Este protocolo describe un sistema flexible y de bajo costo para la medición de ambulación de ratón en un ensayo de actividad de campo abierto. Mostramos que un paseo de 6 minutos el análisis basado en este sistema detecta una disminución del movimiento voluntario en ratones mdx y distingue con precisión mejora en un rescate de músculo-específica de estos animales.
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Artículo de método
Un análisis Simple y de bajo costo para la medición de actividad en modelos de ratón de la Distrofia Muscular
En este artículo
Resumen
Resumen
Medición de los resultados funcionales en el tratamiento de la distrofia muscular es un aspecto esencial de la prueba preclínica. La evaluación de la actividad voluntaria en modelos de ratón es un ensayo de actividad no invasiva y reproducible que es directamente análoga a las medidas del paciente deambulación como la prueba de caminata de 6 minutos y relacionados con partituras de movilidad. Muchos métodos comunes para las pruebas de velocidad de deambulación de ratón y la distancia se basan en la prueba de campo abierto, donde la libre circulación de los animales dentro de una arena se mide con el tiempo. Una desventaja importante de este enfoque es que el software comercial y equipo para el seguimiento de movimiento de alta resolución es caro y requiera transferencia de ratones a instalaciones especializadas para la prueba. Aquí, describimos un sistema de bajo costo, basado en video para medir la ambulación de ratón que utiliza software libre y código abierto. Mediante este protocolo, demostramos eso deambulación voluntaria en el modelo de ratón mdx de la distrofina es nulo por distrofia muscular de Duchenne (DMD) está disminuida en relación con la actividad de tipo ratón. En mdx ratones expresan el transgén utrophin, estos déficits de actividad no se observan y la distancia total recorrida es indistinguible de los ratones de tipo salvaje. Este método es eficaz para medir cambios en deambulación voluntaria asociada a patología distrófica y proporciona una plataforma versátil que puede adaptarse fácilmente a la configuración de diversas investigaciones.
Introducción
Mediciones fiables y reproducibles de la función muscular son fundamentales para evaluar la eficacia de las terapias potenciales para DMD. DMD es un trastorno genético causado por mutaciones en el gene del dystrophin, conduce a una debilidad muscular progresiva, pérdida de la ambulación y eventual insuficiencia cardiorrespiratoria. El modelo animal más ampliamente utilizado de la DMD es el ratón mdx de la distrofina es nulo. Una batería de pruebas funcionales han surgido como ensayos de rutina para evaluar la progresión de la enfermedad en el ratón mdx así como en modelos animales similares de otras distrofias y miopatías. Comúnmente usado en vivo ensayos incluyen mediciones de fuerza de agarre del forelimb, alambre colgante tiempo, máximo de rotarod, hasta la extenuación durante la actividad de ejecución y el motor de caminadora seguimiento. Ha habido un esfuerzo sustancial en el campo para estandarizar las pruebas, con el objetivo de reducir la variabilidad entre estudios preclínicos y aumentando las posibilidades de traslación de la terapéutica probada en ratones de1,2.
Una categoría importante de ensayos preclínicos es la medida del movimiento voluntario, un parámetro que se altera con frecuencia en modelos murinos de la distrofia muscular. Esto generalmente es probada por ensayos basados en el monitoreo de actividades de campo abierto y puede evaluar horizontal (a pie) o movimientos verticales (cría) en un transcurso de minutos u horas2,3,4. Varios estudios han demostrado movimiento voluntario a modificarse en ratones mdx , especialmente después del ejercicio, y estas medidas han demostrado ser sensibles a la progresión de enfermedad y tratamiento de drogas. Una limitación importante en la realización de estos ensayos es la necesidad de equipos especializados, de alto costo. Aquí, se presenta un método de bajo costo que paseo de ratón utilizando los recursos disponibles.
La distancia de caminata de 6 minutos es una medida comúnmente utilizada como una herramienta de evaluación clínica en los individuos con distrofia muscular de Duchenne5,6. Modificaciones de esta medida se han utilizado para evaluar los resultados en modelos animales de Duchenne, de ratones mdx 7 como la distrofia muscular (GRMD) de golden retriever perros8. En este estudio, se registra movimiento voluntario campo abierto en 6 minutos inmediatamente después de un reto de ejercicio suave. Distancia de deambulación entonces se calculó utilizando software libre de código abierto para medir movimiento horizontal en el tiempo.
La principal ventaja de este método es que animales pueden probarse en una variedad de ajustes sin necesidad de equipo especializado o alto costo comercial del software para el análisis. Un aspecto importante de este análisis es que puede realizarse en un entorno de laboratorio básicos sin necesidad de mover o transferir ratones de vivero a una instalación base especializado. El protocolo de seguimiento de video descrito aquí es muy adecuado para la evaluación de la deambulación durante períodos relativamente cortos puede detectar diferencias de actividad entre ratones de tipo salvaje y mdx , como revelan mejoría funcional en un rescate modelo de DMD.
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Protocolo
Los métodos descritos aquí fueron aprobados por el institucional Animal cuidado y uso de la Universidad de California, Los Ángeles. Tipo salvaje (C57BL/6J) y ratones mdx (C57Bl/10ScSn fondo) fueron compradas de una fuente comercial. MDX: ratones utrophin-Tg fueron un regalo de James Ervasti, con permiso de Kay Davies y se mantuvieron en el fondo de mdx . Paseo ensayos fueron realizados en ratones machos a los 6 meses de edad. Ratones se mantuvieron en el vivero de Ciencias de la vida de Terasaki siguiendo las pautas establecidas por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en la Universidad de California, Los Ángeles (aprobación #2000-029-43) y aprobación de estos estudios fue otorgada por el Garantía de Bienestar Animal de UCLA (homologación Nº A3196-01).
1. preparación de la cámara
- Realizar recolección de datos en un cuarto tranquilo, de temperatura controlada en un tiempo constante de día9. Realizar los ensayos cegados al genotipo y al tratamiento del ratón sometido a prueba.
- Adaptarse a cualquier sistema de cámara de campo abierto para este análisis.
Nota: En este estudio, utilizamos una cámara de grabación de bajo costo y fácilmente transportable de un basurero grande. La arena del campo abierto es una bandeja en una jaula o plataforma elevada. - Coloque la cámara sobre una malla de alambre por encima de la cámara para grabar a través de la arena completa.
- Limpiar la cámara de grabación con desinfectante antes de cada ensayo.
2. poner el protocolo y recopilación de datos
- Opcionalmente, inmediatamente antes de la grabación de la actividad, desafiar a cada ratón con un protocolo de activación muscular.
Nota: Esto es opcional pero se recomienda en experimentos con ratones mdx .- Permitir que el ratón para agarrar la barra de tracción de un medidor de fuerza digital y tire suavemente hacia atrás hasta que se suelte la palanca de tracción. Repita este procedimiento cinco veces por juicio.
- Tensión de pico registro (N) para cada ensayo.
Nota: Además de servir como un reto de ejercicio para el análisis de la deambulación, la fuerza ejercida por el animal durante este ensayo de fuerza de agarre puede utilizarse como una medida de resultado funcional adicional2,10. - Realizar cinco ensayos total para cada ratón con 1 min de descanso entre cada ensayo.
- Inmediatamente después de la prueba de fuerza de agarre u otro protocolo de ejercicios, colocar el ratón en la cámara de la actividad.
- Iniciar la grabación del video del movimiento del ratón en el ámbito de la cámara. Permitir que el ratón para explorar libremente durante 6 minutos.
- Detener la grabación en el minuto 6 y retomar el ratón de su jaula casera.
3. vídeo análisis
- Opcionalmente, preparar el vídeo para el análisis mediante la reducción de la velocidad de fotogramas. Con el fin de reducir la velocidad de fotogramas para el análisis de seguimiento, utilice el siguiente protocolo en un software (por ejemplo, iMovie o programa similar) de edición de vídeo para diezmar la tasa de fotogramas de vídeo por un factor de 2.
Nota: Dependiendo de la longitud y velocidad de fotogramas del vídeo, puede ser útil reducir la tasa de fotogramas de vídeo antes del análisis. En este estudio, el video fue grabado a 30 cuadros/s (6 min de grabación, total aproximadamente 10.800 Marcos).- Cargar el video en el software.
- En el menú de 'Speed', seleccione ' velocidad: rápido ' y ajustar la velocidad a 2 x.
- Exportar el vídeo diezmado en formato. MP4 para el seguimiento de análisis.
- Abrir el vídeo para el análisis en el programa de software. Ajustar la calibración para la grabación mediante la herramienta de línea de video. Trace una línea a lo largo de un lado de la cámara. Haga clic derecho sobre la línea y seleccionar "Calibrate medida..." Introduzca el tamaño real del lado de cámara en centímetros.
- Para empezar el seguimiento semiautomático de la posición del ratón, haga clic en el cursor 'move'.
A partir del marco inicial en el vídeo, haga clic derecho sobre el punto de hacer un seguimiento; el punto de seguimiento está marcado con un círculo azul.
Nota: En el presente estudio, la posición de cada animal fue localizada trazando la base de la cola. - Avanzar el cuadro haciendo clic en la flecha derecha del teclado; el punto de seguimiento debe mover automáticamente basado en la posición de la base de la cola.
- Si la posición de seguimiento no está alineada con el punto de interés en un determinado marco, alinear manualmente el círculo azul a la base de la cola.
Nota: Dependiendo de la calidad del vídeo y la velocidad del ratón, el seguimiento puede requerir niveles variables de entrada del usuario para mantener la alineación con el punto de interés. La ruta del ratón debe avanzar a través del curso del vídeo.
- Si la posición de seguimiento no está alineada con el punto de interés en un determinado marco, alinear manualmente el círculo azul a la base de la cola.
- Al seguimiento del video completo es completo, guardar la superposición video y localización. Exportar los datos posicionales del trazado al seleccionar "Exportar a hoja de cálculo".
4. Análisis de datos
- Abra los datos posicionales en un programa de hoja de cálculo. El software de análisis de movimiento informa de que la X, Y coordinar la posición del ratón en cada fotograma.
- Para calcular la distancia recorrida por el marco, utilice la siguiente ecuación (donde es la posición en el marco de una x1, y1 y marco dos es x2, y2):
Nota: Distancia acumulada con el tiempo se puede calcular mediante la adición de la distancia recorrida entre cada fotograma.
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Resultados
Variaciones de la prueba de campo abierto han demostrado ser un método eficaz para comprobar la progresión de la enfermedad en modelos de distrofia muscular. Aquí, demostramos un video versátil seguimiento método para el análisis de movimiento del ratón bidimensional usando equipos de grabación disponible y software de código abierto (figura 1A–B). En concordancia con los resultados registrados de ensayos similares, nos muest...
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Discusión
El ensayo de campo abierto proporciona una manera eficaz y no invasivo para probar la función de motor en modelos de ratón de la enfermedad del músculo, y las variaciones de este ensayo pueden servir como una medida de extremo valor para los estudios preclínicos. Una limitación importante con este tipo de análisis es la accesibilidad limitada y alto costo de los sistemas de monitoreo de actividad. En este estudio, se demuestra un sistema de bajo costo para el análisis de la actividad de campo abierto que pueden generar r...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los institutos nacionales de salud [AR048179 R01 y R01 HL126204 R.C.W, AR059033 T32 y F32 AR069469to E.M.G] y los E.e.u.u. de la Asociación de la Distrofia Muscular [274143 y 416364 a casos].
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cámara de video | Apple Inc. | ME553LL/A | Para grabar vídeo de deambulación, iPhone 5S Plus (o equivalente) |
| Software Kinovea (versión 0.8.15) | Asociación | Software de análisis de vídeo de código abierto. Descarga gratuita, compatible para PC (versión 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (versión 10.0.6) | Apple Inc. | Se puede utilizar cualquier software similar para reducir la velocidad de fotogramas de vídeo (opcional) | |
| Cubo de basura redondo negro de 32 galones Roughneck (cámara de campo abierto) | Rubbermaid | # 1778013 | Cualquier sistema de cámara de campo abierto se puede adaptar para la grabación. Este estudio utiliza una cámara de grabación construida a partir de una bandeja sobre una plataforma, en el fondo de un gran contenedor de basura. |
| Bandeja de plástico blanco Avant 15" de ancho x 10" de profundidad x 1.45" de alto (cámara de campo abierto) | US Acrylic, LLC | Cualquier sistema de cámara de campo abierto se puede adaptar para la grabación. Este estudio utiliza una cámara de grabación construida a partir de una bandeja sobre una plataforma, en el fondo de un gran contenedor de basura. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Ratones machos de 6 meses |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Ratones machos de 6 meses |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Regalo de James Ervasti, con permiso de Kay Davies | Ratones machos de 6 meses |
Referencias
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785(2014).
- Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
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- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
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- Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).
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Reimpresiones y permisos
