Uso del traste de una sola molécula a estudiar la correlación de las interacciones proteína

Markus Götz; Philipp Wortmann; Sonja Schmid; Thorsten Hugel

doi:10.3791/56896

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Artículo de método

Uso del traste de una sola molécula a estudiar la correlación de las interacciones proteína

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DOI:

10.3791/56896

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30 de enero de 2018

Markus Götz¹ , Philipp Wortmann¹ , Sonja Schmid¹^,² , Thorsten Hugel¹

¹Institute of Physical Chemistry, University of Freiburg, ²Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para obtener datos smFRET tricolor y su análisis con un conjunto 3D modelo de Markov ocultos. Con este enfoque, los científicos pueden extraer información cinética de sistemas complejos de la proteína, incluyendo cooperatividad o interacción correlacionadas.

Resumen

Transferencia de energía de resonancia de una sola molécula Förster (smFRET) se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada biofísica para estudiar la dinámica de las biomoléculas. Para muchas máquinas moleculares en las proteínas de una célula tienen que actuar junto con socios de la interacción en un ciclo funcional para cumplir con su tarea. La extensión de dos colores en multicolor smFRET permite sondear simultáneamente más de una interacción o cambio conformacional. Esto no sólo añade una nueva dimensión a los experimentos smFRET pero también ofrece la posibilidad única para estudiar directamente la secuencia de acontecimientos y detectar interacciones correlacionadas cuando se utiliza una muestra inmovilizada y una fluorescencia de la reflexión interna total microscopio (TIRFM). Por lo tanto, smFRET multicolor es una herramienta versátil para el estudio de complejos biomoleculares en términos cuantitativos y en un detalle previamente inalcanzable.

Aquí, demostramos cómo superar los problemas especiales de varios colores smFRET experimentos con proteínas. Presentamos protocolos detallados para la obtención de los datos y para extraer información cinética. Esto incluye criterios de selección de la traza, separación del estado y la recuperación de las trayectorias de estado de los datos de ruido utilizando un conjunto 3D modelo oculto de Markov (HMM). En comparación con otros métodos, la información cinética no se recupera de los histogramas de tiempo de permanencia pero directamente en el HMM. El marco de la máxima verosimilitud nos permite evaluar críticamente el modelo cinético y proveer incertidumbres significativas para las tasas.

Al aplicar nuestro método a la proteína de choque térmico 90 (Hsp90), somos capaces de desentrañar el enlace de nucleótidos y los globales cambios conformacionales de la proteína. Esto nos permite observar directamente la cooperatividad entre los dos bolsillos de unión de nucleótido del dimer de Hsp90.

Introducción

Muchas proteínas cumplen con su función en dinámicos complejos con otras moléculas, mediadas por cambios conformacionales y asociaciones transitorias en una amplia gama de escalas temporales¹^,²^,³. Junto a una fuente externa de energía (e.g., ATP) estas interacciones dinámicas pueden conducir a direccionalidad en un ciclo funcional y, en definitiva, mantener el estado estacionario de no equilibrio en una célula, el requisito previo para la vida.

Para entender completamente estas máquinas moleculares, no es suficiente una descripción estátic....