Un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos In Vitro

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para producir en masa las células murinas de silenciamiento génico NK usando un sistema de diferenciación libre de alimentador para estudios mecanísticos in vitro e in vivo.

Resumen

Natural killer (NK) las células pertenecen al sistema inmune innato y son una defensa inmune de primera línea contra el cáncer; sin embargo, se suprimen en el microambiente del tumor y el mecanismo subyacente es todavía desconocido. La falta de una fuente constante y confiable de las células NK limita el progreso de la investigación de la inmunidad de la célula NK. Aquí, Divulgamos un sistema en vitro que puede proporcionar alta calidad y la cantidad de médula ósea murina las células NK en una condición libre de alimentador. Más importante aún, demostramos que con éxito mediada por siRNA silenciamiento inhibe la maduración de la célula NK E4bp4 dependientes mediante el uso de este sistema. Así, esta novela en vitro NK célula diferenciando el sistema es una solución de biomaterial para la investigación de la inmunidad.

Introducción

La progresión del cáncer depende en gran medida de la tumor microambiente^1,2, incluyendo immunocytes derivados de host, por ejemplo, las células NK. Varios estudios demostraron que las células NK intratumoral están negativamente correlacionadas con la progresión de tumor^3,4. Además, los estudios clínicos demostraron que la terapia adoptiva con células NK es una posible estrategia para cáncer^5,6,7,8,

Protocolo

El protocolo para la obtención y diferenciación NK médula ósea células (BM-NK) se basa en métodos previamente publicados^20,21,22. Todos los procedimientos con los ratones han sido aprobados por el Animal ética Experimental Comité (AEEC) en la Universidad China de Hong Kong.

1. preparación del medio condicional OP9

1. Cultura de la línea de celular del estroma murino OP9 en alfa-MEM que contiene 20% FBS, 100 U/mL de penicilina G y estreptomicina 100 μg/mL, a 37 ° C en una atmósfera humidificada de aire/CO₂ (95%: 5%).
   1. Contar....

Resultados

Resultados representativos se obtienen siguiendo el protocolo descrito. Las células de suspensión total de la médula se cultivaron bajo el sistema de diferenciación alimentador-libre durante 11 días; se observó aumento significativo en la tasa de proliferación por día 7 en comparación con el número de células totales en el día 0 (figura 1A). Las células NK maduras con alto cociente nuclear a citoplasmática y citoplasma rico en gránulos morfol.......

Discusión

En el presente trabajo, hemos descrito un nuevo método para la producción de células NK murinas derivadas de médula ósea in vitro. El alimentador de la célula en el sistema original^21,22 es substituido con éxito por el medio condicionado de OP9 células, que aumenta en gran medida la estabilidad del sistema de diferenciación. Además, el sistema puede producir alta cantidad y pureza de NK madura las células para en vitro como en vivo ensa.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Línea celular OP9	ATCC	ATCC® CRL-2749&comercio;
MEM α, sin nucleósidos	Gibco	22561021
Suero fetal bovino	Gibco 10500064
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
Murina recombinante IL-7	PEPROTECH	217-17
Murina recombinante SCF	PEPROTECH	250-03
Murina recombinante Flt3-Ligando	PEPROTECH	250-31L
Recombinante Murino IL-2	PEPROTECH	212-12
Lipofectamin RNAiMAX Reactivo de Transfección	Invitrogen	1377815
Tampón de fijación IC	eBioscience	00-8222-49
Tampón de tinción por citometría de flujo	eBioscience	00-4222-26
anti-ratón conjugado con PE CD244	eBioscience	12-2441-83
Anti-ratón conjugado con Cy3 NKp46	Bioss	bs-2417R-cy3
Control sin sentido (NC)	Ribobio	siN05815122147
siRNA contra ratón E4BP4 mRNA	Ribobio	N/A	5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& primo;