y previamente con 20 μM de CFSE fueron inoculados por vía intravenosa en ratones C57BL/6. Hemos demostrado con éxito que las capacidades de las células LLC shFN para colonizar los pulmones de ratón fueron disminuidas significativamente en comparación con las células LLC de shScr. Por lo tanto, esta metodología a corto plazo puede ser ampliamente aplicada para demostrar específicamente la capacidad de CTC dentro de la circulación para colonizar los pulmones.

Introducción

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La metástasis es la principal causa de muerte de cáncer1,2. Las células tumorales derivadas de tejidos primarios entrar en la circulación en suspensión y sobreviven varios desafíos hematógenas, por ejemplo, anoikis, inmunes agresiones y daños debido a la tensión de esquileo de la tensión arterial o las limitaciones geométricas, antes de que se capaz de colonizar órganos distantes, un paso clave que dicta el éxito de metástasis3,4,5,6. Por lo tanto, actualmente se han hecho esfuerzos vigorosos en la caracterización de las células tumorales circulantes (CTC) y la correlación de estas características con la malignidad del tumor, metástasis y tasas de supervivencia de cáncer pacientes7,8 , 9. puesto que el proceso de metástasis del cáncer específicamente describe un evento en vivo , modelos animales son el único enfoque que captura el proceso completo sistémico de metástasis10,11,12 .

CTC se convierten en los tejidos del tumor metastásico a través de varios eventos celulares, incluyendo la colonización de órganos distantes1,2. Sin embargo, la metástasis más utilizados ensayos13,14,15 no proporcionan una manera de observar la colonización de CTC de órganos distantes. Por lo tanto, es urgente un diseño de ensayo en vivo para la visualización de colonización de CTC. Aunque varios in vivo y ex vivo corta desventajas, problemas y colonización de pulmón del término se han diseñado ensayos permanecen. Por ejemplo, mientras que la proteína de fluorescencia verde (GFP)-expresando tumor las células se han utilizado en estos ensayos de22,23, se necesita tiempo para transfectar estable y clon de células tumorales con suficiente intensidad fluorescente GFP bajo el microscopio. Del mismo modo, aunque la coloración transitoria de las células del tumor con el rastreador de celulares a largo plazo CFSE se ha empleado para reemplazar las células del tumor expresando GFP, sigue siendo difícil juzgar si las células tumorales marcados con CFSE se adjuntan o simplemente presentes dentro de la vasculatura del suprimido órganos distantes16,17.

Polimérico fibronectina (polyFN) montado en superficies de CTC se ha encontrado para contribuir críticamente al establecimiento final del tumor metastático tejidos18,19,20,21,22 . Aquí, se realizaron a corto plazo ensayos de colonización pulmonar en que células de carcinoma de pulmón Lewis suspendidos (SRL) estable expresando FN-shRNA (shFN) o scramble-shRNA (shScr) y previamente etiquetado con CFSE fueron inoculados por vía intravenosa en ratones C57BL/6. Después de 2-3 días, los pulmones de ratón fueron perfundidos primero con tampón fosfato salino (PBS) para eliminar completamente la CTC suelto dentro de la vasculatura antes de ser sometido a microscopia confocal y la cuantificación de colonización pulmonar limitada. Demostró claramente que los números de colonización pulmonar shFN sociedad de responsabilidad limitada y los nódulos del tumor se redujeron significativamente en comparación con el shScr sociedad de responsabilidad limitada, corroborando sustancialmente el papel de la Asamblea polyFN el CTC en la facilitación de la colonización y el crecimiento de CTC en la pulmones. Nuestro estudio requiere más investigación para el papel de polyFN en metástasis del cáncer.

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Protocolo

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Todos los experimentos en ratones fueron realizados según las directrices de nuestro Instituto (la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, NCKU Medical College).

1. preparación de instrumentos, medios de cultivo y platos

  1. Antes de iniciar los protocolos experimentales, obtener suturas quirúrgicas estériles, jeringas de 1 mL con aguja de 26G/0,5 cm (para la cola inyección en la vena), jeringas de 3 mL con aguja 24G/3 cm (para el pulmón de la perfusión), modificado Eagle Media (DMEM de Dulbecco), solución de tripsina-EDTA (5 Contabilidad tripsina y 0,53 mM), suero bovino fetal (FBS), 1 x PBS (NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PHO4y 1,8 mM KH2PO4) y 6 cm cultura platos.

2. preparación y recuperación de las células tumorales en suspensión

  1. Preparación estéril de Dulbecco modificado Eagle Media (DMEM) que contienen 10% o 20% FBS y recién agregar 2 mM L-glutamina, 1 x PBS y 0.05% tripsina-EDTA.
  2. Cultura de las células en DMEM suplementado con 10% SBF a 37 ° C y cultivarlas hasta que haya confluencia de 70-80% en la placa de cultivo.
  3. Retire los medios de cultivo (DMEM) de los platos, seguidos por dos lavados con 2 mL de PBS estéril 1 x.
  4. Añadir 1 mL de 0.05% tripsina-EDTA en los platos para cubrir completamente todas las células. Inmediatamente retire 800 μL de la solución y deje sólo 200 μL en los platos. Incubar las placas a 37 ° C durante 30 s a 1 minuto (dependiendo del tipo de célula) y espere hasta que la mayoría de las células está en estado suspendido.
  5. Añadir 1 mL de DMEM fresco que contiene 10% FBS directamente en los platos para detener la actividad enzimática de la tripsina y vigorosamente pipetear la suspensión hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1000 μL para preparar una suspensión unicelular.
  6. Transferir las células desde el plato a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y desactivación de las células a temperatura ambiente a 162 x g durante 3 minutos.
  7. Aspirar el sobrenadante y resuspender el tumor de células en 1,5 mL DMEM que contiene 20% FBS y por fin girar las células en suspensión a 37 ° C por 2 h.
    Nota: Si el medio se vuelve amarillo durante la recuperación, intercambiar el viejo medio con medio fresco que contiene 20% FBS.

3. fluorescencia de tinción y análisis de las células tumorales en suspensión con Succinimidyl éster Carboxyfluorescein (CFSE)

  1. Después de la recuperación de células en suspensión, contar el número de células viables apropiadas con azul de tripano en un Neubauer recuento de cámara para valorar la dosis de tinción de fluorescencia y para cola de inyección de la vena.
  2. Desactivación de las células a 162 x g a temperatura ambiente durante 3 min y resuspender que las células concentradas en 1 mL de esterilización 1 x PBS, seguido de centrifugación temperatura 162 x g durante 3 minutos.
  3. Resuspender las células sedimentadas en 500 μl de PBS de X 1 que contiene 10% FBS y 0, 5, 10, 20 o 40 μm CFSE para titulación de la dosis y se incuba la suspensión de células a 37 oC por 10 min en la oscuridad.
  4. Desactivación de las células a 162 x g a temperatura ambiente durante 3 min y resuspender las células pildoradas con 4 mL de DMEM que contenía 1% FBS. Repetir este lavado tres veces más. Resuspender las células pildoradas con 4 mL de DMEM solo para el lavado final.
  5. Someter las células CFSE marcado a celular activado por fluorescencia clasificación análisis (FACS) para cuantificar la intensidad de fluorescencia de una sola célula, o inyección en la vena de la cola.
    Nota: Mantenga las células en hielo antes de realizar las inyecciones de vena de análisis o cola de FACS.

4. ensayo de colonización pulmonar

  1. Preparar las células etiquetadas con 20 μm CFSE (véase pasos 3.1 a 3.4).
    Nota: Decidir la dosis de trabajo de la CFSE para el etiquetado de las células del tumor, basadas en los resultados de la valoración del análisis FACS (consulte paso 3.3).
  2. Calentamiento de las colas de los 4-6 semanas-viejo macho C57BL/6 ratones (6) con una lámpara de haluro para 5-10 minutos sobre una base de ratón por ratón para dilatar las venas de cola de ratón.
  3. Mezcle completamente y aspirar las células tumorales marcados con CFSE con una jeringa de 1 mL (26Gx1/2), evitando las burbujas en la suspensión de células (con una densidad celular final de 5 x 106 células/mL).
  4. Cuidadosamente inyecte 1 x106 células de tumor CFSE-etiquetados en 200 μL de DMEM en la vena de la cola de ratón, que debe presentarse en un limitador de ratón.
    Nota: Durante la inyección, si la aguja se coloca directamente en el lumen de la vena de la cola, las células tumorales deben fácilmente enviar a la circulación sin necesidad de empujar duro en la jeringa. Si es difícil para las células del tumor a través de, han probablemente ha inyectado fuera de la vena de la cola, en el espacio subcutáneo.
  5. Dividir los ratones que recibieron por vía intravenosa las células tumorales marcados con CFSE en dos grupos: un grupo será sometido a perfusión pulmonar seguida de microscopía confocal y cuantificación de ImageJ en el ensayo de colonización del pulmón y el otro quedará solo para 4-5 semanas en la colonización del pulmón a largo plazo del análisis.
  6. Con 20, 38 o 45 h y de 1 x 106 células del tumor inyectadas por vía intravenosa durante una titulación de curso - y dependiente de la dosis de tiempo, anestesiar a ratones con tumores con 50-75 mg/kg zoletil 50, que es un bien aceptado y adecuado anesthetizer23.
    Nota: Uso veterinario el ungüento en los ojos de los ratones para evitar sequedad mientras esté bajo anestesia.
  7. Corte longitudinalmente la piel y tejido subcutáneo del abdomen a la región del pecho con tijeras quirúrgicas. Abrir la cavidad pleural con tijeras quirúrgicas y pinzas para exponer completamente el corazón y los pulmones.
    Nota: Tenga cuidado para evitar cortar los vasos sanguíneos.
  8. Atar la vena cava superior (SVC) y vena cava inferior (IVC) con suturas quirúrgicas estériles para prevenir el reflujo de la solución de perfusión durante la perfusión pulmonar.
  9. Cortar la pared del ventrículo izquierdo con tijeras quirúrgicas para abrir una fisura (aproximadamente 2-4 mm) para drenar la solución de perfusión de los pulmones.
  10. Inyectar una jeringa de 3 mL 1 x PBS en el ventrículo derecho y quitar la solución de drenaje con aspiración constante durante la perfusión pulmonar hasta los pulmones de un color rojizo a totalmente claro.

5. confocal imagen microscópica y el análisis de las células tumorales de pulmón colonizado

  1. Retire los pulmones ahora pálido de la cavidad pleural y separe los cinco lóbulos por recortar las tráquea y el tejido conjuntivo ligamentos con tijera y pinzas quirúrgicas24.
  2. Preparar un soporte de la camilla como pulmón como se muestra en la figura 3B por una sutura de nylon de la bobina alrededor de dos barras de metal para producir una textura reticular con un espacio entre las dos barras para la colocación de los lóbulos del pulmón. Fijar el soporte del pulmón en un plato de 6 cm.
    Nota: Se utilizará el soporte de pulmón para estabilizar los lóbulos del pulmón por debajo de la lente del objetivo de un microscopio confocal.
  3. Lodge y fijar los lóbulos pulmonares sobre la textura reticular del titular del pulmón. Cubrir y humedezca los lóbulos del pulmón con 1 x PBS.
  4. La placa de cultivo de 6 cm que los lóbulos del pulmón en el soporte del pulmón a la microscopía confocal para capturar imágenes de fluorescencia, las células del tumor pulmonar colonizando la grabación del tema.
  5. Para la proyección de imagen, uso de lentes del objetivo (5 X, MPLN, NA: 0.1, WD: 20, aire).
  6. Gire la rueda de filtros a NIBA (excitación/emisión; 470-495 nm/510-550 nm) y a 488 nm láser para excitar la CFSE, claramente visualizar imágenes de puntos de fluorescencia en los lóbulos del pulmón.
  7. Gire la rueda de filtros a R690 (para el laser del MaiTai HP DeepSee) al escanear con el 2.0 μs/pixel exploración velocidad y optimizar los HV, ganancia y offset niveles.
  8. Captura de imágenes de fluorescencia (512 x 512 píxeles) usando el software del microscopio con un 10 μs/pixel velocidad de escaneado.
  9. Cuantificar y analizar estadísticamente las imágenes microscópicas utilizando el software ImageJ y GraphPad como se describió anteriormente21.

6. largo plazo ensayos de colonización pulmonar

Nota: Repita los pasos 4.1 a 4.5.

  1. Sacrificar a los ratones después de la inoculación de células del tumor para 4-5 semanas y se fijan sus pulmones con líquido de Bouin25 durante 1 a 2 días.
  2. Cuantificar y analizar estadísticamente los nódulos tumorales de los pulmones de ratones con software21.

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Resultados

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Antes de realizar el ensayo de colonización en vivo pulmón como se ilustra en la figura 1A para probar si polyFN en las células del tumor suspendido media colonización pulmonar o extravasación en la facilitación de metástasis, lo primero graduado diferentes concentraciones de CFSE, un compuesto fluorescente que es célula permeable y covalente conjuga intracelular que contiene amina moléculas26,27

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Discusión

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Junto a largo plazo pulmonar colonización ensayos, corto plazo metodología empleamos aquí evaluar en vivo pulmón colonización por CTC en órganos distantes claramente dio a conocer y distingue el papel específico de polyFN montado en CTC en colonización los pulmones, que luego condujeron a la extravasación y procesos metastásicos18,19,20,21. Aunque etiquetado células con rastreador de c...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer al Dr. Chang Ming-Min y Ya-Hsin contactar su soporte técnico. Este trabajo fue financiado por el Ministerio de ciencia y tecnología de Taiwán (la mayoría-103-2325-B-006-009, la mayoría-104-2325-B-006-001, la mayoría-105-2325-B-006-001 y MOST-106-2320-B-006-068-MY3) y el Ministerio de salud y bienestar (MOHW106-TDU-B-211-144004). Agradecemos también el apoyo del laboratorio de investigación central de la Facultad de medicina de la Universidad Nacional Cheng Kung, su microscopio confocal del multi-photon.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Material
Albúmina sérica bovina ( BSA)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwán)101-9048-46-8
Fluido de BouinMCC (corporación química médica)/POISON456-A-1GL
CFSE Proliferation Dyeebiosciences65-0850-85Nombre completo: Carboxifluoresceína succinimidil éster
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) (Gibco)ThermoFisher Scientific12100-061
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwán)101-6381-92-6Para solución preparada de tripsina-EDTA (concentración final: 0,53 mM) 
Suero fetal bovino (FBS)(Gibco)ThermoFisher Scientific10437-028
Carcinoma de pulmón de Lewis (LLC)ATCC, Manassas, VA, EE. UUCRL-1642
L-Glutamina, USP (Gibco)ThermoFisher Scientific21051-024
Cloruro de potasio (KCl)Cyrusbioscience (Taipéi, Taiwán)101-7447-40-7Para preparado 1X PBS ( Concentración final: 2,7 mM )
Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)Cyrusbioscience (Taipéi, Taiwán)101-7778-77-0Para preparado 1X PBS ( Concentración final: 1,8 mM )
Sodio cloruro (NaCl)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwán)101-7647-14-5Para preparado 1X PBS ( Concentración final: 137mM )
Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwán)101-10039-32-4Para preparado 1X PBS ( Concentración final: 10mM )
Trypan BlueSigma AldrichT61460,5 g mezcla con 100 mL 1X PBS
TripsinaSigma AldrichT4799Para la solución preparada de tripsina-EDTA ( Concentración final: 5 g / L )
Zoletil 50VirbacPara diluir con 1X PBS 
Nombre>EmpresaNúmero de catálogoComentarios
Equipo
Centrífuga de mesa compacta 2420KUBOTA Co.2420
Plato de cultivo (6cm)Wuxi NEST Biotechnology Co.
Jeringa desechable (con aguja)Perfect Medical Industry Co.24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml
Mezclador de extremo a extremoC.T.I YOUNG CHENNTS-20Para la recuperación de células en suspensión 
FACSCalibur (FACS)BD biosciences Pinzas
Dimeda10.102.14
Forma Calor Directo CO2incubadora Thermo Fisher Scientific Inc.HEPA CLASS 100
Bloqueador de ratón (Protector cilíndrico 15-30 gm)Stoelting51338
Microscopio confocal multifotónico BX61WIOlympusFV1000MPE
Cámara de recuento NeubauerMarienfeld-Superior640010
Tijera quirúrgicaDimeda08.370.11
Suturas quirúrgicas SUTURAS QUIRÚRGICAS UNIK MFG. CO.NO. 0034Negro Seda trenzada; no absorbible (25 yardas; U.S.P. 4/0)
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLWuxi NEST Biotechnology Co.
tubo Greiner de 15 mLGreiner bio-one188271
. 705001615001

Referencias

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