Óptima preparación de formol fijada muestras para péptidos basados en matriz asistida por láser de desorción/ionización espectrometría de masas de flujos de trabajo

Resumen

Este protocolo describe un método reproducible y confiable para la preparación a base de la sublimación de formalina fijada destinado para el spectrometry total de la proyección de imagen del tejido.

Resumen

El uso de desorción/ionización láser asistida por matriz, espectrometría de masas (MALDI MSI) la proyección de imagen se expandió rápidamente, ya que esta técnica analiza una serie de biomoléculas de las drogas y los lípidos a N-glycans. Aunque existen diversas técnicas de preparación de muestras, detección de péptidos del formaldehído conservada los tejidos sigue siendo uno de los retos más difíciles para este tipo de análisis de espectrometría de masa. Por esta razón, hemos creado y optimizado una robusta metodología que conserva la información espacial contenida en la muestra, mientras que el mayor número de péptidos ionizables. También hemos destinado para lograrlo de una manera simple y rentable, eliminando así posibles error de sesgo o preparación, que puede ocurrir cuando utiliza instrumentación. El resultado final es un protocolo reproducible y de bajo costo.

Introducción

Espectrometría de masas del desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI MSI) la proyección de imagen ha sido empleada como una técnica de imagen basado en dos décadas^1,2, análisis de una gama de biomoléculas, incluyendo: lípidos³, péptidos^{2 ,4}, proteínas^2,5, metabolitos^6,7, N-glycans⁸y moléculas sintéticas como drogas terapéuticas^9,

Protocolo

PRECAUCIÓN: Todas las precauciones de seguridad se deben seguir al realizar este procedimiento, incluyendo el uso de equipos de protección personal (EPP) (por ejemplo, batas de laboratorio, guantes de nitrilo, gafas de seguridad, etc.)

1. preparación de reactivos y equipos

1. Preparación de soluciones
   1. Para preparar 500 mL de líquido de Carnoy, mezcle 100% etanol (EtOH), cloroformo y ácido acético glacial en un 6:3:1 cociente de v/v/v en un frasco limpio de Schott.
   2. Para hacer líquido nitrocelulosa (NC), disolver la membrana NC (comúnmente utilizada en el borrar occidental) en ac....

Resultados

Si se siguen correctamente, este protocolo produce imágenes que representan claramente la morfología gruesa del tejido sin cualquier arañazos u otras deformaciones (figura 1). La validación ideal para una preparación de la ejecución correcta de la muestra, es la capacidad de distinguir diferentes estructuras físicas cambiando la molécula ser visto (figura 2).

Es una bue.......

Discusión

Este protocolo fue diseñado para maximizar la generación de especies moleculares ionizables eliminando deslocalización de analitos. Los factores clave incluyen usando el mismo principio primordial al aplicar la matriz, digerir la muestra o recristalización después de la sublimación²⁴; es decir, que una incluso deposición de vapor, de matriz o de lo contrario, debe ser creado y mantenido. Pipeteo lavados solvente para recristalización y la digestión, uniformemente por debajo de la muestra, impide c.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Criomicrótomo	Leica	CM3050	Para la preparación y sección de tejido.
Portaobjetos de microscopio de óxido de indio y estaño	Bruker	8237001	Para la preparación y sección de tejido.
Tarros Coplin	Sigma Aldrich	S5516	Para la preparación y sección de tejidos.
Olla a presión	Kambrook	KPR620BSS	Para la preparación y sección de tejidos.
Sublimador	Chem Glass	NA	Para el procedimiento de sublimación. Similar en diseño a la CG-3038, sin embargo, fue hecha a medida
Baño de arena	NA	NA	Para el procedimiento de sublimación. Arena de río de grado fino contenida en papel de aluminio plegado procedente del exterior, no de ninguna empresa específica
Placa de Petri de vidrio	Sigma Aldrich CLS70165100		Para el procedimiento de sublimación.
Bomba de vacío	NA	NA	Para el procedimiento de sublimación. Obtenido como pieza de repuesto de un viejo espectrómetro de masas
Trampa fría	Chem Glass	CG-4510-02	para procedimiento de sublimación.
Placa caliente	John Morris	EW-15956-32.	Para el procedimiento de sublimación.
Placa de Petri de plástico	Sigma Aldrich Z717223		Para el procedimiento de sublimación.
37 y s° Incubadora C,	NA	NA	Para el procedimiento de sublimación. No aplicable, la incubadora no es estéril y tiene más de 30 años
Papel secante	Sigma Aldrich	P7796	Para el procedimiento de sublimación.
Nitrocelulosa	Sigma Aldrich	N8395	Para el lavado de correderas.
Acetona	Sigma Aldrich	650501	Para el lavado de portaobjetos.
Xileno	Sigma Aldrich 214736		Para el lavado de portaobjetos.
100% EtOH	Sigma Aldrich	1.02428	Para el lavado de correderas.
70% EtOH	Sigma Aldrich	NA	Para el lavado de correderas. Hecho en laboratorio con un 95% de etanol de stock
Cloroformo	Sigma Aldrich	C2432	Para el lavado de portaobjetos.
Ácido Acético Glacial	Sigma Aldrich	ARK2183	Para el lavado de portaobjetos.
Tris HCL pH 8.8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	Para la escisión proteolítica. Polvo hecho a 1M seguido de equilibrio con 32% de HCl a PH 8.8
Milli Q Agua ultrapura	Sigma Aldrich	NA	Para la escisión proteolítica. Purificación realizada internamente por el sistema de purificación de agua sartorio
Bircarbonato de amonio	Sigma Aldrich	A6141	Para la escisión proteolítica.
Tripsina	Sigma Aldrich	T0303	Para la escisión proteolítica.
CHCA Matrix	Sigma Aldrich	C2020	Para recristalización.
Acetonitrilo	Sigma Aldrich	1.00029	Para la recristalización.
Ácido trifluoroacético (TFA)	Sigma Aldrich	302031	Para la recristalización.

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