Generación de organoides Cerebral prosencéfalo-tipo estandarizadas y reproducibles de humanos inducida por células madre pluripotentes

Resumen

Organoides cerebrales representan un nuevo sistema modelo para investigar el cerebro humano desarrollo temprano en vitro. Este artículo proporciona la metodología detallada para generar eficientemente organitas prosencéfalo-tipo dorsal homogéneo de células pluripotentes inducidas humanas incluyendo pasos críticos de la caracterización y validación.

Resumen

La corteza humana es muy extendida y presenta una estructura compleja con áreas funcionales específicas, proporcionando la más alta función del cerebro, como la cognición. Esfuerzos para estudiar el desarrollo de la corteza cerebral humana han sido limitados por la disponibilidad de sistemas modelo. Traducir los resultados de estudios de roedores para el sistema humano está restringido por las diferencias de especies y estudios sobre tejidos humanos primarios se ven obstaculizados por la falta de disponibilidad de tejido así como preocupaciones éticas. Desarrollo reciente en tecnología (PSC) de la célula de vástago de pluripotent humanas incluyen la generación de tres dimensiones (3D) uno mismo-organización organotypic sistemas de cultivo, que imitan a un cierto grado humanos específicos cerebro desarrollo en vitro. Actualmente, varios protocolos están disponibles para la generación de todo el cerebro u organitas específica región del cerebro. El método para la generación de organoides de forebrain-tipo homogéneo y reproducible de inducida por el PSC (iPSC), que previamente establecidos y describe aquí, combina la capacidad intrínseca de PSC a auto-organizarse con diferenciación guiada hacia la neuroectodérmico anterior linaje y matriz de inclusión para apoyar la formación de un neuroepitelio continua. Más específicamente, este protocolo trata de: (1) la generación de agregados de iPSC, incluyendo la conversión de colonias de iPSC en una cultura de la monocapa confluente; (2) la inducción de neuroectodermo anterior; (3) la incorporación de neuroectodermal agregados en un andamio de la matriz; (4) la generación de forebrain-tipo organoides de neuroectodermal agregados; y (5) la fijación y la validación de tipo prosencéfalo organitas. Como tal, este protocolo proporciona un sistema fácilmente aplicable para la generación de estructuras estandarizadas y reproducibles derivan de iPSC tejido cortical en vitro.

Introducción

El cerebro humano es claramente uno de los órganos más complejos y es responsable de todas las capacidades intelectuales humanas. Así, una comprensión más profunda del desarrollo del cerebro humano específico es un prerrequisito fundamental para la comprensión de las capacidades cognitivas humanas. Tradicionalmente, animales transgénicos sirven como organismos modelo para estudiar el desarrollo del cerebro. Estos modelos proporcionan penetración fundamental en los principios del desarrollo del cerebro. Ahora sabemos que una característica común del desarrollo del cerebro en los mamíferos es una precisa coreografía de proliferación del progenitor, la neurogénesis y migración neuronal. Sin embargo, existen importantes diferencias estructurales entre los cerebros de los organismos modelo, como roedores y seres humanos, especialmente en la neocorteza. Los principales mecanismos que se han propuesto contribuir a la evolución cortical de primate son un aumento de la proliferación de las células madre y progenitoras, así como la generación de células de la glia radial externo (oRGCs), que sólo muy raramente se encuentran en los roedores^{1 ,2,3}.

Métodos para el desarrollo del modelo de corteza cerebral humana incluyen la generación de las células progenitoras telencéfalo derivados del PSC y las neuronas de proyección de la corteza cerebral como cultivos de monocapa. Estos estandarizado diferenciación protocolos reproducción ciertos aspectos de desarrollo cortical humano tales como el orden temporal estereotipado de neurogénesis cortical⁴. Ellos, sin embargo, se quedan cortas cuando se trata de la recapitulación de los procesos de desarrollo de la organogénesis como patrones espaciales y morfogénesis. Desarrollos más recientes en biología de la célula de vástago condujeron al establecimiento de culturas 3D organoide del PSC, que está revolucionando la investigación en vitro organogénesis humana. Utilizando la capacidad de auto-organizarse en estructuras organotypic de PSCs, organitas varios, que reflejan las principales propiedades estructurales y funcionales de los órganos incluidos los de riñón, intestino, el ojo y el cerebro han sido establecidos⁵. Estos organoides contienen múltiples subtipos celulares órgano-específicas, que se agrupan y organizan espacialmente muy similares a los órganos en desarrollo en vivode^5,6. Además, la composición celular, relación de linaje y gene estudios de red utilizando la secuencia de RNA unicelular revelan que organitas cerebrales humanos fielmente recapitulan aspectos importantes del desarrollo de la neocorteza fetal humano tales como programas de expresión génica ^{7 , 8}. una gran desventaja, que impidió su amplio uso hasta ahora, era, sin embargo, las grandes variaciones de lote a lote y heterogeneidad organoide de organoide⁹.

Presentamos un protocolo detallado para un sistema de cultivo de organoide de forebrain-tipo simple y estandarizada. La característica fundamental de este sistema es que eficiente y reproducible genera organoides derivados del PSC de identidad telencéfalo dorsal casi exclusivo. El protocolo se basa en los métodos utilizados en nuestros últimos Informes celular papel¹⁰. Combina la capacidad de autoorganización de iPSCs con inducción selectiva del neuroepitelio cortical y robusta puede generar culturas homogéneas de tejido telencéfalo dorsal temprano dentro de 3 semanas. El protocolo se basa en la previamente divulgados de señalización SMAD y estrategia de la inhibición de Wnt que guía la diferenciación del PSC hacia el linaje neuroectodérmico anterior^11,12 en combinación con la matriz de integración, que promueve la formación de estructuras neuroepiteliales grande y continua¹³. Hemos utilizado con éxito el método descrito en varias líneas de iPSC, con varios clones por persona. Demostró que este sistema es adecuado para aplicaciones posteriores en que la homogeneidad y reproducibilidad son de gran importancia como modelo de enfermedad. Al aplicar el protocolo a iPSCs derivadas de pacientes que sufren de una severa malformación cortical, pudimos recapitular características patológicas de la enfermedad en vitro y para identificar nuevos mecanismos moleculares que conducen a la fenotípica cambia¹⁰. Sugerimos que el protocolo descrito organoide puede utilizarse para cerrar la brecha entre las culturas de monocapa corticales derivados del PSC reduccionista y estudios en vivo , y que representa un sistema confiable y estable modelo basadas en células para simular temprano desarrollo cortical humano en salud y la enfermedad fuera del cuerpo humano.

Protocolo

1. generación de agregados de iPSC

1. Generación de culturas sola célula monocapa de colonias de iPSC
   1. Prepare una placa de 6 pozos extracto (BME) recubierto de membrana basal. Deshielo de BME en hielo a 4 º C durante 2-3 h, diluya con frío de Dulbecco modificado Eagle medio F12 (DMEM-F12; 1:50 dilución), cubra la placa con 1 mL/pozo de la solución diluida de BME y guardar la placa durante la noche a 4 ° C.
   2. El medio de aspirar y lavar las colonias iPSC intacta de al menos 2 pozos de una placa de 6 pozos con 0,5 mM de EDTA en tampón fosfato salino (PBS) dos veces antes de incubación las colonias de 0.5 mM dihidratada del ácido (EDTA) en PBS durante 4 min a temperatura ambiente (RT). Aspirar solución de EDTA y suavemente separe las colonias la lava desde el fondo del plato con 5 mL de medio DMEM-F12. Recoger en un tubo de 15 mL y pellets por centrifugación (4 min a 1.200 x g a temperatura ambiente).
      Nota: iPSCs reprogramado de fibroblastos comercialmente disponibles ha sido usado con éxito¹⁰.
   3. Aspirar el sobrenadante y se incuba a las colonias de iPSC con 500 μl del reactivo de disociación celular durante 6 minutos a 37 ° C.
   4. Pipetear la suspensión varias veces suavemente arriba y abajo con una pipeta de 1 mL para romper restantes racimos de célula en las células.
   5. Añadir 4 mL de DMEM-F12 a la suspensión de células para diluir el reactivo de disociación celular.
   6. Girar las celdas abajo de 1.200 x g durante 4 min a TA.
   7. Resuspender las células en 2 mL de iPSC suplementado con 5 μm Y-27632 y semilla de las células en un pocillo de una placa de 6 pozos BME cubierto.
      Nota: Utilizar el medio de iPSC especificado en la Tabla de materiales para una cultura de iPSC sola célula monocapa.
   8. Al día siguiente, reemplace el medio con medio fresco iPSC carecer de Y-27632. Desde este punto, seguir a las células, cambiando el medio cada día hasta iPSCs 100% confluente de la cultura. Dependiendo de la línea celular y la confluencia de los pozos de partida, esto le llevará entre 2 a 4 días.
   9. Paso una vez confluente, las iPSCs. Aspire el medio y aplicar 500 μl del reactivo de disociación celular en las células.
   10. Incube las células 5-10 min a 37 ° C. Muévalo suavemente la placa para separar las células.
   11. Lavar las células desde el pozo utilizando 2 mL de DMEM-F12 y recoger en un tubo de 15 mL. Agregar DMEM-F12 para un volumen total de 5 mL.
   12. Desactivación de las células a 1.200 x g durante 4 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante.
   13. Las células de la semilla en iPSC suplementado con 5 μm Y-27632 en 1:2 relación de 1:4 en un BME cubierta placa de 6 pozos (2 mL/pozo del medio).
   14. Seguir la cultura de las células de 2-5 días y cambiar el medio de iPSC que carece Y-27632 cada día. Una vez confluentes, pasaje iPSCs (medidas 1.1.4-1.1.8).
       Nota: IPSCs para por lo menos 2 pasos de la cultura como una monocapa en el medio de iPSC especificado en la Tabla de materiales antes de usarlos para la generación de agregados de iPSC para permitir que las células a adaptarse a las condiciones de cultivo.
2. Utilizar cultivos de monocapa iPSC cuando son confluentes de 70-90% para la generación de agregados de iPSC.
   Nota: iPSC adaptado a las condiciones de cultivo como las células son menos propensas al estrés que conduce a la muerte celular durante el procedimiento de disociación y agregación. Capa monomolecular iPSC culturas necesitan Mostrar la morfología típica pluripotentes sin evidencia de diferenciación. Prueba de las culturas de manera regular contaminación por micoplasma. Trabajar sólo con las culturas libres de micoplasma iPSC.
   1. Aspire el medio de cultivo de un pozo de una placa de 6 pozos y aplicar 500 μl del reactivo de disociación celular en las células.
   2. Incube las células 5-10 min a 37 ° C. Muévalo suavemente la placa para separar las células.
   3. Lavar las células desde el pozo utilizando 2 mL de DMEM-F12 y recoger en un tubo de 15 mL. Agregar DMEM-F12 para un volumen total de 10 mL.
   4. Para el recuento celular, tomar 25 μl de la suspensión de células y mezclar con 25 μl de trypan azul para marcar las células muertas. Contar las células vivas usando una cámara de conteo.
   5. Recopila suficientes células (4.500 por iPSC agregado) de la suspensión de células en un tubo de 15 mL.
   6. Desactivación de las células a 1.200 x g durante 4 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante.
   7. Resuspender las células en un volumen adecuado de iPSC suplementado con 50 μm Y-27632 obtener 4.500 células vivas por 150 μL.
      Nota: Con una alta concentración de Y-27632 (50 μm) es fundamental para la supervivencia de las iPSCs.
   8. Placa de 150 μL en cada uno de un accesorio de baja 96 pocillos U-fondo de la placa y colocarla en la incubadora a 37 ° C y 5% CO₂.
      Nota: Al generar agregados de iPSC, considerar que organitas al menos 6 son necesarios para el control de calidad en el día 20 (ver sección 5).

2. inducción de neuroectodermo Anterior

1. Supervisar estrechamente los cambios de la morfología de los agregados de iPSC cada día bajo el microscopio de cultivo de tejidos con un 4 X o 10 X lente de potencia. Observar en el día 1, agregados de células con bordes claros. Seguir a los agregados de iPSC de la cultura en la incubadora a 37 ° C y 5% CO₂.
   Nota: Un cierto número de células/pozo muerto es normal y no afectará la generación de organoide.
2. Alimentación de los agregados de iPSC a partir de día 2 y continuando con cada otro día aspirando suavemente aproximadamente 2/3 del medio sin molestar a los agregados de células en la parte inferior. Agregar un adicional 100 μl de medio de iPSC que carece Y-27632.
   Nota: Dentro de los 4-6 días los agregados de la célula serán 350-450 μm de diámetro y presentan bordes lisos.
3. En esta etapa, piscina la célula agrega con una pipeta de corte 100 μL en una placa de fijación baja 6 cm (máximo de 20 agregados/plato) en medio de inducción cortical con DMEM-F12 con N2 suplemento (1: 200), B27 suplemento (1: 100), glucosa (0,2 mg/mL), cíclica monofosfato de adenosina (cAMP; 0.15 μg/mL), 0.5% no aminoácidos esenciales (AANE), 1% L-Alanil-L-glutamina, heparina (10 μg/mL) y los compuestos 193189 LDN (180 nM), A83-01 (500 nM) y el inhibidor de la respuesta de Wnt-1 (IWR-1) (10 μg/mL). Alimentación de los agregados de celda cambiando el medio de inducción cortical 3 días después de la transferencia para el plato de 6 cm.
4. Vigilar de cerca los cambios morfológicos durante la inducción cortical bajo el microscopio de cultivo de tejidos utilizando una lente de potencia de X 4.
   Nota: Después de 4-5 días en medio de inducción cortical, bordes de los agregados de células deberían empezar a aclarar en la superficie, lo que indica diferenciación neuroectodermal. En esta etapa, surge organización radial de un epitelio seudoestratificado. Proceder a la sección 3 para embeber los agregados de células en una matriz BME.

3. incrustación de Neuroectodermal agregados en un andamio de matriz

1. Descongele la BME en hielo a 4 º C para 2-3 h. BME sin diluir alícuota en cantidades suficientes.
2. Preparar una hoja de película de plástico de parafina para el procedimiento de inclusión. Corte la película de parafina plástica utilizando tijeras estériles en grande 4 cm x 4 cm piezas, poner un pedazo del plástico de la película de parafina sobre una bandeja de punta vacía 100 μl 100 consejos μl y presione con un dedo enguantado para que pequeños hoyuelos en la hoja de película de plástico de la parafina se crean (1 di MPLE/celular agregada necesitada). Limpiar la película de parafina plástica con etanol al 70% e irradiar con luz UV (energía: 15 vatios, longitud de onda: 435 nm) debajo del Banco cerrado estéril durante 30 minutos.
3. Transferir cada agregado de celda a una concavidad de la hoja de la película de parafina plástico usando una punta de corte de 100 μl con 1.5-2 mm en diámetro. En el caso de que dos agregados de la célula se fusionan, no separarlos pero les traslado juntos a un hoyuelo.
4. Aspirar suavemente el medio que rodea los agregados de celda usando una punta de pipeta sin cortar de 100 μl.
   Nota: Tenga cuidado de no aspirar los agregados de la célula en la punta, esto dañará los agregados.
5. Agregar 40 μl de BME sin diluir a cada agregado de células.
6. Posición de cada célula agregada en medio BME gota utilizando una punta de pipeta 100 μl sin cortar.
   Nota: Ser muy cuidado de no dañar el neuroepitelio en desarrollo con la punta de la pipeta.
7. Cuidadosamente transfiera la hoja de la película de parafina de plástico con pinzas estériles en una placa de Petri de 10 cm (u otra placa de cultivo celular suficiente) y coloque el plato en la incubadora durante 15-20 min permitir que el BME solidificar.
8. Mientras tanto, preparar un plato de fijación baja 6 cm que contiene 5 mL de medio de inducción cortical.
9. Después de la polimerización de BME, quitar las gotitas que contienen los agregados de celda de la hoja de película de plástico de la parafina. Vuelta a la película de parafina plástica utilizando pinzas estériles y apretar suavemente los agregados de la célula en la ligeramente inclinado (30 °) plato de fijación baja 6 cm hasta que las gotas caen de la hoja de película de plástico de la parafina. Transferencia de un máximo de 16 agregados de células en un plato de 6 cm.
10. Seguir a incubar los agregados de células a 37 ° C.

4. generación de Forebrain-tipo organoides de Neuroectodermal agregados

1. Un día después de la incorporación en una matriz BME, colocar platos de cultura organoide en un agitador oscilante de cultura celular con un ángulo de inclinación de 5 ° y 14 rpm, instalado en una incubadora de cultivo celular.
2. Organoides monitor todos los días. Neuroepiteliales homogénea lazo-como las estructuras desarrollan gradualmente después de incrustar en la matriz BME.
3. Cuando las estructuras de bucle neuroepiteliales son visibles, cambiar el medio a medio de diferenciación de organoide que contenga DMEM-F12 con N2 suplemento (1: 200), B27 suplemento (1: 100), glucosa (0,2 mg/mL), campaña (0,15 μg/mL) 0.5% AANE, 1% L-Alanil-L-glutamina, insulina (2,5 μg/mL)
4. Reemplace el medio de diferenciación de organoide cada 3-4 días hasta alcanzar el punto de tiempo deseada diferenciación. A continuación fijar organoides (ver sección 5).
   Nota: Ocasionalmente, el tejido puede exhibir brotes de tejido ópticamente translúcido sin estructuras de bucle. Aunque esto no es ideal, esto no afecta el desarrollo de estructuras corticales. Los organoides pueden cultivarse en medio de la diferenciación de organoide hasta 40 días. Durante períodos de la cultura extendida (40-100 días) el medio de diferenciación de organoide puede complementarse con 1:50 BME para aumentar la complejidad del tejido y con BDNF y GDNF neuronal supervivencia y maduración^14,15.

5. fijación y validación del Forebrain-tipo organitas

1. Para la validación, recoger 6 organitas al día 20. Utilice 3 organitas para análisis PCR y aislamiento del mRNA. Transferencia de los 3 organoides adicionales a una placa de 24 pocillos que contienen PBS utilizando una pipeta de 1 mL corte con una abertura de 3-3.5 mm para la fijación y análisis de immunocytochemical secuencial.
2. Lave las organitas dos veces por cuidadosamente aspirando el PBS y reemplazarlo con PBS fresco usando una pipeta de 5 mL. Fijar el organitas durante 15 minutos en frío 4% paraformaldehido (PFA) (pH 7.4).
   PRECAUCIÓN: Ten cuidado que la PFA es un carcinógeno humano conocido. Todo trabajo debe realizarse en una campana de vapores químicos, guantes de nitrilo. Se recomienda usar gafas de seguridad. Formaldehído puede causar daños irreversibles en la córnea.
3. Aspirar cuidadosamente la PFA y lavado tres veces usando temperatura PBS durante 10 minutos.
4. Reemplazar el PBS con una solución de sacarosa al 30% (peso/vol, basada en PBS) y almacenar las muestras a 4 ° C para permitir organitas deshidratar. Organoides pueden conservarse hasta 7 días hasta la transformación posterior.
5. Un día después de la fijación, la mancha organitas deshidratados mediante la adición de azul de tripano en aproximadamente 1:50 por 10 min permitir la visualización de los organoides durante el procedimiento de cryosectioning.
6. Preparar el medio de inclusión que contiene 10% de sacarosa, gelatina de 7,5% wt/vol en PBS y caliente a 75 ° C hasta que esté líquido.
7. Reemplazar 30% solución de sucrosa con incrustación medio y transferir la placa de 24 pocillos sobre una placa de calentamiento (60 ° C) durante 15 min a que se equilibren las organitas.
8. Cubrir el fondo de los moldes de inclusión con una capa de medio de inclusión y coloque en hielo para polimerizar.
9. Transferencia los organoides de la placa de 24 pocillos a incrustar los moldes que contiene el medio de inclusión polimerizado, añadir medio inclusión adicional en la parte superior para que el organitas están cubiertos y colocar el molde rápidamente en un 100% etanol seco hielo (baño de congelación temperatura debe estar entre -30 y-50 ° C) durante al menos 1 minuto para congelación de choque.
10. Coloque el molde con pinzas de hielo seco temporalmente y cualquier tienda que les a-80 ° C o directamente proceden a cryosectioning.
11. Organitas criosección a 20 μm de grosor y recoger las secciones sobre portaobjetos, mantener pista del orden de las secciones de las diapositivas (absorción secuencial). Permiten que las secciones se seque en las diapositivas durante varias horas, antes de almacenarlas a-80 ° C o realizar directamente la coloración immunocytochemical.

Resultados

El protocolo de organoide prosencéfalo-tipo estandarizado descrito aquí normalmente genera culturas organoide muy homogéneo de identidad cortical casi exclusivamente dorsal de iPSCs humana dentro de 20 días de cultivo (protocolo descrito en la figura 1 A). se recomienda realizar varios pasos de control de calidad durante el curso del tiempo del Protocolo, definido aquí como: 'ir' (continuar el proceso de diferenciación) y 'prohibida' (culturas subóptimas, se recomienda terminar el lote) (figura 1 ). También es recomendable documentar cada paso de control de calidad bien tomando imágenes y notas.

El primer paso crítico en la generación de forebrain-tipo organitas es empezar con cultivos de alta calidad iPSC. Es importante que iPSCs no contienen fracciones más grandes de células diferenciadas. Utilice sólo las culturas de iPSC que presentan como una monocapa homogénea de células indiferenciadas en la población inicial (figuras 1B, C). Además, es crucial comenzar con el número de células determinado para la agregación de iPSC. La primera inspección detallada de los agregados de iPSC debe realizarse en el día 2. En esta etapa, los agregados deben han formado brotes de celda compacta con bordes lisos ('go') mientras que irregular que aparecen agregados o áridos con cavidades deben ser descartada ('prohibido') (figuras 1, E). El siguiente paso de control de calidad debe realizarse en el día 10 del protocolo. En este momento, los agregados de celda deben mostrar tejido liso y ópticamente translúcido sobre la superficie exterior que representa la inducción del neuroectodermo ('go') mientras que la ausencia de dicho tejido indica inducción neural subóptima ('prohibida') (figuras 1F, G ). Sólo aquellos áridos que presentan una superficie translúcida (figura 1F) deben ser embebidos en matriz BME. Una vez incrustado, el organitas cortical desarrollará neuroepiteliales continuo lazo-como las estructuras, que se ampliarán rápidamente. Analizar la eficacia de la inducción cortical en el día 15 y 20 por investigar si los organoides tienen ectodermo neural polarizado desarrollado como se muestra en la figura 1H, J ('go'). En el caso que organitas han desarrollado críticamente tales gustativas neuroepiteliales ('prohibidas' como se ilustra en la figura 1I, K), revisar los pasos de control de calidad realizado para resolución de problemas. Cuando firmemente tras el protocolo, altamente estandarizado organoide lotes será generado (figuras 2A, B), que muestra homogeneidad ≥ 90% en polarizado formación del ectodermo neural dentro y entre lotes (figura 2C). Un error común que conduzca a la variable eficiencia de formación de ectodermo neural polarizado es aumentar el número de células inicial para la agregación de iPSC, o culturas con baja calidad iPSC como mycoplasma contaminación culturas o culturas que contienen células diferenciadas.

Una validación detallada de la identidad telencéfalo dorsal de los organoides generados debe ser realizada en el día 20. Para ello, 3 organitas deben fija y utilizados para el análisis de la inmunofluorescencia. Neuroepiteliales estratificado bucles (figura 3A) expresan el marcador de células madre neuronales Sox2 (figura 3B, D), los marcadores de forebrain Pax6 y Otx2 (figuras 3, E) y el marcador cortical dorsal Emx1 (figura 3 F). estos circuitos corticales se caracterizan más por una localización apical de N-cadherina y ZO-1 (figuras 3, H), células de glía radial zona ventricular (vRGC)-derivado de microtúbulos, que se extiende desde la apical hacia el lado basal de las estructuras ( Figura 3 Yo), y ubicado apical dividiendo las células que se tiñen positivas para el vimentin fosforilado (p-Vimentin, figura 3J). Muerte celular puede estar presente dentro de las estructuras organoides. Apoptosis central es normal y no afecta el desarrollo de tejido cortical. Además, 3 organitas puede usarse para evaluar la homogeneidad del Protocolo de análisis de expresión génica. Prosencéfalo-tipo organitas Mostrar expresión de los marcadores de cerebro dorsal anterior (FoxG1, Otx2, Emx1), mientras que la expresión del mesencéfalo (FoxA2, Pax5) y los marcadores de cerebelo (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) no es detectable (figura 3K).

Lotes de organoides de control de calidad pueden utilizarse para diversas aplicaciones como el análisis del plano de división de las células gliales radiales apicales. Para ello, sugerimos realizar la tinción doble con anticuerpos contra la vimentina p y Tpx2 (figura 3J). P-vimentina es fosforilado por CDK1 durante la mitosis y se encuentra en el núcleo, marcando todos los núcleos en fase mitótica¹⁶. Tpx2 es una proteína asociada a microtúbulos que puede visualizar el huso mitótico y los procesos apicales durante la migración nuclear interkinetic^17,18. Con estos marcadores, tres aspectos de la división de vRGC pueden en principio ser analizados: () si la célula división ocurre en el lado apical, (II) si el plano de división es vertical alineado (indica simétrica división celular), () horizontal u oblicuo indicando la división de célula asimétrica) a la superficie apical y (III) si centros de organización de microtúbulos se forman normalmente.

Organoides pueden diferenciarse también en estructuras más complejas de tejido cortical organizada y estratificada. Estructuras corticales dentro de día 35 ± 2 organitas están compuestos por una zona ventricular (VZ)-, una interior y exterior zona subventricular (SVZ), así como una placa cortical (CP) - como área. Dentro de la VZ y la SVZ interior y exterior, pueden identificarse vRGCs, progenitores intermedias (IPs) y células de oRGCs. Además, la formación inicial de una corteza capas se observan en el CP como área con profundidad corticales neuronas expresan Tbr1 y Ctip2 dentro y neuronas corticales superiores expresando Satb2, así como células de Reelin-expresión en las regiones exteriores¹⁰.

Figura 1 : Descripción esquemática del organoide protocolo e ilustración de criterios 'prohibidas' y 'go'. (A) esquema Resumen del protocolo. CI medio: medio de inducción cortical; CD: medio de diferenciación cortical. (CdeB–) Imagen de una óptima cultura de monocapa confluente iPSC de 90% (B) y una cultura de iPSC no conveniente exhibir la diferenciación (C). (D–E) Un total de iPSC óptimo en tamaño, densidad celular y aspecto superficial (D) y dos agregados de la célula 'prohibida' que cualquier celular repuestos cavidades (E, agregado superior) o irregular de los bordes (E, suma inferior) dos días después de agregación celular. (F–G) Agregados de células exhiben bordes translúcidos y lisos (F) y agregados de la célula falta óptico claro (G). La línea amarilla es visualizar el área de interés. (H–K) Un organoide óptima con bucles continuos neuroepiteliales (H, J) y un organoide que no desarrollan radialmente organizan neuroectodermo (, K) fotografiada en el día 15 y 20, respectivamente. Barras de escala, B-C 500 μm; D-K 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Homogeneidad y reproducibilidad del Protocolo de organoide de forebrain-tipo. (A–B) Imágenes representativas del campo brillante de organoides de un lote en el día 15 (A) y 26 (B). (C) los análisis cuantitativos de organitas al día 20. Se cuantificaron los organoides que se muestran en la superficie externa un neuroepitelio, reconocible en campo claro como tejido superficial ópticamente claro con una frontera clara y la evidencia de la arquitectura celular radial (n = 3 por línea de iPSC con al menos 16 organoides por el experimento). Barras de escala, A-B: 500 μm. barras de Error ± SD. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Validación del prosencéfalo-tipo organitas al día 20. (A–J) Caracterización de immunocytochemical de organoides. Organoides organizan en varios bucles neuroepiteliales (A, contratinción con DAPI). Estratificado de células organizadas dentro de la neuroepitelial lazos express el marcador de células madre neuronales Sox2 (B, D), los marcadores de forebrain Pax6 (C, D) y Otx2 (E), así como el marcador de cerebro dorsal anterior Emx1 (F). Estructuras de bucle cortical exhibieron una correa fina Unión adherente más apical lateral con la acumulación de N-cadherina (G) y zona occludens proteína 1 (ZO-1; H). microtúbulos Ventricular RGCs redes (manchadas por α-tubulina acetilada, Ac-tina) se extienden desde la apical a la parte basal de las estructuras de bucle (). Proliferación de las células que expresan p-vimentina (p-Vim) se encuentran en la superficie apical. Husos mitóticos se tiñen por Tpx2. mayor aumento imagen representativa de una vertical y un plano de división horizontal se muestran a la derecha (J). (K) análisis de RT-PCR para los factores de transcripción específicos por región en el día 20 de dos conjuntos independientes de organoides derivan de 2 líneas diferentes de iPSC. FB: control cerebro fetal; AB: control del cerebro adulto. Barras de escala, A D 200 μm; E-I 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Epitopo	Dilución
SOX2	1 - 300
PAX6	1 - 500
Otx2	1 - 500
Emx1	1 - 50
N-cadherin	1 - 500
ZO-1	1 - 100
P-vimentina	1 - 1000
Tpx2	1 - 500
Α-tubulina acetilada	1 - 500
Alexa488 anti ms	1 - 1000
Alexa488 anti rb	1 - 1000
Alexa555 anti ms	1 - 1000
Alexa555 anti rb	1 - 1000

Tabla 1: Anticuerpos para control de calidad de organitas al día 20.

Cartilla de	Secuencia de
Otx2 adelante	tgcaggggttcttctgtgat
Otx2 inversa	agggtcagagcaattgacca
FoxG1 adelante	ccctcccatttctgtacgttt
FoxG1 inversa	ctggcggctcttagagat
Emx1 adelante	agacgcaggtgaaggtgtgg
Emx1 inversa	caggcaggcaggctctcc
FoxA2 adelante	ccaccaccaaccccacaaaatg
FoxA2 inversa	tgcaacaccgtctccccaaagt
Pax5 adelante	aggatgccgctgatggagtac
Pax5 inversa	tggaggagtgaatcagcttgg
HoxB2 adelante	tttagccgttcgcttagagg
HoxB2 inversa	cggatagctggagacaggag
HoxA4 adelante	ttcagcaaaatgccctctct
HoxA4 inversa	taggccagctccacagttct
HoxB4 adelante	acacccgctaacaaatgagg
HoxB4 inversa	gcacgaaagatgagggagag
HoxB6 adelante	gaactgaggagcggactcac
HoxB6 inversa	ctgggatcagggagtcttca
de 18 hacia adelante	ttccttggaccggcgcaag
18 años atrás	gccgcatcgccggtcgg

Tabla 2: Cartilla y secuencias de la cartilla para el perfil de expresión génica.

Discusión

Organoides cerebro representan una poderosa herramienta para el estudio de cerebro humano desarrollo en vitro ya que proporcionan los antecedentes de las especies y el complejo arreglo 3D de las células en un contexto de tejido. Con eso, ellos la brecha entre los modelos animales no humanos y técnicas de cultivo de células de humano monocapa bidimensional reduccionista. Sus aplicaciones son, sin embargo, obstaculizadas por la falta de reproducibilidad⁹. Hemos desarrollado un protocolo de organoide de forebrain-tipo, que supera la gran variabilidad de la muestra a la muestra mediante la combinación de la capacidad de auto-organización de iPSC con su receptividad a patrones factores. Específicamente, iPSCs fueron agregados para promover la auto organización y posteriormente inhiben la señalización promover la diferenciación de la corteza dorsal exponiendo las culturas a un BMP (LDN-193189) TGF-ß/SMAD y una TGF-β tipo de inhibidor del receptor (A83-01). Además, se aplicó un compuesto que inhibe la vía de Wnt (IWR) para prevenir la posteriorization. En contraste con los protocolos de organoide cerebral 'intrínseco'¹⁹, que se basan en autoensamblaje sin control externo dando lugar a organoides de cerebro algo heterogéneo y exhibiendo variaciones de lote grande (midiendo la eficiencia de la polarización ectodermo neural formación¹⁵), el protocolo descrito aquí reproducible genera homogénea específica de forebrain organoides de iPSCs humana.

Estos organoides de forebrain-tipo pueden utilizarse para una variedad de aplicaciones tales como estudios de desarrollo neurológico, estudios evolutivos, incluyendo estudios de la función del gene, modelado de la enfermedad y, posiblemente, fines terapéuticos y pruebas de drogas. Sin embargo, el protocolo es más adecuado para examinar los aspectos tempranos del desarrollo cortical humano. Por ejemplo hemos utilizado el organitas prosencéfalo-tipo para examinar aspectos humanos específicos de comportamiento vRGC. Más específicamente, cambios patofisiológicos asociados con una forma severa de lisencefalia, una malformación cortical humana caracterizada por una casi total ausencia de pliegue cortical, se abordó. Sólo ciertos aspectos de esta enfermedad se pueden modelar en ratones como el cerebro de ratón es naturalmente lissencephalic. Al aplicar el sistema organoide a lisencefalia iPSCs derivados del paciente, fiable podríamos recapitular los aspectos humanos específicos de la enfermedad e identificar mecanismos subyacentes. Más específicamente, podríamos demostrar que organoides derivados del paciente muestran una reducción significativa en tamaño causado por un interruptor de simétrica a la división de célula asimétrica de vRGCs. Este interruptor se asoció con alteraciones en la organización de la red de microtúbulos de vRGCs, una alteración de la arquitectura del nicho VZ y altera la expresión de moléculas de adhesión celular, conduce a una activación deteriorada de la N-cadherina/β-catenina señalando el eje¹⁰. Nota: β-catenina-dependiente de la regulación de vRGC modos de división sugirió ser humanos específicos como sobreexpresión de β-catenina en ratones conduce a la expansión de la corteza tangencial y posteriormente cortical plegable²⁰. Así, nuestros datos ponen de relieve que el sistema organoide prosencéfalo representa una herramienta prometedora para el estudio de una manera cuantificable los aspectos humanos específicos de desarrollo cortical temprana en vitro.

Un desafío importante para el futuro es mantener la homogeneidad de los organoides en períodos de tiempo prolongado para obtener fenotipos neuronales más maduros. Esto puede realizarse por uno o más de las siguientes: cultivo de organoides en un biorreactor sistema¹⁴, aplicación flotante andamios¹⁵, complementar el medio de diferenciación con crecimiento neural, o factores de supervivencia neuronal. Finalmente, un aumento controlado en la complejidad del cerebro podría lograrse mediante la fusión de los organoides prosencéfalo-tipo con organoides cerebral de diferente identidad regional^21,22.

Tomados en conjunto, el protocolo de organoide de forebrain-tipo presentado aquí ofrece una herramienta confiable y fácilmente aplicable para la generación de estructuras corticales temprano in vitro. El protocolo da lugar a tejido cortical temprano altamente homogéneo a través de múltiples líneas de iPSC y puede ser utilizado para generar confiablemente especiales de tejido cortical. Así, el sistema es especialmente adecuado para aplicaciones que requieren un alto grado de homogeneidad y reproducibilidad como modelo de enfermedad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
A83-01	StemGent	130-106-274	500 nM
B27 Suplemento	Gibco	17504-044	1 a 100
Extracto de membrana basal (por ejemplo, Geltrex)	Gibco	A14132-02
Monofosfato de adenosina cíclico (AMPc)	Sigma-Aldrich	A9501	0,15 µ g/mL
Reactivo de disociación celular (TrypLE Express)	Gibco	12605028
Cámara de recuento p. ej., Fuchs-Rosenthal	Karl Hecht	40449001
D-Glucosa	Carl Roth	HN06.3	0,2 mg/mL
DMEM-F12 L-Glutamina	Gibco	11320033
Moldes de inclusión (Tissue-Tek Cryomold)	Sakura Finetek	4565
Ácido etilendiaminotetraacético	Sigma-Aldrich	E6511	0,5 mM
Gelantin	Sigma-Aldrich	G1890
Heparina	Sigma-Aldrich	H3149-25KU	10 ug/mL
Inhibidor de la respuesta WNT (IWR-1)	Enzo Life Science	BML-WN103-0005	10 ug/mL
Insulina	Sigma-Aldrich	91077C	2.5 µ g/mL
Medio IPSC para cultivos monocapa (Pluripro)	Sistemas de guiado celular	MK01
L-alanil-L-glutamina (GlutaMax)	Gibco	35050038	1%
Placas de 6 cm de baja adherencia	Labomedic	2081646L
Placas de baja adherencia de 10 cm	Labomedic	2081646O
LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-104-171	180 nM
N2 Suplemento	Gibco	17502-048	1 a 200
Aminoácidos no esenciales	Gibco	11140035	0,50%
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148	4,00%
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	14190144
Película de parafina plástica (Parafilm)	MARCA GMBH + CO KG	701606
Inhibidor de ROCK Y-27632	Sistemas de guiado	celular SM02-100	5 µ M o 50 y micro; M
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S7903
Tubos 15 mL	Corning Life Sciences	734-0451
Portaobjetos de microscopio, p. ej., Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio	Thermo Scientific	4951PLUS4
Cultivo de tejidos placa de 6 pocillos	Falcon	734-0019
Cultivo de tejidos placa de 24 pocillos	Falcon	734-0949
Tinción azul de tripán	Gibco	15250-061
Placa de recubrimiento de lipodicción de 96 pocillos de ligamiento ultra bajo A-U96	Amsbio	AMS.51011610
Anticuerpos
Sox2	R& D Systems	MAB2018
Pax6	Covance	PRB-278P-100
Otx2	R& D Systems	ab9566
Emx1	Sigma	HPA006421
N-cadherina	BD 610921
ZO-1	Life Tech	61-7300
P-Vimentin	Biozol	D076-3
Tpx2	Novus Biologicals	NB500-179
Acetilado &alfa;-tubulina	NEB/CS	5335
Alexa488 anti ms	Invitrogen	A11001
Alexa488 anti rb	Invitrogen	A11008
Alexa555 anti ms	Invitrogen	A21424
Alexa555 anti rb	Invitrogen	A21429