Sola célula microfluídicos análisis de Bacillus subtilis

Resumen

Se presenta un método para el análisis de microfluídica de linajes de células bacterianas individuales utilizando Bacillus subtilis como ejemplo. El método supera las deficiencias de los tradicionales métodos analíticos en Microbiología por lo que permite la observación de cientos de generaciones de celular bajo condiciones de crecimiento muy uniforme y controlable.

Resumen

Tecnología de microfluidos supera muchas de las limitaciones a los métodos analíticos tradicionales en Microbiología. A diferencia de los métodos de cultivo a granel, ofrece resolución de unicelular y observación larga épocas que abarca cientos de generaciones; a diferencia de agarosa microscopia basada en pad, tiene condiciones de crecimiento uniforme que pueden ser bien controladas. Porque el continuo flujo de medio de cultivo aísla las células en un dispositivo de microfluidos de variaciones impredecibles en el ambiente químico local causado por el crecimiento celular y metabolismo, auténticos cambios en la expresión génica y crecimiento celular en respuesta a estímulos específicos pueden observarse con más confianza. Bacillus subtilis se utiliza aquí como una especie bacteriana de modelo para demostrar una "máquina de la madre"-tipo de método para el análisis celular. Mostramos cómo construir vertical un dispositivo de microfluidos, cargar con las células, iniciar la proyección de imagen microscópica y exponer las células a un estímulo por la conmutación de un medio a otro. Un reportero sensible al estrés se utiliza como ejemplo para revelar el tipo de datos que pueden obtenerse por este método. También discutimos brevemente más aplicaciones de este método para otros tipos de experimentos, tales como análisis de esporulación bacteriana.

Introducción

Una de las características más llamativas de la vida en la tierra es su gran resistencia y variedad. Una meta central de la biología molecular es comprender la lógica por la que las células utilizan genes y proteínas para maximizar su crecimiento y aptitud bajo una amplia variedad de condiciones ambientales. Para lograr este objetivo, los científicos deben ser capaces de observar con confianza cómo las células individuales crecen, dividirán y expresan sus genes en un conjunto dado de condiciones, observando cómo las células responden a los cambios posteriores en su entorno. Sin embargo, los métodos analíticos tradicionales en Microbiología tienen limitaciones técnicas....

Protocolo

1. PDMS dispositivo Casting

1. En un ambiente libre de polvo, mezclar polímeros PDMS y agente endurecedor en una proporción 10:1 y desgasificación bajo vacío durante al menos 10 minutos.
2. Coloque un maestro de silicio (o una réplica de epoxy o de poliuretano mismo) en un pedazo de papel de aluminio intacto en una placa de Petri de poliestireno. Vierta la mezcla desgasificada de PDMS sobre el amo a una profundidad de aproximadamente 5 mm. Degas la placa de Petri durante al menos 10 min uso un chorro suave de aire para romper burbujas superficiales.
   Nota: Las dimensiones de los dos niveles del dispositivo utilizado son proporcionadas de los CAD archiv....

Resultados

Acertado de la célula inicial de carga, según lo determinado por microscopía de contraste de fase antes de conectar las tuberías de microfluidos al dispositivo, se consideraría que todos o casi todos los canales laterales de microfluidos que contiene una o más células bacterianas ( Figura 3A). Carga óptima mostraría varias células en cada canal y canales, sin embargo, se llenarán de células debido al crecimiento de la célula durante el período de equilibrio (.......

Discusión

Este protocolo de la microfluídica es flexible en que muchos de los pasos pueden ser modificados para optimizar su uso con una determinada especie o cepa o para un propósito específico. De hecho, en este protocolo hemos hecho modificaciones a la "máquina de la madre" original concepto de⁴ para optimizar su uso con B. subtilis. A menudo, las trincheras que se limitan las células constituyen una característica de una sola capa, mientras que en el presente Protocolo utilizan zanjas de dos ca.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona	Dow Corning	(240)4019862	Esto se conoce como PDMS en el protocolo. Hay 2 componentes que se mezclan en una proporción de 10:1
punzón de biopsia de 0,75 mm	World Precision Instruments	504529
22 x 40 mm N.º 1,5 vidrio de cubierta	VWR	48393 172
Plasma Etch PE-50	Plasma Etch Inc.	PE-50	Instrumento utilizado para unir PDMS a vidrio mediante tratamiento de plasma de oxígeno
Tubo flexible Tygon ID 0.02 ", OD 0.06 "	Saint-Gobain PPL Corp.	AAD04103	Para la parte principal del tubo, p. ej., unido a las agujas Tubo de
silicona, 0,04" de diámetro interior, 0,085" de diámetro exterior	Tubo de silicona estándar HelixMark	60-795-05	Para válvulas de manguito y conexión de unión en Y
Albúmina sérica bovina Sigma-Aldrich		A7906-100G	Utilizado como agente de pasivación
Puntas de pipeta de gel ART (P200)	Molecular BioProducts	2155	Para cargar el dispositivo con medio y celdas
Filtro de jeringa Acrodisc de 32 mm con 5-μ m Membrana Supor	Pall Life Sciences	4560	Para filtrar cultivos antes de la carga del dispositivo
Agujas romas de calibre 21,	McMaster-Carr	75165A681
Y de 1" con lengüetas de la serie 200, tubo de 1/16" de diámetro interior, polipropileno	Nordson Medical	Y210-6005	La empresa es AKA
Microscopio invertido Value Plastics Eclipse Ti-E	Nikon		Esta unidad ha sido descontinuada por el fabricante y es reemplazada por el Ti 2 E.
LB Lennox	Sigma-Aldrich	L3022
Microfuge 18	Beckman Coulter	367160
Bacillus subtilis cepa NCIB3610	Bacillus Genetic Stock Center	3A1	cepa parental de tipo salvaje modificada para su uso en los experimentos mostrados en este protocolo
Horno de convección por gravedad	VWR	414005-106	para el curado de PDMS y horneado ensamblado dispositivos
Scotch-Weld Epoxy Kit	3M	2216 B/A	se puede utilizar para unir una oblea de silicona a una placa de soporte de aluminio
Cinta Scotch Magic, 3/4" de ancho	3M		para limpiar el polvo de los dispositivos PDMS y para colocarlo sobre las características para aumentar la visibilidad (denotado "cinta de oficina" o "cinta adhesiva" en el protocolo)
Microscopio estereoscópico	Nikon	SMZ800N	enumerados aquí como ejemplo; casi cualquier microscopio
estereoscópico hará alcohol isopropílico	Sigma-Aldrich	W292907	Para limpiar la cubierta de vidrio
Bomba de jeringa, 6 canales	New Era Pump Systems Inc.	NE-1600
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	una marca de toallitas sin polvo