Este protocolo describe cómo establecer un sistema de cultivo enteroide de ratón neonatal o precoz del intestino humano así como un método eficiente para recoger la leche de ratones.
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Artículo de método
La leche materna mejora el crecimiento de Enteroids: un modelo Ex Vivo de la proliferación celular
En este artículo
Resumen
Resumen
Enteroids intestinales pequeño humanos se derivan de las criptas y cuando se cultiva en un nicho de células madre contienen todos los tipos de células epiteliales. La habilidad de establecer enteroide humanas ex vivo sistemas de cultivo son importantes Fisiopatología intestinal modelo y estudiar las respuestas celulares particulares involucrados. En los últimos años, enteroids de ratones y humanos son se cultiva, los e inclinada lejos para usarlos en varios laboratorios en todo el mundo. Esta plataforma enteroide puede utilizarse para probar los efectos de diversos tratamientos y medicamentos y qué efectos se ejercen sobre los diferentes tipos de células en el intestino. Aquí, un protocolo para el establecimiento de primaria enteroids intestinal pequeño derivados de células madre derivadas de ratones neonatales y proviene de intestino humano prematuro. Por otra parte, este sistema de cultivo enteroide fue utilizado para probar los efectos de la leche materna específica. Leche de ratón puede obtenerse eficientemente usando un extractor de leche humana modificada y leche de ratón expresa entonces puede ser utilizada para experimentos de investigación adicionales. Ahora nos demuestran los efectos de ratón expresado, humano, y leche materna de donante en el crecimiento y la proliferación de las enteroids derivadas de ratones neonatales o intestino humano prematuro.
Introducción
La enterocolitis necrotizante (NEC) es la principal causa de muerte por enfermedades gastrointestinales en los niños prematuros, que afecta a casi 1 en 10 bebés nacidos antes de las 29 semanas de gestación1,2,3. La mitad de los niños con el progreso de NEC para la forma más severa, donde la supervivencia es sólo 10-30%4,5. En los Estados Unidos, un estimado 2 billones USD al año se gastan tratando a niños con NEC6,7, sin embargo, la tasa de supervivencia ni te....
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Protocolo
Todos los procedimientos animales en este estudio fueron aprobados por la Universidad de Washington en St. Louis institucional Animal cuidado uso Comité (protocolo 20160187) o atención Animal institucional de la Universidad de Pittsburgh y uso Comité (protocolo 14103918). Intestino fetal humano en menos de 24 semanas de gestación se obtuvo siguiendo las directrices de contratación de Universidad de Pittsburgh anatómica del tejido después de la aprobación de la Junta de revisión institucional (protocolo PRO14100537) de la Universidad de Pittsburgh salud Ciencias Banco de tejidos a través de un sistema de intermediario honesto. Anónima la leche materna o leche materna d....
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Resultados
Primero intentamos investigar ya sea leche materna o leche materna de donantes pasteurizada tuvo un efecto en pequeños enteroids intestinal. De hecho, la leche materna y leche materna de donante aumentan el crecimiento de ratón neonatal (figura 1A) y enteroids derivados humanos prematuros (figura 1B).
Puesto que la leche materna humana aumentó el crecimiento de pequeños.......
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Discusión
El epitelio intestinal se compone de muchos subtipos celulares que son responsables de proporcionar la defensa del huésped frente a patógenos, mantener la integridad de la barrera del intestino y pueden ser violados en la patogenia de varias enfermedades. Mientras que los modelos animales pueden recapitular algunas facetas de la enfermedad, el modelo ex vivo de enteroids derivadas del intestino de los ratones y los seres humanos proporciona una plataforma para probar efectos de varios tratamientos. La importanci.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada para revelar y sin conflictos de interés.
Agradecimientos
MG es apoyado por becas K08DK101608 y R03DK111473 de los institutos nacionales de salud, marzo de Dimes Foundation Grant no. 5-FY17-79, los niños Discovery Institute de Washington University de St. Louis los niños Hospital y el Departamento de Pediatría de la Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL es apoyado por R01DK104946 (PI: Silverman), Hospital descubrimiento Institute de Washington University infantil de St. Louis los niños.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L de glucosa y L-glutamina | Suero | 12-604F | |
| (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Humulina N (insulina) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco ( DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicina | Gibco | 15750-060 | |
| Anfotericina B | Gibco | 15290-026 | |
| 0,5 M Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), pH 8,0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamina | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano ácido sulfónico (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-acetilcisteína | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Suplemento | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Suplemento Menos Vitamina A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x Inhibidor de ROCK Y-27632, Dihidrocloruro | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Ratón Recombinante Wnt3a Proteína | R& D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Ratón recombinante R-Spondin 1 | R& D Systems | 3474-RS | |
| Factor de crecimiento epidérmico murino recombinante (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Factor de crecimiento Matriz de membrana basal reducida Corning | 356231 | ||
| 35 x 10 mm Placa de Petri de cultivo celular | Eppendorf | 0030700112 | |
| placa de cultivo celular de 24 pocillos | Eppendorf | 0030722116 | |
| célula de 48 pocillos placa de cultivo | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8 pocillos Nunc Lab-Tek II Sistema de portaobjetos de cámara | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Tubo cónico | Corning | 352070 | |
| 100 μ M Filtro de células estériles | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μ M Colador de células estériles | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehído (PFA) | Ciencias de la microscopía electrónica | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Burro normal Suero (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscopio Cubierta de vidrio | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Microscopio confocal Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G Aguja de 1,5 pulgadas | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurano | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxitocina | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Extractor de leche eléctrico doble humano | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Tubo de ensayo de fondo redondo | Corning | 352058 | |
| Tapones de goma Frey | Scientific 560761 | ||
| Ki67 Anticuerpo | Abcam | AB15580 | |
| humano Mki67 cebador F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'Tecnologías | de ADN integradas | N/A |
Referencias
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts i....
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Reimpresiones y permisos
