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Artículo de método

La leche materna mejora el crecimiento de Enteroids: un modelo Ex Vivo de la proliferación celular

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DOI:

10.3791/56921

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15 de febrero de 2018

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1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, 2Washington University, 3Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe cómo establecer un sistema de cultivo enteroide de ratón neonatal o precoz del intestino humano así como un método eficiente para recoger la leche de ratones.

Resumen

Enteroids intestinales pequeño humanos se derivan de las criptas y cuando se cultiva en un nicho de células madre contienen todos los tipos de células epiteliales. La habilidad de establecer enteroide humanas ex vivo sistemas de cultivo son importantes Fisiopatología intestinal modelo y estudiar las respuestas celulares particulares involucrados. En los últimos años, enteroids de ratones y humanos son se cultiva, los e inclinada lejos para usarlos en varios laboratorios en todo el mundo. Esta plataforma enteroide puede utilizarse para probar los efectos de diversos tratamientos y medicamentos y qué efectos se ejercen sobre los diferentes tipos de células en el intestino. Aquí, un protocolo para el establecimiento de primaria enteroids intestinal pequeño derivados de células madre derivadas de ratones neonatales y proviene de intestino humano prematuro. Por otra parte, este sistema de cultivo enteroide fue utilizado para probar los efectos de la leche materna específica. Leche de ratón puede obtenerse eficientemente usando un extractor de leche humana modificada y leche de ratón expresa entonces puede ser utilizada para experimentos de investigación adicionales. Ahora nos demuestran los efectos de ratón expresado, humano, y leche materna de donante en el crecimiento y la proliferación de las enteroids derivadas de ratones neonatales o intestino humano prematuro.

Introducción

La enterocolitis necrotizante (NEC) es la principal causa de muerte por enfermedades gastrointestinales en los niños prematuros, que afecta a casi 1 en 10 bebés nacidos antes de las 29 semanas de gestación1,2,3. La mitad de los niños con el progreso de NEC para la forma más severa, donde la supervivencia es sólo 10-30%4,5. En los Estados Unidos, un estimado 2 billones USD al año se gastan tratando a niños con NEC6,7, sin embargo, la tasa de supervivencia ni terapia ha cambiado en los últimos 30 años. La patogenia de la NEC se caracteriza por lesiones intestinales y alteración mucosa curación8,9,10,11, sin embargo, las vías de señalización que conduce a una exacerbación respuesta inflamatoria y los mecanismos para revertir la inflamación permanecen incompleto entendidos.

La administración de leche humana se ha encontrado que la estrategia solamente protección contra NEC para recién nacidos prematuros. Previamente hemos demostrado que la leche materna protege contra el desarrollo de NEC mediante la inhibición de lo receptores inmunes innatas peaje-como el receptor 4 (TLR4) en el epitelio intestinal vía receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE) señalización vía11. La suplementación de la leche materna a un fórmula experimental de NEC atenúa la respuesta inflamatoria en NEC según lo demostrado por inhibición de la apoptosis del enterocyte y restauración de la proliferación del enterocyte en una manera que depende de crecimiento epidérmico factor (EGF) y EGFR11. En otro estudio, se demostró que el nitrato, otro componente de la leche materna, contribuye a su naturaleza protectora modulando la perfusión intestinal, en comparación con fórmula infantil, que carece de nitrato y puede contribuir a la mayor frecuencia de NEC en fórmula alimentó a niños de12,13. Otros compuestos presentes en la leche materna que han demostrado para estar implicado en la protección contra el NEC son oligosacáridos de leche humana, L-arginina, glutamina y lactoferrina14,15,16, 1718,de,19. Estos elementos beneficiosos de la leche materna revelan la necesidad de su uso en la prevención de ECN, pero también subrayan la importancia de estudiar los mecanismos de señalización de vías y efectos celulares implicados en cómo la leche materna es mediar la protección contra el NEC .

En orden para otro estudio las propiedades protectoras de la leche materna en un modelo murino de NEC, hemos desarrollado una técnica novedosa, fácil de usar por que ratón puede extraerse leche materna de una presa anestesia mediante un pecho humano eléctrico bomba11,12 . Esta estrategia de adquirir leche de ratón es ventajosa, no sólo porque los extractores de leche humana son fácilmente disponibles y eficaces en la adquisición de la leche materna, sino también porque este método permite el análisis de leche de mama específicos. Como resultado, pueden comparar los efectos de la leche materna de ratón con los de la leche materna humana expresada como pasteurizada leche humana de donante de un banco de leche en modelos específicos. Esta técnica permite el estudio de los componentes de la leche materna en relación con su contribución a la prevención de NEC. Otros investigadores han desarrollado métodos de extracción de leche materna, sin embargo, estas técnicas son manuales y requieren típicamente más de un laboratorio miembro20,21,22. Aquí se presenta una técnica fácil que puede ser utilizada mediante la modificación de un extractor de leche eléctrico humano para recoger la leche de un ratón. Esta técnica puede aplicarse también a otras especies.

Para interrogar adecuadamente las vías de señalización involucradas con NEC, modelo de los sistemas es necesarios para evaluar todos los tipos de células diferentes a ser afectados en el proceso de la enfermedad. Aquí, discutimos una tal sistema modelo - enteroids - y su establecimiento del intestino humano y ratón. Enteroids intestinales humanos (HIEs) proporcionan en particular promesa significativa, ya que ofrecen un modelo humano innovador, genéticamente diversas ex vivo para ayudar en el estudio de procesos fisiopatológicos que ocurren en el tracto gastrointestinal 23. Enteroids se han encontrado para ser cultivadas a largo plazo y puede ser congelados para su posterior uso23, y a diferencia de los organoides Intestinal humano (HIOs), cuyos cultivos se desarrollan de células madre pluripotentes inducible, enteroids son generados a partir de células madre dentro de las criptas intestinales aislados24. Enteroids requieren menos mantenimiento, puede ser infectado rápidamente25y fácilmente se puede establecer desde las criptas intestinales se diferencian más que HIOs23. Por lo tanto, HIEs ofrecen muchas ventajas sobre las técnicas existentes porque puede ser desarrollados para cada región propiedades compositivas y funcionales del epitelio gastrointestinal humano23. El uso de enteroids es una opción altamente efectiva cuando se necesita un modelo humano del intestino, con apego a las limitaciones de cada región y facilidad de uso. Aquí se demuestra la técnica de aislamiento y mantenimiento de enteroids intestinal pequeño derivado de la célula de vástago primario de ratones y humanos prematuros.

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Protocolo

Todos los procedimientos animales en este estudio fueron aprobados por la Universidad de Washington en St. Louis institucional Animal cuidado uso Comité (protocolo 20160187) o atención Animal institucional de la Universidad de Pittsburgh y uso Comité (protocolo 14103918). Intestino fetal humano en menos de 24 semanas de gestación se obtuvo siguiendo las directrices de contratación de Universidad de Pittsburgh anatómica del tejido después de la aprobación de la Junta de revisión institucional (protocolo PRO14100537) de la Universidad de Pittsburgh salud Ciencias Banco de tejidos a través de un sistema de intermediario honesto. Anónima la leche materna o leche materna de donantes pasteurizada se obtuvo con una dispensa del consentimiento de la Universidad de Pittsburgh Junta de revisión institucional.

1. cripta aislamiento y establecimiento de Enteroids de ratones neonatales o intestino humano prematuro

  1. Preparación de medios de comunicación
    Nota: Los medios de comunicación deben estar preparados en la campana el día antes de aislamiento de la cripta.
    1. Preparar medios de cultivo L 1,11. Comenzar con 1 L de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L glucosa y L-glutamina y añadir suero bovino Fetal (FBS) (concentración final 10%), 11 mL insulina estéril penicilina-estreptomicina (concentración final 1%) y 1,1 mL (final de 110 mL concentración 0,1%).
    2. Preparar 500 mL de PBS-antibiótico una mezcla. Comenzar con 500 mL 1 x solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS) con 10% FBS y añadir 5 mL de gentamicina (concentración final 1%), 1 mL (concentración final 0,2%), la anfotericina B y 5 mL de penicilina-estreptomicina (concentración final 1%).
    3. Prepare 30 mL Media de interrupción celular #1. Primero prepare 30 mL de medio de cultivo. Añadir 600 μl 0.5 M dihidratada del ácido (EDTA) (concentración final 10 mM), 300 μL (concentración final 1%) de gentamicina y 60 μL de anfotericina B (concentración final 0,2%).
    4. Prepare 30 mL Media de interrupción celular #2. Primero prepare 30 mL de medio de cultivo. Añadir 300 μL 0.5m EDTA (concentración final 5 mM), 300 μL (concentración final 1%) de gentamicina y 60 μL de anfotericina B (concentración final 0,2%).
    5. Preparar medios de cultivo 50 mL cripta sin factores de crecimiento. Medir 33,4 mL 1 x avanzado DMEM/F-12 y añadir 10 mL de SFB (concentración final 20%).
      1. Añadir 500 μl penicilina-estreptomicina (concentración final 1%), 500 μl (concentración final 1%), de L-glutamina 500 μl gentamicina (concentración final 1%), 100 μl (concentración final 0,2%), la anfotericina B 2,5 μL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane ácido sulfónico (HEPES) (concentración final 0,05 mM), 500 μl 100 mM N-acetilcisteína (concentración final 1 mM), 500 μl 100 x N-2 suplemento 1 mL 50 x suplemento libre de suero (por ejemplo, B-27) menos vitamina A y 500 μL 1 mM 100 x Y-27632.
    6. Preparar medios de cultivo 1 mL cripta con factores de crecimiento. En primer lugar preparar 1 mL de la cripta los medios de cultivo sin la factores de crecimiento. Añadir 2,5 μl 40 μg/mL Wnt3a (concentración final 100 ng/mL), 1 μl 100 μg/mL Noggin (concentración final 100 ng/mL), 2 μl 250 μg/mL R-Spondin (concentración final de 500 ng/mL) y 0,5 μl 100 μg/mL EGF (concentración final 50 ng/mL).
  2. Aislamiento de la cripta
    1. Lugar solubilizado Extracto de membrana del sótano (véase Tabla de materiales) en el hielo se descongele antes de empezar.
      Nota: Mantenga la membrana del sótano en hielo o se polimerice.
    2. En cumplimiento del protocolo institucional cuidado Animal y el Comité de uso de ratones más de 14 días de edad, eutanasia ratones con dos métodos de eutanasia con el segundo siendo un procedimiento físico para asegurar la muerte.
      Nota: Para los ratones menos de 14 días de edad, degollación es el procedimiento estándar con unas tijeras.
    3. Usando tijeras y pinzas, haga una incisión vertical hacia abajo de la línea media del abdomen, a través de la piel y el peritoneo, para toda la longitud del abdomen. Suprimir el intestino desde el estómago al intestino ciego con tijeras y retire el mesenterio con fórceps.
      Nota: Dos semanas de edad machos y hembras C57BL/6J ratón cachorros, cada pesaje g 5.5-7, fueron utilizados para el aislamiento de la cripta. Cualquier edad o tamaño del ratón puede utilizarse para el aislamiento de la cripta.
    4. Para preparar el intestino recién cosechado para el aislamiento de la cripta, posición del intestino recto y corte el intestino longitudinalmente a lo largo de toda su longitud con unas tijeras.
      Nota: Ratón y el intestino humano pueden ser preparados del mismo modo.
    5. Limpiar heces de intestino agitando suavemente el intestino ida y vuelta en un plato de Petri llenas de mezcla de PBS-antibiótico con unas pinzas.
    6. Añadir 30 mL de células interrupción medios #1 en un tubo cónico de 50 mL. Corte el intestino en trozos de longitud 0.5 cm directamente en el tubo. Fijar el tubo en un cubo de hielo y agitar suavemente el vibrador a velocidad más baja durante 15 minutos.
    7. Mientras que los tejidos se encuentran en la coctelera, obtener placas de 24 o 48 bien para crecer criptas si las enteroids se van a utilizar para el aislamiento de proteínas, RNA y DNA. Uso cámara de pozo 8 diapositivas creciendo criptas si los enteroids se van a utilizar para todo Monte proyección de imagen confocal.
    8. En la campana, añadir 15 μl de la membrana basal a la parte inferior de cada pocillo de la placa de la pozo 24 o 48. Si utiliza diapositivas cámara, añadir 9 μl de membrana del sótano en la parte inferior de cada cámara.
      Nota: Ajustar el volumen de la membrana basal según el tamaño de la placa si es necesario.
    9. Se extendió rápidamente la membrana del sótano con la punta de la pipeta para que la membrana del sótano forma una capa delgada en la parte inferior del pozo. Coloque la placa a 37 ° C en incubadora durante 30 min permitir que la membrana del sótano polimerizar.
      Nota: Las criptas no se fije si la membrana del sótano no es una fina capa o membrana basal contiene burbujas de aire.
    10. Después de 15 min en un agitador, el tejido del filtro a través de un tamiz de 100 μm. Deseche el flujo a través.
    11. Añadir 30 mL celular alteración Media #2 a un nuevo tubo cónico de 50 mL. Quitar tejido de filtro y agregar al tubo.
    12. Fijar el tubo en un cubo de hielo y agitar suavemente el vibrador a velocidad más baja durante 15 minutos.
    13. Después de 15 minutos en el agitador, filtro de tejido a través de un tamiz de 100 μm. Mantener el flujo a través de en este paso, en el caso de rendimiento es bajo en pasos posteriores.
      Nota: Todo flujo a través de los tubos deberá ser mantenida en hielo.
    14. Añadir 15 mL DMEM con 4,5 g/L glucosa y L-glutamina a un nuevo tubo cónico de 50 mL. Quitar tejido de filtro y agregar al tubo. Vigorosamente agite el tubo con la mano por 10 filtro s. a través de un tamiz de 100 μm y recoger el flujo a través. Repita hasta que el flujo a través de contiene no partículas.
    15. En la campana, filtrar el flujo a través del paso anterior en un nuevo tubo cónico de 50 mL con 70 μm tamices de tejido de ratón o 100 μm tamices de tejido humano.
      Nota: Tienen filtros adicionales en modo de espera y Vierta lentamente como filtros estorbarán con escombros.
    16. Centrifugar el tubo a 200 x g por 8 min a 4 ° C y lugar directamente en un cubo de hielo en la campana. Quite el sobrenadante con una pipeta sin perturbar el pellet. Resuspender el precipitado con la cantidad total de la cripta los medios de cultivo sin la factores de crecimiento.
      Nota: Las criptas enriquecidas son la capa de 'arena' de la pelotilla. Bien, cada uno requiere 250 μl del medio de cultivo sin factores crecimiento de cripta.
  3. Establecimiento de enteroids
    1. Placa de la mezcla de medios de comunicación de cripta directamente sobre la membrana basal.
    2. Compruebe las criptas con un microscopio para garantizar proceso de aislamiento fue exitoso.
      Nota: Las células y bolas de células deseadas. Aproximadamente 100 criptas individuales se platean por pozo.
    3. Incubar la placa a 37 ° C durante 3 horas permitir que las criptas que se adhieren a la membrana del sótano.
      Nota: La incubación es con la cripta medios de cultivo sin la factores de crecimiento.
    4. Lentamente retire los medios de comunicación y criptas exceso que no se pudieron adjuntar utilizando una pipeta P-200.
      Nota: No molestes a la membrana basal como las criptas adjuntadas pueden desplazarse.
    5. Lentamente Añadir 250 μl de cripta medios de cultivo con factores del crecimiento a cada pocillo.
      Nota: Para 24, placas de 48 pocillos o cámara se desliza, 250 μl del medio de cultivo con factores crecimiento de cripta es suficiente.
    6. Sustituir los medios de comunicación cada 2 días con nueva cripta medios de cultivo con factores de crecimiento para 5 días antes de los tratamientos para permitir el crecimiento y fijación óptima.

2. ratón recolección de leche materna

  1. Separar una presa lactante C57BL/6J en 7-12 días después del parto de sus cachorros durante 6 h antes de la ordeña.
  2. Anestesiar la presa lactante con isoflurano a través de un cono de nariz y administrar una inyección subcutánea de la oxitocina en 0,15 UI/kg de peso corporal. Espere 3 minutos antes de intentar el procedimiento de ordeño.
  3. Limpiar los pezones con etanol al 70% antes del procedimiento de ordeño y dejar secar.
  4. Extraer leche de las tetas una a la vez utilizando un extractor humano eléctrico con tubo de silicona de tamaño para adaptarse a las tetas de ratón en un tubo de colección de 5 mL.
    Nota: Extractores de leche óptima tienen dos ajustes, uno para la velocidad y succión. Es mejor comenzar con la configuración más baja de cada uno y ambos aumente lentamente hasta que se extrae la leche. Idealmente, el rendimiento total será ~ 500 μL - 1 mL de leche de ratón por presa de lactante.
  5. Leche materna inmediatamente alícuotas y conservar a-80 ° C.
    Nota: Evite congelar/descongelar ciclos.
  6. Tratar de enteroids el día 5 con 50 μl/mL de leche de ratón por mL de medio de cultivo con factores de crecimiento de la cripta durante 24 h a 37 ° C.

3. todo montaje coloración de Enteroids

  1. Preparación de los reactivos
    1. Preparación de 16 mL 1 x PBS por 8 pozos.
    2. Preparación de paraformaldehído al de 4% de 2 mL (PFA) de 1 x PBS por 8 pozos.
    3. Preparar 2 mL 0,1% Tritón X-100 en PBS 1 x por 8 pozos.
    4. Preparar 24 mL PBS Tween (SAFT es 0,1% Tween 20 en 1 x PBS) por 8 pozos.
    5. Preparar 2 mL 10% burro normal de suero (NDS) en 0.1% SAFT (10% NDS/SAFT) por 8 pozos.
    6. Preparar 4 mL 1% NDS en 0.1% SAFT (1% NDS/SAFT) por 8 pozos.
  2. Día 1 la coloración
    1. Aspire de tratamientos y lave enteroids con PBS. Añadir 250 μl 4% PFA por pozo. Coloque en el rotador para 1-2 h a 4 ° C. Quitar 4% PFA con pipeta.
    2. Lavar 4 veces con 250 μL/pocillo 1 x PBS. Coloque en el rotador durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
      Nota: Es posible almacenar la placa durante 1-2 días a 4 ° C si es necesario.
    3. Añadir 250 μL/pocillo 0,1% Tritón X-100. Incubar durante 1 h a RT. retirar 0,1% Tritón X-100 con pipeta.
    4. Lavar 4 veces con 250 μL/pocillo 1 x PBS. Colocar en el rotor durante 15 min a TA.
    5. Añadir 250 μL/pocillo 10% NDS/SAFT. Incubar durante 45 minutos en quitar RT. 10% NDS/SAFT con pipeta.
    6. Añadir 250 μL/pocillo primaria del anticuerpo, diluido 1/250 en 1% NDS/SAFT e incubar toda la noche a 4 ° C.
      Nota: La dilución óptima del anticuerpo varía según el fabricante.
  3. Día 2 la coloración
    1. Lavado al menos 5 veces 4-5 h con 250 μL/pocillo de SAFT. Coloque en el rotador a 4 º C entre cada lavado.
    2. Añadir 250 μl/pozo secundario anticuerpo, diluido 1/1.000 en 1% NDS/SAFT. Envolver la placa en hoja e incubar durante una noche a 4 ° C.
  4. Día 3 la coloración
    1. Añadir 250 μL/pocillo nuclear mancha 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) durante 15 minutos.
      Nota: Mantenga la placa en la oscuridad.
    2. Lavar 6 veces con 250 μL/pocillo de SAFT. Coloque en el rotador durante 10 min a 4 º C entre cada lavado.
    3. Cubreobjetos de montaje en cámara Deslice con el montaje de los medios de comunicación.
    4. Tomar imágenes con una de 40 X microscopio confocal objetiva y hacer igualmente en un editor de gráficos de trama (véase Tabla de materiales).

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Resultados

Primero intentamos investigar ya sea leche materna o leche materna de donantes pasteurizada tuvo un efecto en pequeños enteroids intestinal. De hecho, la leche materna y leche materna de donante aumentan el crecimiento de ratón neonatal (figura 1A) y enteroids derivados humanos prematuros (figura 1B).

Puesto que la leche materna humana aumentó el crecimiento de pequeños...

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Discusión

El epitelio intestinal se compone de muchos subtipos celulares que son responsables de proporcionar la defensa del huésped frente a patógenos, mantener la integridad de la barrera del intestino y pueden ser violados en la patogenia de varias enfermedades. Mientras que los modelos animales pueden recapitular algunas facetas de la enfermedad, el modelo ex vivo de enteroids derivadas del intestino de los ratones y los seres humanos proporciona una plataforma para probar efectos de varios tratamientos. La importanci...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada para revelar y sin conflictos de interés.

Agradecimientos

MG es apoyado por becas K08DK101608 y R03DK111473 de los institutos nacionales de salud, marzo de Dimes Foundation Grant no. 5-FY17-79, los niños Discovery Institute de Washington University de St. Louis los niños Hospital y el Departamento de Pediatría de la Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL es apoyado por R01DK104946 (PI: Silverman), Hospital descubrimiento Institute de Washington University infantil de St. Louis los niños.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L de glucosa y L-glutaminaSuero12-604F
(FBS)Gibco26140-079
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122
Humulina N (insulina)Eli Lilly And Company0002-8315
1x Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco ( DPBS)Sigma-AldrichD8537
GentamicinaGibco15750-060
Anfotericina BGibco15290-026
0,5 M Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), pH 8,0Invitrogen15575-020
1x Advanced DMEM/F-12Invitrogen12634-028
200 mM L-GlutaminaGibco25030-081
1 M N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano ácido sulfónico (HEPES)Sigma-AldrichH3537
N-acetilcisteínaSigma-AldrichA9165
100x N-2 SuplementoGibco17502-048
50x B-27 Suplemento Menos Vitamina AGibco08-0085SA
100x Inhibidor de ROCK Y-27632, DihidrocloruroSigma-AldrichY0503
Ratón Recombinante Wnt3a ProteínaR& D Systems1324-WN
Murine NogginPeproTech250-38
Ratón recombinante R-Spondin 1R& D Systems3474-RS
Factor de crecimiento epidérmico murino recombinante (EGF)PeproTech315-09
Matrigel Factor de crecimiento Matriz de membrana basal reducida Corning356231
35 x 10 mm Placa de Petri de cultivo celularEppendorf0030700112
placa de cultivo celular de 24 pocillosEppendorf0030722116
célula de 48 pocillos placa de cultivoEppendorf0030723112
8 pocillos Nunc Lab-Tek II Sistema de portaobjetos de cámaraThermo Scientific154534
50 mL Tubo cónicoCorning352070
100 μ M Filtro de células estérilesFisher Scientific22-363-549
70 μ M Colador de células estérilesFisher Scientific22-363-548
1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.2Invitrogen20012-027
16% Paraformaldehído (PFA)Ciencias de la microscopía electrónica15710
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Burro normal Suero (NDS)Sigma-AldrichD9663
4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato (DAPI)InvitrogenD1306
Microscopio Cubierta de vidrioFisher Scientific12-544-D
Microscopio confocal Leica TCS SP8 XLeica MicrosystemsN/A
Photoshop CS6Adobe SystemsN/A
18 G Aguja de 1,5 pulgadasBecton Dickinson305196
IsofluranoSigma-Aldrich792632
OxitocinaSigma-AldrichO3251
Extractor de leche eléctrico doble humanoLansinoh044677530163
5 mL Tubo de ensayo de fondo redondoCorning352058
Tapones de goma FreyScientific 560761
Ki67 AnticuerpoAbcamAB15580
humano Mki67 cebador F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'Tecnologíasde ADN integradasN/A
fetal bovino Lonza

Referencias

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