Un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos In Vitro

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para producir en masa las células murinas de silenciamiento génico NK usando un sistema de diferenciación libre de alimentador para estudios mecanísticos in vitro e in vivo.

Resumen

Natural killer (NK) las células pertenecen al sistema inmune innato y son una defensa inmune de primera línea contra el cáncer; sin embargo, se suprimen en el microambiente del tumor y el mecanismo subyacente es todavía desconocido. La falta de una fuente constante y confiable de las células NK limita el progreso de la investigación de la inmunidad de la célula NK. Aquí, Divulgamos un sistema en vitro que puede proporcionar alta calidad y la cantidad de médula ósea murina las células NK en una condición libre de alimentador. Más importante aún, demostramos que con éxito mediada por siRNA silenciamiento inhibe la maduración de la célula NK E4bp4 dependientes mediante el uso de este sistema. Así, esta novela en vitro NK célula diferenciando el sistema es una solución de biomaterial para la investigación de la inmunidad.

Introducción

La progresión del cáncer depende en gran medida de la tumor microambiente^1,2, incluyendo immunocytes derivados de host, por ejemplo, las células NK. Varios estudios demostraron que las células NK intratumoral están negativamente correlacionadas con la progresión de tumor^3,4. Además, los estudios clínicos demostraron que la terapia adoptiva con células NK es una posible estrategia para cáncer^5,6,7,8,9. Inmunoterapia de cáncer basado en la célula NK fue sugerida recientemente como una opción terapéutica para tumores sólidos, pero existen desafíos debido a la secreción de citocinas inmunosupresoras y downregulation de la activación de ligandos en el microambiente de tumores sólidos ^10,11. Transformación de factor de crecimiento β (TGF-β) se ha sugerido para desempeñar un papel represivo en la carcinogénesis, pero paradójicamente las células cancerosas también producen TGF-β1 para apoyar el desarrollo de tumor^{12,13,14 , 15}. señalización de TGF-β puede suprimir la actividad citolítica de las células NK a través de la abajo-regulación de la respuesta de interferón y CD16 mediada por interferón-gamma (IFN-γ) producción en vitro^{16,17, 18}.

Aunque interrupción de señalización de TGF-β en el microambiente del tumor puede ser una forma para eliminar el cáncer, bloqueando totalmente la señalización de TGF-β causará enfermedades autoinmunes debido a su función antiinflamatoria, según lo evidenciado por el desarrollo de efectos secundarios adversos incluyendo la inflamación sistémica, defectos cardiovasculares y autoinmunidad en ratones modelos¹⁹. Por lo tanto, comprender el mecanismo de trabajo de inmunosupresión mediada por el TGF-β conducirá a la identificación de una diana terapéutica accesible para tratar el cáncer.

Para dilucidar los eventos moleculares necesarios para el desarrollo de las células NK, Williams et al. estableció un sistema in vitro para diferenciar células madre hematopoyéticas de médula ósea murina en NK células²⁰. Este sistema facilita en gran medida el estudio mecanicista del desarrollo de las células NK, incluyendo la identificación de nuevos progenitores de las células NK²¹. Sin embargo, los progenitores de médula ósea se deben cultivar en el sistema con el apoyo de las células stromal OP9 como un alimentador capa^20,21, y esta población celular heterogénea limita en gran medida el uso adicional de alterar gen herramientas (p. ej., silenciamiento génico mediado por siRNA) específicamente aplicada a las células NK diferenciadoras.

Aquí, describimos un sistema libre de alimentación que ha sido desarrollado por más modificar el sistema en vitro de Williams et al²⁰. En nuestro sistema, las células stromal alimentador de OP9 no están obligatorio, y en su lugar OP9 medio condicional se utiliza sin afectar a la diferenciación de las células NK en vitroy recientemente nos llevan a descubrir que el TGF-β es capaz de promover la progresión del cáncer a través de suprimir el desarrollo de las células NK E4bp4 dependientes del microambiente tumoral del²². Este novedoso sistema con éxito proporciona un método libre de antecedentes para dilucidar el mecanismo molecular del desarrollo de las células NK en condiciones específicas (p. ej., alta TGF-β1, mediada por siRNA silenciamiento, etcetera.) en vitro.

Protocolo

El protocolo para la obtención y diferenciación NK médula ósea células (BM-NK) se basa en métodos previamente publicados^20,21,22. Todos los procedimientos con los ratones han sido aprobados por el Animal ética Experimental Comité (AEEC) en la Universidad China de Hong Kong.

1. preparación del medio condicional OP9

1. Cultura de la línea de celular del estroma murino OP9 en alfa-MEM que contiene 20% FBS, 100 U/mL de penicilina G y estreptomicina 100 μg/mL, a 37 ° C en una atmósfera humidificada de aire/CO₂ (95%: 5%).
   1. Contar las células con un hemocitómetro, luego semilla 2 x 10⁶ células OP9 a cada frasco de cultivo de 75 cm² con 15 mL de medio. Cultivo de 48 h.
   2. Cuando la cultura llega a 80% de confluencia, lavar el matraz con 10 mL de PBS y añadir 20 mL de llano medio alfa-MEM (sin antibióticos y FBS) por frasco.
2. Recoger medio OP9 condición del frasco de cultivo a las 24 h, limpieza de restos celulares con 0.25 μm filtro de polyethersulfone (PES) y conservar a 4 ° C (dentro de 2 semanas de uso).

2. aislamiento de células de médula ósea de ratón

1. Eutanasia el ratón C57BL/6J 12 semanas de edad con una sobredosis de compuesto (100 mg/kg, inyección intraperitoneal). Confirman muerte por la falta de respiración, luego recoger los huesos de fémur con un corte de cuchillo quirúrgico en las uniones entre los huesos y retirar los músculos restantes con la hoja rascado suave.
2. Colocar los huesos en un tubo de centrífuga de 50 mL que contiene alfa-MEM estéril enfriado y luego realice los siguientes pasos en un gabinete de bioseguridad.
3. Deseche el medio alfa-MEM y enjuague los huesos con etanol al 70% durante 30 s.
4. Lavar los huesos con PBS estéril helado dos veces para limpiar el etanol restante.
5. Transferencia de los huesos en un mortero que contenga 5 mL de PBS helado y suavemente fragmentan los huesos con un mortero (no les pulverizar).
6. Agite los huesos suavemente agitando la mano del mortero para liberar las células de médula ósea en el PBS. Recoger las células de la médula ósea que contiene PBS en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mL.
7. Repita el paso 2.6 para cuatro veces hasta que los fragmentos de hueso sólido blanco en color.
8. Centrifugar el tubo a 465 x g durante 5 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
9. Resuspender el precipitado con 18 mL de agua destilada estéril y dejar reposar durante 30 s para eliminar las células de sangre rojas.
10. Añadir 2 mL de helado 10 X PBS para detener la reacción, luego filtrar la mezcla por un colador de celular de 70 μm para eliminar los eritrocitos sometidos a lisis.
11. Centrifugar el tubo a 465 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado con 20 mL de PBS helado.
12. Lavar las células repetir paso 2.11 una segunda vez.
13. Transferir el precipitado de células en un 100 mm estériles caja Petri con 10 mL de medio condicional OP9 de paso 1.2 suplementado con 20% FBS y una mezcla de 0,5 ng/mL murino IL-7, 30 ng/mL ratón SCF y 100 U/mL flt3L murino.
14. Incubar la placa a 37 ° C con 5% CO₂ para 2 h. transferencia las células sueltas en un nuevo contenedor de cultivo a una densidad de 5 x 10⁵ células viables/mL (conteo de células por hemocitómetro con exclusión azul de tripano) con la misma fórmula medio como en el paso 2.13 e incubar a 37 ° C con 5% CO₂.
15. El día 4, cambio la condición de la cultura al medio condicional OP9 había suplementado con 20% FBS y 2.000 U/mL de IL-2 murino.
16. Refrescar el medio de cultivo cada 3 días; células NK maduras pueden ser obtenidas por día 7 y calificadas como en sección 4.

3. mediada por siRNA Gene Silencing de diferenciación de las células de NK

1. Mezcla preparada de antemano del siRNA o absurdo control (NC) con un agente de transfección según el manual del producto.
2. Realizar paso 3.1 en cualquier momento desde el día 0.
3. Agregar los 50 nM de siRNA o mezcla de NC a las células de paso 2.14.
4. Repita el paso 3.1 en cada refresco mediano (p. ej., día 0, 4 y 7) hasta el punto final experimental.

4. Análisis de la diferenciación de las células NK mediante citometría de flujo

1. En un momento apropiado recoger la suspensión de diferenciar las células y lavar con PBS helado.
2. Fijar las células con buffer de fijación celular según el manual del producto.
3. Lavar las células fijas con PBS helado y luego resuspender 1 x 10⁶ células en 100 μl de tampón de tinción de citometría flujo con Cy3-conjugado anti-ratón NKp46 PE-conjugado anti-ratón CD244 anticuerpos y en una relación de dilución de 1: 100.
4. Mancha de la muestra en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 h.
5. Resuspender las muestras teñidas con 300 μL de PBS, luego adquirir datos FACS y analizar con Cytobank plataforma²⁰ (http://cytobank.org/).

Resultados

Resultados representativos se obtienen siguiendo el protocolo descrito. Las células de suspensión total de la médula se cultivaron bajo el sistema de diferenciación alimentador-libre durante 11 días; se observó aumento significativo en la tasa de proliferación por día 7 en comparación con el número de células totales en el día 0 (figura 1A). Las células NK maduras con alto cociente nuclear a citoplasmática y citoplasma rico en gránulos morfol...

Discusión

En el presente trabajo, hemos descrito un nuevo método para la producción de células NK murinas derivadas de médula ósea in vitro. El alimentador de la célula en el sistema original^21,22 es substituido con éxito por el medio condicionado de OP9 células, que aumenta en gran medida la estabilidad del sistema de diferenciación. Además, el sistema puede producir alta cantidad y pureza de NK madura las células para en vitro como en vivo ensa...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Línea celular OP9	ATCC	ATCC® CRL-2749&comercio;
MEM α, sin nucleósidos	Gibco	22561021
Suero fetal bovino	Gibco 10500064
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
Murina recombinante IL-7	PEPROTECH	217-17
Murina recombinante SCF	PEPROTECH	250-03
Murina recombinante Flt3-Ligando	PEPROTECH	250-31L
Recombinante Murino IL-2	PEPROTECH	212-12
Lipofectamin RNAiMAX Reactivo de Transfección	Invitrogen	1377815
Tampón de fijación IC	eBioscience	00-8222-49
Tampón de tinción por citometría de flujo	eBioscience	00-4222-26
anti-ratón conjugado con PE CD244	eBioscience	12-2441-83
Anti-ratón conjugado con Cy3 NKp46	Bioss	bs-2417R-cy3
Control sin sentido (NC)	Ribobio	siN05815122147
siRNA contra ratón E4BP4 mRNA	Ribobio	N/A	5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& primo;